威格拉斯生物技术(北京)有限公司 高效真核转染试剂 - ( VigoFect
Vero 细胞 HCP(宿主残留蛋白)ELISA试剂盒说明书
Vero 细胞HCP（宿主细胞蛋白）Vero细胞宿主蛋白酶联免疫检测目录#F500预期用途该试剂盒用于检测用Vero 细胞.生产的制品中是否有宿主蛋白残留。
仅供研究和工业生产，不能用于人和动物的诊断。
总结与说明病毒疫苗或其他治疗用蛋白在Vero细胞中表达使商业用大量生产药物原料产品的经济简便方法。
生产和纯化这些产品的过程中会残留Vero细胞中的一些蛋白质（称为宿主细胞蛋白，HCPs）而造成污染。
这种污染可以减少药物的疗效，引发毒副反应和免疫学反应，因此最好在实际生产制品过程中将HCPs降低到最低水平。
一些利用抗体来除HCPs的免疫学方法，如Western Blot 和ELISA被广泛使用。
虽然Western blot是一种检测HCPs的有效方法，但它受到了一些限制。
因为它过程复杂且技术依赖性强，需要操作者对结果进行分析解释。
而且，它在本质上是一种定性检测，不能定量分析。
Western blot的敏感性易受被检测样品量的影响，也受目的产品浓度的干扰。
因此Western blot可用来检测纯化上游的蛋白质，而对纯化下游或终产品的检测灵敏度与特异性较低。
本试剂盒中用到的ELISA方法克服了Western Blot的缺点，将敏感度提高了100倍。
ELISA操作简单、客观、可获得半定量的结果，是纯化工艺，过程控制，常规质量检测的最佳选择。
这个试剂盒可与纯化过程中残留的可独立污染产品的所有HCPs反应，就这个意义上来说，这个试剂盒是通用的。
用Vero细胞轻度裂解物获得抗体并经亲和纯化，得到的最终抗体可以与用于生产各种病毒疫苗和蛋白质产品的四种商用细胞系反应。
这一分析表明，绝大多数HCP存在于各种Vero细胞系和纯化过程中。
如果你需要一个更为敏感和特异性的方法去检测样品中的HCP量，Cygnus Technologies公司为你推荐一个优于2D Western blot的方法，我们将这个方法称为2D HPLC-ELISA。
RNAVzol 总RNA提取
总RNA提取试剂( RNAVzol )产品说明：本试剂是一种通用的总RNA提取试剂，适用于动植物细胞或组织及细菌的总RNA抽提。
试剂中含有对RNA酶有强烈抑制作用的胍类物质和苯酚等，可有效防止RNA在提取过程中的降解。
获得的RNA可直接用于Northern杂交，纯化mRNA，体外翻译，RNase保护实验，RT-PCR，以及cDNA克隆等一系列操作。
产品内容与储存方法：名称数量保存条件ml4℃RNAVzol 100可作100次总RNA提取（10平方厘米细胞或100mg组织）。
常温运输，4℃保存。
有效期12个月。
所需其它试剂：使用者需准备氯仿，异丙醇，75%乙醇和RNA溶解液（DEPC处理水或TE 缓冲液）。
操作方法：1. 细胞裂解或组织匀浆：1)贴壁细胞：吸尽培养液，每10平方厘米（6孔板孔或35 mm平皿）细胞加入1 mlRNAVzol，使其覆盖培养细胞，再用吸管或加样器吹打2~3次，细胞应完全裂解，然后转移至离心管中。
2)悬浮细胞：离心收集细胞，吸尽液体，每五百万至一千万（5X106~107）动植物或酵母细胞，或一千万(107)细菌，加入1ml RNAVzol。
用吸管或加样器吹打，使其完全裂解。
某些酵母和细菌如裂解不充分，可用匀浆器匀浆，以确保其完全裂解。
转移至离心管中。
3)组织：先将组织剪切成小块，放入玻璃匀浆器内。
冷冻组织可在研钵中研磨匀浆。
每50~100mg组织加入1ml RNAVzol，匀浆至完全裂解。
转移至离心管中。
裂解产物应呈澄清的透明粘稠液体。
室温放置5分钟。
对于多糖、蛋白等杂质丰富的组织样品，匀浆后仍会存留有不溶物质，可12,000 g 4℃离心10分钟，然后吸取上清至一新的离心管中。
2. 分离：在装有裂解物的离心管中加入0.2倍体积的氯仿（1 ml RNAVzol加入0.2 ml氯仿），振荡器上充分振荡混匀30 秒，室温放置2-3分钟。
12,000 g 4℃离心10分钟，然后吸取含总RNA的上层水相至一新的离心管中，每毫升RNAVzol约可吸取0.5~0.55 ml。
