双酶切反应
双酶切实验
双酶切概述双酶切反应(Double Digests)1、同步双酶切同步双酶切是一种省时省力的常用方法。
选择能让两种酶同时作用的最佳缓冲液是非常重要的一步。
NEB每一种酶都随酶提供相应的最佳NEBuffer，以保证100%的酶活性。
NEBuffer的组成及内切酶在不同缓冲液中的活性见《内切酶在不同缓冲液里的活性表》及每支酶的说明书。
能在最大程度上保证两种酶活性的缓冲液即可用于双酶切。
由于内切酶在非最佳缓冲液条件下的切割速率会减缓，因此使用时可根据每种酶在非最优缓冲液中的具体活性相应调整酶量和反应时间。
2、分步酶切如果找不到一种可以同时适合两种酶的缓冲液，就只能采用分步酶切。
分步酶切应从反应要求盐浓度低的酶开始，酶切完毕后再调整盐浓度直至满足第二种酶的要求，然后加入第二种酶完成双酶切反应。
3、使用配有特殊缓冲液的酶进行双酶切（图）使用配有特殊缓冲液的酶进行双酶切也不复杂。
在大多数情况下，采用标准缓冲液的酶也能在这些特殊缓冲液中进行酶切。
这保证了对缓冲液有特殊要求的酶也能良好工作。
由于内切酶在非最佳缓冲液中进行酶切反应时，反应速度会减缓，因此需要增加酶量或延长反应时间。
通过《内切酶在不同缓冲液里的活性表》可查看第二种酶在特殊缓冲液相应盐浓度下的作用活性。
双酶切建议缓冲液注：只要其中一种酶需要添加BSA，则应在双酶切反应体系中加入BSA。
BSA不会影响任何内切酶的活性。
注意将甘油的终浓度控制在10%以下，以避免出现星号活性，详见《星号活性》。
可通过增加反应体系的总体积的方法实现这一要求。
某些内切酶的组合不能采用同步双酶切法，只能采用分步法进行双酶切。
上表中这些组合以“se q”标注。
[编辑本段]双酶切的注意事项1、做转化的时候，进行酶连接反应时，注意保持低温状态，因为LIGASE酶很容易降解.为保险起见，一般连接3小时，16度。
2、对含有AMP-RESISTENCE的质粒铺板时，注意加AMP时的温度，温度过高，会使克隆株无法筛选出来.我的方法是培基高温消毒后放在烤箱里，烤箱一般温度为55-60度，然后做的时候拿出来，这样好掌握温度。
连接转化攻略
双酶切连接反应之全攻略双酶切连接反应之全攻略前一阵子一直在做双酶切质粒重组，失败了很多次，不过很快改善了实验方法，用2周重组了14个质粒。
现就自己的体会，结合丁香园战友的宝贵经验，谈一下质粒重组的一些个人经验。
1、回收PCR产物：在进行PCR扩增时候，给引物两端设计好酶切位点，一般说来，限制酶的选择非常重要，尽量选择粘端酶切和那些酶切效率高的限制酶，如BamHI,HindIII,提前看好各公司的双切酶所用公用的BUFFER，以及各酶在公用BUFFER里的效率。
选好酶切位点后，在各个酶的两边加上保护碱基，其原则可参照：/upload/2006/08/13/31219184.pdf。
双酶切时间及其体系：需要强调的是很多人建议酶切过夜，其实完全没有必要，我一般酶切3个小时，其实1个小时已经足够。
应用大体系，如100微升。
纯化问题：纯化PCR产物割胶还是柱式，我推荐柱式，因为割胶手法不准，很容易割下大块的胶，影响纯化效率。
现在的柱式纯化号称可以祛除引物，既然如此，酶切掉的几个碱基肯定也会被纯化掉了。
所以，PCR产物和双酶切产物的纯化均可应用柱式纯化。
我用的是TAKARA的纯化柱试剂盒酶量的问题：以TAKARA的为例，其对1单位酶的定义如下：在50 μl 反应液中，30℃温度下反应1小时，将1 μg 的λDNA完全分解的酶量定义为1个活性单位(U)。
而该酶浓度约为15单位/微升，在除外酶降解的因素外，该酶可分解15μg的DNA，而一般从1-4ml 菌液提出的DNA约为3μg，而PCR纯化后的产物（50体系）约为3μg，所以即便全部加进去，只要纯化的质量好，酶切完全切得动。
2、酶切、回收后的PCR产物与载体的连接摩尔比的计算，很多人凭经验也可以。
但对于初学者从头认真计算则非常有必要。
回收的载体片段：回收的PCR产物片段=1：10，一般取前者0.03pmol，后者取0.3pmol。
pmol为单位的DNA转换为为µg单位的DNA：（X pmoles×长度bp×650）/ 1,000,000 （注：长度bp×650是该双链DNA的分子量）所得数值即为µg,也可以直接用这个公式套.1pmol 1000bp DNA=0.66μg,如载体是5380bp，则0.03pmol为0.03×5.38×0.66=0.106524µg。
双酶切连接反应
