单分子知识点..

光漂白(photonic bleaching)是在光照条件下使其发生化学反应或是构象改变,而失去发荧光的特性,就是所谓的漂白.它常用于生物体内扩散速率常数的测定. 光漂白抗性就是抗光漂白性吧~~我是这么理解的。

下面的是搜索的关于绿色荧光蛋白^_^

·GFP的发光特性

GFP吸收的光谱,最大峰值为395nm(紫外),并有一个峰值为470nm的副峰(蓝光);发射光谱最大峰值为509nm(绿光),并带有峰值为540nm的侧峰(Shouder). GFP的光谱特性与荧光素异硫氰酸盐(FITC)很相似,因此为荧光素FITC设计的荧光显微镜滤光片组合同样适用于GFP观察.

尽管450～490nm(蓝光)是GFP的副吸收峰,但由于长波能量低,细胞忍受能力强,因此更适合于活体检测.

GFP的性质

GFP荧光极其稳定,在激发光照射下,GFP抗光漂白(Photobleaching)能力比荧光素(fluorescein)强,特别在450～490nm蓝光波长下更稳定.

GFP需要在氧化状态下产生荧光,强还原剂能使GFP转变为非荧光形式,但一旦重新暴露在空气或氧气中,GFP荧光便立即得到恢复.而一些弱还原剂并不影响GFP 荧光.中度氧化剂对GFP荧光影响也不大,如生物材料的固定,脱水剂戊二酸或甲醛等.

GFP融合蛋白的荧光灵敏度远比荧光素标记的荧光抗体高,抗光漂白能力强,因

此更适用于定量测定与分析.

但因为GFP不是酶,荧光信号没有酶学放大效果,因此GFP灵敏度可能低于某些酶类报告蛋白.

由于GFP荧光是生物细胞的自主功能,荧光的产生不需要任何外源反应底物,因此GFP作为一种广泛应用的活体报告蛋白,其作用是任何其它酶类报告蛋白无法比拟的.

常用的显微技术

共聚焦显微镜

原理：共焦显微镜[Confocal Laser Scanning Microscope(CLSM或LSCM)]在反射光的光路上加上了一块半反半透镜(Beam Splitter)，将已经通过透镜的反射光折向其它方向，在其焦点上有一个带有针孔（Pinhole）的挡板，小孔就位于焦点处，挡板后面是一个光电倍增管（photomultiplier tube，PMT）。可以想像，探测光焦点前后的反射光通过这一套共焦系统，必不能聚焦到小孔上，会被挡板挡住。于是光度计测量的就是焦点处的反射光强度。其意义是：通过移动透镜系统可以对一个半透明的物体进行三维扫描。共聚焦显微镜能提供无比精确的三维成像，以及对亚细胞结构和动力学过程的精准测试。

传统的光学显微镜使用的是场光源，标本上每一点的图像都会受到邻近点的衍射或散射光的干扰；激光扫描共聚焦显微镜利用激光束经照明针孔形成点光源对标本内焦平面的每一点扫描，标本上的被照射点，在探测针孔处成像，由探测针孔后的光电倍增管（PMT）或冷电耦器件（cCCD）逐点或逐线接收，迅速在计算机监视器屏幕上形成荧光图像。照明针

孔与探测针孔相对于物镜焦平面是共轭的，焦平面上的点同时聚焦于照明针孔和发射针孔，焦平面以外的点不会在探测针孔处成像，这样得到的共聚焦图像是标本的光学横断面，克服了普通显微镜图像模糊的缺点。

共聚焦激光扫描显微（英文Confocal laser scanning microscopy，CLSM，LCSM）是一项高分辨率三维光学成像技术[1]。主要特点在于其光学分层能力，即获得特定深度下焦点内的图像。图像通过逐点采集，以及之后的计算机重构而成。因此它可以重建拓扑结构复杂的物体。对于不透明样品，可以进行表面作图，而对于透明样品，则可以进行内部结构成像。内部结构成像上，图像质量在单台显微镜中就可以得到极大的提升，因为来自样品不同深度的信息未被重叠。传统显微镜能“看”到所有能被光投身到地方，而对于共聚焦显微镜，只有焦点处的信息被采集。实际上共聚焦激光扫描显微是通过对焦点深度的控制和高度限制来实现的。

共聚焦的原理早在1957年就由美国科学家马文·明斯基注册为专利[2]，但实际上经过三十年的时间及相应专用激光器的发展，直至1980年代末这项技术才成为标准技术。1978年，托马斯和克里斯托弗·克莱默设计出一套激光扫描程序[3]。该程序采用激光聚焦的方式逐点扫描物体三维表面，并通过类似于扫描电镜的计算机化手段生成图像。这一共聚焦激光扫描显微设计首次结合了激光扫描方法和荧光标记的生物样品三维探测。接下来的数十年内，共聚焦荧光显微发展成一项成熟的技术，尤其受益于阿姆斯特丹大学（University of Amsterdam），来自海德堡的欧洲分子生物实验室（European Molecular Biology Laboratory）及其业界伙伴的共同努力。

全内反射荧光显微镜（total internal reflection fluorescent microscope，TIRFM），利用光线全反射后在介质另一面产生衰逝波的特性，激发荧光分子以观察荧光标定样品的极薄区域，观测的动态范围通常在200nm以下。因为激发光呈指数衰减的特性，只有极靠近全反射面的样本区域会产生荧光反射，大大降低了背景光噪声干扰观测标的，故此项技术广泛应用于细胞表面物质的动态观察。

1概念

全内角反射荧光显微镜（total internal reflection fluorescence microscope，TIRFM），利用光线全反射后在介质另一面产生衰逝波的特性，激发荧光分子以观察荧光标定样品的极薄区域，观测的动态范围通常在200 nm以下。因为激发光呈指数衰减的特性，只有极靠近全反射面的样本区域会产生荧光反射，大大降低了背景光噪声干扰观测标的，能帮助研究者获得高质量的成像质量和可靠的观测数据。故此项技术广泛应用于细胞表面物质的动态观察。

2光学原理

当一束光从光密介质进入光疏介质时，根据斯涅耳定律一部分光会发生折射，而一部分光会发生反射，当入射角度不断增大，折射角也会不断增大，当折射角刚好达到90度时，