乳酸脱氢酶制备

乳酸脱氢酶制备

原理:

乳酸脱氢酶（LDH）（EC1.1.1.27）存在于具糖无氧代谢途径的细胞中，为水溶性酶，催化如下反应：

L（+）—乳酸+NAD+ →丙酮酸 + NADH +H+

乳酸脱氢酶最早从牛心中分离并获结晶。制备的方法为捣碎心肌组织用水抽提，磷酸钙胶吸附，硫酸铵分级盐析及有机溶剂沉淀，最后结晶出乳酸脱氢酶。

乳酸脱氢酶活力检测原理是在pH10.0的条件下，LDH催化NAD±还原生成NADH。NADH在340nm有最大吸收，摩尔消光系数为6.2×103，NADH的分子量为663.44。

LDH活力单位定义为：25℃、每分钟催化生成1微摩尔NADH的酶量为1个活力单位。用紫外分光光度计测定酶反应进程的OD340的增量，可求出制备样品中的LDH活力。

试剂：

(1)CaCl2•6H2O

(2)Na3PO4

(3)冰乙酸

(4)0.2mol/L磷酸盐缓冲液（pH7.2）

(5)0.1mol/L磷酸盐缓冲液（pH7.2）

(6)0.3饱和度的硫酸铵溶液（19.5g/100ml）

(7)丙酮

(8)硫酸铵粉末

(9)0.5mol/L DL-乳酸钠。

(10)2mmol/L NAD+溶液：称取133mg NAD+，溶于5ml蒸馏水中，加入约0.15ml 1mol/L NaOH 调pH为6.0，定容10ml，冰箱贮存。(11) 0.1mol/L pH10.0甘氨酸-氢氧化钠缓冲液

A液0.2mol/L甘氨酸溶液：称取15.01g甘氨酸用蒸馏水溶解，定容1L。

B液0.2mol/L NaOH溶液：称取8gNaOH用蒸馏水溶解，定容1L。

取100mlA液与64.0mlB液混合，蒸馏水定容200ml。

操作：

一、磷酸钙胶制备

（1）称取19.8g CaCl2•6H2O，溶于150ml蒸馏水中，用自来水稀释成1600ml。

（2）称取22.8g Na3PO4•12H2O溶于150ml蒸馏水中。

（3）将两溶液混合，用冰乙酸调pH至7.4，室温下放置，使磷酸钙胶沉淀。

（4）吸去上清液，4000r/min离心3min，收集胶体备用。

二、 LDH制备

1、LDH水提取

（1）取100g新鲜或短期冰冻保存的牛心，去除脂肪、血管，称重，切成小块，低温下绞碎。

（2）加入400ml冰冷的蒸馏水，冰浴中搅拌，提取20min。

（3）4000r/min离心3min。吸出上清液，测量体积并记录。

（4）取样测定LDH活力。

2、磷酸钙胶吸附及洗脱

（5）上清液中加入磷酸钙胶80g左右，置冰浴中搅拌15min。

（6）将胶悬浮液转入离心管中，3000r/min离心3min，弃去上清液，保留磷酸钙胶。

（7）向磷酸钙胶沉淀中加入约0.8倍体积的0.2mol/L磷酸盐缓冲液，于冰浴中充分搅拌10分钟。

（8）3000r/min离心3min，保留上清液。测量并记录体积，取样测定LDH活力。

3、盐析

（9）将上清液置冰浴中冷却，搅拌下缓慢加入固体硫酸铵粉末，至

0.6饱和度（按39g/100ml比例加入），冰浴中放置10min。（10）4000r/min离心5min，弃去上清液

（11）向沉淀中加入20ml0.1mol/L pH7.2磷酸盐缓冲液，使沉淀溶解，测量并记录体积，取样测定LDH活力。

4丙酮沉淀

（12）将溶液置冰浴中，缓慢加入0.6倍体积（要准确）-20℃预冷的丙酮，边加边轻轻搅匀，放置10min。

（13）于4℃4000r/min离心5min，弃去上清液。

（14）沉淀溶于适量蒸馏水，记录体积，测定LDH活力。

三、LDH活力测定

操作：

（1）按下表在两只石英比色杯中分别加入以下试剂：

（2）从样品杯中加入LDH制备液混匀的瞬时开始记时，测定酶反应30秒时的A值。

结果：

将各步骤测定的数据及计算结果填入下表并对制备工艺进行评价。

总活力（μmol/min）=A/6.2×103×3×10-3×60/30×106×V/0.01