【原创】双酶切连接反应之全攻略（原创）双酶切连接反应之全攻略前一阵子一直在做双酶切质粒重组，失败了很多次，不过很快改善了实验方法，用2周重组了14个质粒。
现就自己的体会，结合战友的宝贵经验，谈一下质粒重组的一些个人经验。
1、回收PCR产物：在进行PCR扩增时候，给引物两端设计好酶切位点，一般说来，限制酶的选择非常重要，尽量选择粘端酶切和那些酶切效率高的限制酶，如BamHI,HindIII,提前看好各公司的双切酶所用公用的BUFFER，以及各酶在公用BUFFER里的效率。
选好酶切位点后，在各个酶的两边加上保护碱基，其原则可参照：双酶切时间及其体系：需要强调的是很多人建议酶切过夜，其实完全没有必要，我一般酶切3个小时，其实1个小时已经足够。
应用大体系，如100微升。
纯化问题：纯化PCR产物割胶还是柱式，我推荐柱式，因为割胶手法不准，很容易割下大块的胶，影响纯化效率。
现在的柱式纯化号称可以祛除引物，既然如此，酶切掉的几个碱基肯定也会被纯化掉了。
所以，PCR产物和双酶切产物的纯化均可应用柱式纯化。
我用的是TAKARA的纯化柱试剂盒酶量的问题：以TAKARA的为例，其对1单位酶的定义如下：在50 μl 反应液中，30℃温度下反应1小时，将1 μg 的λDNA完全分解的酶量定义为1个活性单位(U)。
而该酶浓度约为15单位/微升，在除外酶降解的因素外，该酶可分解15μg的DNA，而一般从1-4ml菌液提出的DNA约为3μg，而PCR纯化后的产物（50体系）约为3μg，所以即便全部加进去，只要纯化的质量好，酶切完全切得动。
2、酶切、回收后的PCR产物与载体的连接摩尔比的计算，很多人凭经验也可以。
但对于初学者从头认真计算则非常有必要。
回收的载体片段：回收的PCR产物片段=1：10，一般取前者，后者取。
pmol为单位的DNA转换为为µg单位的DNA：（X pmoles×长度bp×650）/ 1,000,000 （注：长度bp×650是该双链DNA的分子量）所得数值即为µg,也可以直接用这个公式套.1pmol 1000bp DNA=μg,如载体是5380bp，则为××=µg。
双酶切
【原创】双酶切连接反应之全攻略（原创）双酶切连接反应之全攻略前一阵子一直在做双酶切质粒重组，失败了很多次，不过很快改善了实验方法，用2周重组了 14个质粒。
现就自己的体会，结合战友的宝贵经验，谈一下质粒重组的一些个人经验。
1、回收PCR产物：在进行PCR扩增时候，给引物两端设计好酶切位点，一般说来，限制酶的选择非常重要，尽量选择粘端酶切和那些酶切效率高的限制酶，如BamHI,HindIII,提前看好各公司的双切酶所用公用的BUFFER，以及各酶在公用BUFFER里的效率。
选好酶切位点后，在各个酶的两边加上保护碱基，其原则可参照：/upload/2006/08/13/31219184.pdf。
双酶切时间及其体系：需要强调的是很多人建议酶切过夜，其实完全没有必要，我一般酶切3个小时，其实1个小时已经足够。
应用大体系，如100微升。
纯化问题：纯化PCR产物割胶还是柱式，我推荐柱式，因为割胶手法不准，很容易割下大块的胶，影响纯化效率。
现在的柱式纯化号称可以祛除引物，既然如此，酶切掉的几个碱基肯定也会被纯化掉了。
所以，PCR产物和双酶切产物的纯化均可应用柱式纯化。
我用的是TAKARA的纯化柱试剂盒酶量的问题：以TAKARA的为例，其对1单位酶的定义如下：在50 μl 反应液中，30℃温度下反应1小时，将1 μg 的λDNA完全分解的酶量定义为1个活性单位(U)。
而该酶浓度约为15单位/微升，在除外酶降解的因素外，该酶可分解15μg的DNA，而一般从1-4ml菌液提出的 DNA约为3μg，而PCR纯化后的产物（50体系）约为3μg，所以即便全部加进去，只要纯化的质量好，酶切完全切得动。
2、酶切、回收后的PCR产物与载体的连接摩尔比的计算，很多人凭经验也可以。
但对于初学者从头认真计算则非常有必要。
回收的载体片段：回收的PCR产物片段=1：10 ，一般取前者0.03pmol，后者取0.3pmol。
pmol为单位的DNA转换为为µg单位的DNA：（X pmoles×长度bp×650）/ 1,000,000 （注：长度bp×650是该双链DNA的分子量）所得数值即为µg,也可以直接用这个公式套.1pmol 1000bp DNA=0.66μg,如载体是5380bp，则0.03pmol为0.03×5.38×0.66=0.106524µg。
双酶切编辑
2连接反应
3注意事项
1简介编辑双酶切反应(Double Digests)
1、同步双酶切
同步双酶切是一种省时省力的常用方法。选择能让两种酶同时作用的最佳缓冲液是非常重要的一步。NEB每一种酶都随酶提供相应的最佳NEBuffer，以保证100%的酶活性。NEBuffer的组成及内切酶在不同缓冲液中的活性见《内切酶在不同缓冲液里的活性表》及每支酶的说明书。能在最大程度上保证两种酶活性的缓冲液即可用于双酶切。由于内切酶在非最佳缓冲液条件下的切割速率会减缓，因此使用时可根据每种酶在非最优缓冲液中的具体活性相应调整酶量和反应时间。
双酶切建议缓冲液
注：
只要其中一种酶需要添加BSA，则应在双酶切反应体系中加入BSA。BSA不会影响任何内切酶的活性。
注意将甘油的终浓度控制在10%以下，以避免出现星号活性，详见《星号活性》。可通过增加反应体系的总体积的方法实现这一要求。
某些内切酶的组合不能采用同步双酶切法，只能采用分步法进行双酶切。上表中这些组合以“seq”标注。
3、转化：
a、一般转化仅需要加入2μl加入至100μl正常的TOP10感受态细胞中，冰浴放置30分钟。
b、再在水浴中42℃热激一般90～120秒钟后，再在冰中放置3分钟。
c、加入800μl无抗生素培养基，37℃全温振荡摇床培养40分钟。
取100μl涂布平板。一般转化质粒不建议离心涂布（除非感受态效价特别低），
双酶切编辑
做转化的时候，进行酶连接反应时，注意保持低温状态，因为LIGASE酶很容易降解。为保险起见，一般连接3小时，16度；对含有AMP-RESISTENCE的质粒铺板时，注意加AMP时的温度，温度过高，会使克隆株无法筛选出来。我的方法是培基高温消毒后放在烤箱里，烤箱一般温度为55-60度，然后做的时候拿出来，这样好掌握温度。铺板前后注意用吹风机吹干；对照的设立：为验证双酶切是否成功。
双酶切实验
双酶切实验双酶切实验是一种常见的分子生物学技术，旨在通过不同特异性的限制性内切酶对DNA分子进行切割，从而得到指定的DNA序列片段，有助于进一步分析、鉴定和应用DNA分子。
本文将从实验原理、实验材料、实验步骤、实验结果和分析等多方面介绍双酶切实验的具体过程和应用。
一、实验原理双酶切实验是一种分子生物学实验，其基本原理是通过限制性内切酶对DNA分子进行识别和切割，以获取所需的DNA序列片段。
限制性内切酶是一种酶，在特定的识别酶切位点中切割DNA分子，多数限制性内切酶都会切割对称型的序列，并产生黏性末端或平滑末端，这些末端能够用于DNA的连接、克隆或标记等。
双酶切实验是指利用两种或更多不同的限制性内切酶对同一个DNA分子进行切割，从而得到所需的DNA序列片段。
此时，需要将两种内切酶同时进行切割，以确保所需的DNA序列片段能够有效地被切割并分离出来，避免产生假阳性结果。
一般情况下，需要确保两种限制性内切酶不会相互重叠的切割同一段DNA序列，以避免影响实验结果的准确性。
二、实验材料1、DNA样本：需要纯度较高的DNA样本。
2、限制性内切酶：需要两种或多种不同的限制性内切酶。
3、相应的缓冲液和相关酶切盒。
4、电泳仪：实验完成后需要进行电泳检测。
5、夹心式电泳胶：用于制备凝胶板。
6、DNA分子量标准：用于校准电泳结果。
7、琼脂糖：用于制备凝胶板。
8、蒸馏水、乙醇、氯仿等：用于实验样本的获取和处理。
三、实验步骤1、制备DNA样本：需要先采集样本，并通过DNA提取试剂盒等方式获得纯度较高的DNA样本。
2、准备酶切反应体系：根据限制性内切酶的不同特性和酶切反应的需要，分别配置不同的酶切体系，并在冰箱中保存以备实验使用。
3、将DNA溶液与酶切反应体系混合：将DNA溶液与所需的酶切反应体系按比例混合，并进行酶切反应，一般需要保持恒定的温度和酶切时间来确保切割效果。
4、制备凝胶板：通过加热琼脂糖、混合等操作，制备夹心式电泳凝胶板，并在凝胶板中插入电极。
双酶切连接反应之全攻略
【原创】双酶切连接反应之全攻略（原创）双酶切连接反应之全攻略前一阵子一直在做双酶切质粒重组，失败了很多次，不过很快改善了实验方法，用2周重组了 14个质粒。
现就自己的体会，结合战友的宝贵经验，谈一下质粒重组的一些个人经验。
1、回收PCR产物：在进行PCR扩增时候，给引物两端设计好酶切位点，一般说来，限制酶的选择非常重要，尽量选择粘端酶切和那些酶切效率高的限制酶，如BamHI,HindIII,提前看好各公司的双切酶所用公用的BUFFER，以及各酶在公用BUFFER里的效率。
选好酶切位点后，在各个酶的两边加上保护碱基，其原则可参照：/upload/2006/08/13/31219184.pdf。
双酶切时间及其体系：需要强调的是很多人建议酶切过夜，其实完全没有必要，我一般酶切3个小时，其实1个小时已经足够。
应用大体系，如100微升。
纯化问题：纯化PCR产物割胶还是柱式，我推荐柱式，因为割胶手法不准，很容易割下大块的胶，影响纯化效率。
现在的柱式纯化号称可以祛除引物，既然如此，酶切掉的几个碱基肯定也会被纯化掉了。
所以，PCR产物和双酶切产物的纯化均可应用柱式纯化。
我用的是TAKARA的纯化柱试剂盒酶量的问题：以TAKARA的为例，其对1单位酶的定义如下：在50 μl 反应液中，30℃温度下反应1小时，将1 μg 的λDNA 完全分解的酶量定义为1个活性单位(U)。
而该酶浓度约为15单位/微升，在除外酶降解的因素外，该酶可分解15μg的DNA，而一般从1-4ml菌液提出的 DNA约为3μg，而PCR纯化后的产物（50体系）约为3μg，所以即便全部加进去，只要纯化的质量好，酶切完全切得动。
2、酶切、回收后的PCR产物与载体的连接摩尔比的计算，很多人凭经验也可以。
但对于初学者从头认真计算则非常有必要。
回收的载体片段：回收的PCR产物片段=1：10 ，一般取前者0.03pmol，后者取0.3pmol。
pmol为单位的DNA转换为为µg单位的DNA：（X pmoles×长度bp×650）/ 1,000,000 （注：长度bp×650是该双链DNA的分子量）所得数值即为µg,也可以直接用这个公式套.1pmol 1000bp DNA=0.66μg,如载体是5380bp，则0.03pmol为0.03×5.38×0.66=0.106524µg。
双酶切连接反应的注意要点
双酶切连接反应的注意要点双酶切：1、在双酶切载体时如果2个酶切位点靠得很近，必须注意酶切顺序。
因为有的限制性内切酶要求其识别序列的两端至少保留有若干个碱基才能保证酶的有效切割。
有的酶要求识别序列两端有多个碱基的，则必须先切，否则就可能造成酶切失败。
2、回收PCR产物：回收的PCR产物片段=1：10，一般取前者0.03pmol，后者取0.3pmol。
pmol为单位的DNA转换为为?g单位的DNA：（X pmoles×长度bp×650）/ 1,000,000 （注：长度bp×650是该双链DNA的分子量）所得数值即为?g,也可以直接用这个公式套.1pmol 1000bp DNA=0.66μg,如载体是5380bp，则0.03pmol为0.03×5.38×0.66=0.106524?g。
3、双酶切时间及其体系：需要强调的是很多人建议酶切过夜，其实完全没有必要，一般酶切3个小时，对于PCR产物，可以过夜酶切，效果会很好。
酶切体系不宜过大，会影响质粒和酶的碰撞机会，效果降低；质粒量不应该超过酶切要求的最大量，否则酶切不完全，酶的用量控制在1U酶在15-20ul体系中酶解1ugDNA。
4、两种酶切的条件不同时，分别进行两次酶切，切完一个纯化后再切：温度要求不同，先酶切低温要求的，再酶切高温要求的；若盐浓度要求不同，先酶切低盐浓度要求的，再酶切高盐浓度要求的。
5、若质粒是在TE中保存的，TE 中的EDTA可能与酶的激活因子螯合，影响酶切效果，可放大酶切体积或重新浓缩质粒。
6、限制酶的选择非常重要，尽量选择粘端酶切和那些酶切效率高的限制酶，提前看好各公司的双切酶所用公用的BUFFER，以及各酶在公用BUFFER里的效率。
选好酶切位点后，在各个酶的两边加上保护碱基。
7、纯化问题：纯化PCR产物割胶还是柱式，推荐柱式，因为割胶手法不准，很容易割下大块的胶，影响纯化效率。
双酶切连接反应
双酶切连接反应1、回收PCR产物：在进行PCR扩增时候，给引物两端设计好酶切位点，一般说来，限制酶的选择非常重要，尽量选择粘端酶切和那些酶切效率高的限制酶，如BamHI,HindIII,提前看好各公司的双切酶所用公用的BUFFER，以及各酶在公用BUFFER里的效率。
选好酶切位点后，在各个酶的两边加上保护碱基。
双酶切时间及其体系：需要强调的是很多人建议酶切过夜，其实完全没有必要，我一般酶切3个小时，其实1个小时已经足够。
应用大体系，如100微升。
纯化问题：纯化PCR产物割胶还是柱式，我推荐柱式，因为割胶手法不准，很容易割下大块的胶，影响纯化效率。
现在的柱式纯化号称可以祛除引物，既然如此，酶切掉的几个碱基肯定也会被纯化掉了。
所以，PCR产物和双酶切产物的纯化均可应用柱式纯化。
我用的是TAKARA的纯化柱试剂盒酶量的问题：以TAKARA的为例，其对1单位酶的定义如下：在50 μl 反应液中，30℃温度下反应1小时，将1 μg 的λDNA完全分解的酶量定义为1个活性单位(U)。
而该酶浓度约为15单位/微升，在除外酶降解的因素外，该酶可分解15μg的DNA，而一般从1-4ml菌液提出的 DNA约为3μg，而PCR纯化后的产物（50体系）约为3μg，所以即便全部加进去，只要纯化的质量好，酶切完全切得动。
2、酶切、回收后的PCR产物与载体的连接摩尔比的计算，很多人凭经验也可以。
但对于初学者从头认真计算则非常有必要。
回收的载体片段：回收的PCR产物片段=1：10 ，一般取前者0.03pmol，后者取0.3pmol。
pmol为单位的DNA转换为为μg单位的DNA：（X pmoles×长度bp×650）/ 1,000,000 （注：长度bp ×650是该双链DNA的分子量）所得数值即为μg,也可以直接用这个公式套.1pmol 1000bp DNA=0.66μg,如载体是5380bp，则0.03pmol为0.03×5.38×0.66=0.106524μg。
dna双酶切实验报告
DNA双酶切实验报告实验报告：DNA双酶切实验引言：DNA是生物体中的一种重要的遗传物质，它携带着生物体的遗传信息。
DNA双酶切是一种常用的实验技术，可以将DNA分子切成特定的片段，以便于进一步研究和分析。
实验目的：1.了解DNA双酶切技术的原理和操作步骤；2.学习如何使用限制性内切酶来进行DNA分子的切割；3.观察并分析DNA酶切产物。
实验材料：1. 限制性内切酶：如EcoR1；2.DNA样本；3.缓冲溶液；4. 质量Marker DNA。
实验步骤：1.提取DNA样本并酶切准备：a.从合适的生物材料中提取DNA样本；b.通过酶解实验，将DNA样本切割成等长片段。
2.准备酶切反应体系：a.将提取得到的DNA样本和限制性内切酶一同加入到缓冲溶液中；b.缓冲溶液包含有助于酶切反应进行的成分。
3.酶切反应：a.将酶切反应混合物加热至适宜温度，一般为37℃，使酶能够有效地发挥作用；b.反应时间根据酶的特性和所需结果而定，一般为数小时。
4.分析酶切产物：a.通过琼脂糖凝胶电泳将酶切产物进行分离；b. 将DNA样本和Marker DNA一同加载到琼脂糖凝胶孔中；c.运行凝胶电泳，使DNA片段能够迁移并被分离。
结果与讨论：观察琼脂糖凝胶电泳结果，可以看到DNA样本在电场作用下迁移，并被分离成多个片段。
根据DNA片段的大小和迁移距离，可以确定酶切产物的大小和数目。
在实验中，如果酶切产物正好与所期望的片段大小一致，则说明酶切反应成功。
若产物片段大小与预期不符，则可能由于酶切条件不恰当或酶切位点发生突变等原因。
结论：通过本实验，我们了解了DNA双酶切技术的原理和操作步骤，并成功使用限制性内切酶将DNA样本切割成特定的片段。
同时，通过琼脂糖凝胶电泳分析，我们正确判断出酶切产物的大小和数目。
实验结果为我们进一步研究和分析DNA提供了基础。
总结：DNA双酶切实验是一种重要的遗传学研究手段，通过限制性内切酶的作用，可以将DNA分子切割成特定的片段，能够有效地研究和分析DNA的结构和功能。
双酶切实验原理
双酶切实验原理双酶切实验是一种常用的分子生物学技术，用于分析DNA序列。
它基于限制性内切酶的特异性切割DNA的原理，结合凝胶电泳技术，可以对DNA进行特异性切割和分离，从而获得所需的DNA片段。
本文将介绍双酶切实验的原理及其操作步骤。
1.双酶切实验原理。
双酶切实验的原理基于限制性内切酶对DNA的特异性切割。
限制性内切酶是一类能够识别DNA特定序列并在该序列上切割的酶，它们能够将DNA分子切割成具有特定序列的片段。
在双酶切实验中，通常会使用两种不同的限制性内切酶，它们分别识别DNA的不同序列，并在这些序列上进行切割。
通过这种双酶切割的方式，可以获得具有特定序列的DNA片段。
2.双酶切实验操作步骤。
双酶切实验的操作步骤主要包括DNA提取、酶切反应、凝胶电泳和DNA可视化等步骤。
首先，需要从样品中提取DNA。
提取的DNA可以是来自细菌、动植物或其他生物体的基因组DNA，也可以是从质粒或病毒中提取的DNA。
提取的DNA需要经过纯化和定量后，才能进行后续的操作。
接下来，将提取的DNA与两种限制性内切酶和相应的缓冲液混合，进行酶切反应。
酶切反应的条件需要根据所使用的酶的特性来确定，包括反应温度、反应时间和反应缓冲液的配制等。
酶切反应完成后，需要对反应产物进行电泳分离。
在凝胶电泳中，将酶切反应产物加载到琼脂糖凝胶上，通电进行分离。
由于DNA分子在电场中具有不同的迁移速度，可以根据DNA片段的大小进行分离和检测。
分离完成后，可以通过染色或荧光标记等方法对DNA进行可视化。
3.双酶切实验的应用。
双酶切实验在分子生物学研究中有着广泛的应用。
它可以用于分析DNA序列的特异性，鉴定基因型、进行基因工程、构建基因库等。
通过双酶切实验，可以获得特定序列的DNA片段，为后续的克隆、测序和分析提供了重要的基础。
总的来说，双酶切实验是一种重要的分子生物学技术，它基于限制性内切酶的特异性切割原理，能够对DNA进行特异性切割和分离。
双酶切连接全攻略
双酶切连接反应之全攻略前一阵子一直在做双酶切质粒重组，失败了很多次，不过很快改善了实验方法，用2周重组了14个质粒。
现就自己的体会，结合丁香园战友的宝贵经验，谈一下质粒重组的一些个人经验。
1、回收PCR产物：在进行PCR扩增时候，给引物两端设计好酶切位点，一般说来，限制酶的选择非常重要，尽量选择粘端酶切和那些酶切效率高的限制酶，如BamHI,HindIII,提前看好各公司的双切酶所用公用的BUFFER，以及各酶在公用BUFFER里的效率。
选好酶切位点后，在各个酶的两边加上保护碱基，其原则可参照：/upload/2006/08/13/31219184.pdf。
双酶切时间及其体系：需要强调的是很多人建议酶切过夜，其实完全没有必要，我一般酶切3个小时，其实1个小时已经足够。
应用大体系，如100微升。
纯化问题：纯化PCR产物割胶还是柱式，我推荐柱式，因为割胶手法不准，很容易割下大块的胶，影响纯化效率。
现在的柱式纯化号称可以祛除引物，既然如此，酶切掉的几个碱基肯定也会被纯化掉了。
所以，PCR产物和双酶切产物的纯化均可应用柱式纯化。
我用的是TAKARA的纯化柱试剂盒酶量的问题：以TAKARA的为例，其对1单位酶的定义如下：在50 μl 反应液中，30℃温度下反应1小时，将1 μg 的λDNA完全分解的酶量定义为1个活性单位(U)。
而该酶浓度约为15单位/微升，在除外酶降解的因素外，该酶可分解15μg的DNA，而一般从1-4ml 菌液提出的DNA约为3μg，而PCR纯化后的产物（50体系）约为3μg，所以即便全部加进去，只要纯化的质量好，酶切完全切得动。
2、酶切、回收后的PCR产物与载体的连接摩尔比的计算，很多人凭经验也可以。
但对于初学者从头认真计算则非常有必要。
回收的载体片段：回收的PCR产物片段=1：10，一般取前者0.03pmol，后者取0.3pmol。
pmol为单位的DNA转换为为µg单位的DNA：（X pmoles×长度bp×650）/ 1,000,000 （注：长度bp×650是该双链DNA的分子量）所得数值即为µg,也可以直接用这个公式套.1pmol 1000bp DNA=0.66μg,如载体是5380bp，则0.03pmol为0.03×5.38×0.66=0.106524µg。
双酶切体系
双酶切体系本页仅作为文档封面，使用时可以删除
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Double Digestion(双酶切反应)时Universal Buffer(通用缓冲液)的使用表
■说明
使用二种酶同时进行DNA切断反应 (Double Digestion) 时，为了节省反应时间，通常希望在同一反应体系内进行。
TaKaRa采用Universal Buffer表示系统，并对每种酶表示了在各Universal Buffer中的相对活性。
尽管如此，在进行Double Digestion时，有时还会难以找到合适的Universal Buffer。
本表以在pUC系列载体的多克隆位点处的各限制酶为核心，显示了在Double Digestion可使用的最佳Universal Buffer条件。
在本表中，各Universal Buffer之前表示的 [数字×] 是指各Universal Buffer的反应体系中的最终浓度。
TaKaRa销售产品中添附的Universal Buffer全为10倍浓度的缓冲液。
终浓度为×时反应体系中的缓冲液则稀释至20倍，1×时稀释至10倍，2×时稀释至5倍进行使用。
■注意
◇ 1 μg DNA中添加10 U的限制酶，在50 μl的反应体系中，37℃下反应1小时可以完全降解DNA。
◇为防止Star活性的产生，请将反应体系中的甘油含量，尽量控制在10%以下。
◇根据DNA的种类，各DNA的立体结构的差别，或当限制酶识别位点邻接时，有时会发生Double Digestion不能顺利进行的可
能。
双酶切
【原创】双酶切连接反应之全攻略（原创）双酶切连接反应之全攻略前一阵子一直在做双酶切质粒重组，失败了很多次，不过很快改善了实验方法，用2周重组了 14个质粒。
现就自己的体会，结合战友的宝贵经验，谈一下质粒重组的一些个人经验。
1、回收PCR产物：在进行PCR扩增时候，给引物两端设计好酶切位点，一般说来，限制酶的选择非常重要，尽量选择粘端酶切和那些酶切效率高的限制酶，如BamHI,HindIII,提前看好各公司的双切酶所用公用的BUFFER，以及各酶在公用BUFFER里的效率。
选好酶切位点后，在各个酶的两边加上保护碱基，其原则可参照：/upload/2006/08/13/31219184.pdf。
双酶切时间及其体系：需要强调的是很多人建议酶切过夜，其实完全没有必要，我一般酶切3个小时，其实1个小时已经足够。
应用大体系，如100微升。
纯化问题：纯化PCR产物割胶还是柱式，我推荐柱式，因为割胶手法不准，很容易割下大块的胶，影响纯化效率。
现在的柱式纯化号称可以祛除引物，既然如此，酶切掉的几个碱基肯定也会被纯化掉了。
所以，PCR产物和双酶切产物的纯化均可应用柱式纯化。
我用的是TAKARA的纯化柱试剂盒酶量的问题：以TAKARA的为例，其对1单位酶的定义如下：在50 μl 反应液中，30℃温度下反应1小时，将1 μg 的λDNA完全分解的酶量定义为1个活性单位(U)。
而该酶浓度约为15单位/微升，在除外酶降解的因素外，该酶可分解15μg的DNA，而一般从1-4ml菌液提出的 DNA约为3μg，而PCR纯化后的产物（50体系）约为3μg，所以即便全部加进去，只要纯化的质量好，酶切完全切得动。
2、酶切、回收后的PCR产物与载体的连接摩尔比的计算，很多人凭经验也可以。
但对于初学者从头认真计算则非常有必要。
回收的载体片段：回收的PCR产物片段=1：10 ，一般取前者0.03pmol，后者取0.3pmol。
pmol为单位的DNA转换为为µg单位的DNA：（X pmoles×长度bp×650）/ 1,000,000 （注：长度bp×650是该双链DNA的分子量）所得数值即为µg,也可以直接用这个公式套.1pmol 1000bp DNA=0.66μg,如载体是5380bp，则0.03pmol为0.03×5.38×0.66=0.106524µg。
双酶切体系梳理
Double Digestion(双酶切反应)时Universal Buffer(通用缓冲液)的使用表■ 说明使用二种酶同时进行DNA切断反应(Double Digestion) 时，为了节省反应时间，通常希望在同一反应体系内进行。
TaKaRa采用Universal Buffer表示系统，并对每种酶表示了在各Universal Buffer中的相对活性。
尽管如此，在进行Double Digestion时，有时还会难以找到合适的Universal Buffer。
本表以在pUC系列载体的多克隆位点处的各限制酶为核心，显示了在Double Digestion可使用的最佳Universal Buffer条件。
在本表中，各Universal Buffer 之前表示的[数字×] 是指各Universal Buffer的反应体系中的最终浓度。
TaKaRa销售产品中添附的Universal Buffer全为10倍浓度的缓冲液。
终浓度为0.5×时反应体系中的缓冲液则稀释至20倍，1×时稀释至10倍，2×时稀释至5倍进行使用。
■ 注意◇1 μg DNA中添加10 U的限制酶，在50 μl的反应体系中，37℃下反应1小时可以完全降解DNA。
◇为防止Star活性的产生，请将反应体系中的甘油含量，尽量控制在10%以下。
◇根据DNA的种类，各DNA的立体结构的差别，或当限制酶识别位点邻接时，有时会发生Double Digestion不能顺利进行的可能。
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双酶切
双酶切及连接
指导老师：陈思 组员：李婷 王鹏飞 高峰 姜威 邵振天
实验原理
• 用限制性内切酶去切割DNA片断，由于酶 具有专一性，一种酶只能识别一种特定的 脱氧核苷酸序列，所以可以用特定的这种 酶去切割相应的DNA片断，进而达到定向 切割的目的。
三、仪器、材料与试剂
• • • • • • • • • • 水浴锅 移液枪和枪头 制冰机 浮板 PCR产物 SaⅡ酶 BgⅢ酶 10×H Buffer 无菌水 小离心管
思考题
影响限制性内切酶活性 的因素有哪些？
• • • • • • DNA的纯度 DNA的甲基化程度 酶切消化反应的温度 DNA的分子结构 溶液中离子浓度及种类 缓冲液的pH值
• 为什么任何时候2种酶 的总量不能超过反应 体系的1/10体积？
• 我们平时所用的酶试剂中 都含有一定量的甘油，用 量过多容易使酶产生星号 活性，即限制性酶的特异 性会受影响。
• 质粒DNA的双酶切ຫໍສະໝຸດ 反应体系：BgⅢ0.6μL
SaⅡ
10× Buffer PCR产物 无菌水 总体积
0.6μL
2μL 10μL 0.8 μL 20μL（无菌水补至总积）
反应条件：温度37℃，酶切h • 琼脂糖凝胶电泳检测酶切结果 • UVP凝胶成像系统记录结果（电泳图）
结果及分析
• 双酶切结果跑出一条 带，质粒无条带。 • 分析：质粒无条带， 可能是模板问题。 • 双酶切跑出一条带， 可能是酶切后DNA片 段太小，导致结果模 糊。
注意事项
• 任何时候2种酶的总量不能超过反应体系的1/10体积。 • 双酶切时如果两种酶反应温度一致而buffer不同时，可查 阅内切酶供应商在目录后的附录中提供的各种酶在不同 buffer中的活力表，如果有一种buffer能同时使2种酶的活 力都超过70%的话，就可以用这种buffer作为反应buffer。 如果两种酶厂家不同无法查时可比较其buffer成份，相似 的话可以考虑各取一半中和。 • 如果2种酶的buffer成份相差较大或2种酶的反应温度不同 则必须分别做酶切 • 特别注意：在双酶切载体时如果2个酶切位点*得很近，必 须注意酶切顺序。因为有的限制性内切酶要求其识别序列 的两端至少保留有若干个碱基才能保证酶的有效切割。有 的酶要求识别序列两端有多个碱基的，则必须先切，否则 就可能造成酶切失败。
双酶切体系
Double Digestion(双酶切反应)时Universal Buffer(通用缓冲液)的使用表之蔡仲巾千创作
■说明
使用二种酶同时进行DNA切断反应(Double Digestion) 时，为了节省反应时间，通常希望在同一反应体系内进行。
TaKaRa采取Universal Buffer暗示系统，并对每种酶暗示了在各Universal Buffer中的相对活性。
尽管如此，在进行Double Digestion时，有时还会难以找到合适的Universal Buffer。
本表以在pUC系列载体的多克隆位点处的各限制酶为核心，显示了在Double Digestion可使用的最佳Universal Buffer条件。
在本表中，各Universal Buffer之前暗示的[数字×] 是指各Universal Buffer的反应体系中的最终浓度。
TaKaRa销售产品中添附的Universal Buffer全为10倍浓度的缓冲液。
终浓度为0.5×时反应体系中的缓冲液则稀释至20倍，1×时稀释至10倍，2×时稀释至5倍进行使用。
■注意
◇ 1 μg DNA中添加10 U的限制酶，在50 μl的反应体系中，37℃下反应1小时可以完全降解DNA。
◇为防止Star 活性的发生，请将反应体系中的甘油含量，尽量控制在10%以下。
◇根据DNA的种类，各DNA的立体结构的不同，或当限制酶识别位点邻接时，有时会发生Double Digestion不克不及顺利进行的可能。
双酶切体系
Double Digestion(双酶切反应)时Universal Buffer(通用缓冲液)的使用表之迟辟智美创作
■说明
使用二种酶同时进行DNA切断反应(Double Digestion) 时，为了节省反应时间，通常希望在同一反应体系内进行.TaKaRa采纳Universal Buffer暗示系统，并对每种酶暗示了在各Universal Buffer中的相对活性.尽管如此，在进行Double Digestion时，有时还会难以找到合适的Universal Buffer.本表以在pUC系列载体的多克隆位点处的各限制酶为核心，显示了在Double Digestion可使用的最佳Universal Buffer条件.在本表中，各Universal Buffer之前暗示的[数字×] 是指各Universal Buffer的反应体系中的最终浓度.TaKaRa销售产物中添附的Universal Buffer全为10倍浓度的缓冲液.终浓度为0.5×时反应体系中的缓冲液则稀释至20倍，1×时稀释至10倍，2×时稀释至5倍进行使用.
■注意
◇ 1 μg DNA中添加10 U的限制酶，在50 μl的反应体系中，37℃下反应1小时可以完全降解DNA.◇为防止Star 活性的发生，请将反应体系中的甘油含量，尽量控制在10%以下.◇根据DNA的种类，各DNA的立体结构的分歧，或当限制酶识别位点邻接时，有时会发生Double Digestion不能顺利进行的可能.。