CRISPR Cas9基因敲除载体构建试剂盒说明书V1.1
U6 promoter TGTACAAAAAAGCAGGCTTTAAAGGAACCAATTCAGTCGACTGGATCCGGTACCAAGGTCGGGCAGGAAGAGGGCC TATTTCCCATGATTCCTTCATATTTGCATATACGATACAAGGCTGTTAGAGAGATAATTAGAATTAATTTGACTGT AAACACAAAGATATTAGTACAAAATACGTGACGTAGAAAGTAATAATTTCTTGGGTAGTTTGCAGTTTTAAAATTA
产品说明书
Targeting sequence
gRNA sequence
gRNA-R primer
AAGGACGATACACCGNNNNNNNNNNNNNNNNNNNGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCG
TTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGCTTTTTTT
V2.0
北京英茂盛业生物科技有限公司 北京市昌平区沙河镇青年创业大厦 B‐916 Tel：010‐62495135 Emai：order@ Web site：
产品内容
Cas9 基因敲除试剂盒 货号 CR0001 内容 pCas9/gRNA1 载体 pTYNE 验证载体 pCas9‐P 阳性对照载体 pCas9‐N 阴性对照载体
AAGACCTTCAGAAGGTTGCTGAGTACAAGACTGGGC
靶点挑选要点：
1）：Cas9/gRNA 基因敲除原理是对基因组 DNA 序列切割后引发 DAN 修复，产生 DNA 序列缺失突变。因此 基因敲除靶点应设计在起始密码子附近（包括起始密码子）或者起始密码子下游的外显子范围内。
高效真核转染试剂
高效真核转染试剂( VigoFect )产品说明：本试剂采用一类阳离子非脂性物质为主的配方，可以与DNA形成稳定的复合物，透过细胞膜进入细胞内，并保护DNA免受核酸酶的降解。
该试剂对细胞毒性很小，可在含血清与抗生素的完全培养液中充分发挥作用。
对多数培养细胞种类都有较高的转染效率（不同种类细胞的转染效率可有明显差异）。
此类试剂是目前非病毒介导方法中效率最高的转染试剂。
产品内容与储存方法：名称数量保存条件mlVigoFect 0.44℃可进行200次转染（6孔板或35 mm平皿）。
常温运输，4℃保存。
有效期6个月。
所需其它试剂：使用者需准备150 mM NaCl （超纯水配制，高压或过滤灭菌）或注射用生理盐水作为VigoFect及DNA的稀释液，和要转染的DNA溶液（高纯度，浓度0.1~2 μg/μl）。
操作方法：准备培养细胞：1)转染前24小时，接种适量细胞（接种数量可参考附表）。
至转染时细胞密度以40~60%为宜（80~90%亦可）。
2)转染前1小时，更换新鲜的完全培养液（体积可参考附表），置37℃，5% CO2 培养。
配制转染工作液：（6孔板或35 mm平皿，2 ml培养液）3)取5~8 μg DNA（起始用量5 μg），加入稀释液中至总体积为100 μl，轻轻混匀，室温放置。
4)取VigoFect 1~4μl（起始用量2 μl），加入稀释液中至总体积为100 μl，轻轻混匀，室温放置5分钟。
5)将稀释的VigoFect逐滴加入稀释的DNA溶液中，轻轻混匀，所得的转染工作液在室温放置15分钟。
6)将转染工作液轻轻混匀，逐滴加入2 ml培养液中，轻轻混匀培养液，置37℃，5% CO2培养。
细胞后续处理：7)24~48小时后，观察或收取细胞。
8)稳定转染时，于转染后24~48小时消化细胞分至3~5个培养皿中，加适当浓度的相应抗生素（如G418）筛选。
注意事项：1) 少量使用Vigofect 时，可取精确量的VigoFect 用无菌超纯水稀释一定倍数，以便精确取样量。
威格拉斯生物技术(北京)有限公司 质粒大量提取纯化试剂盒
1) 从大量的菌液或菌体提取质粒时，可按比例提高Buffer I、Buffer II和Buffer III的用 量，以充分裂解菌体，提高质粒的回收量和纯度。
2) 提取步骤7和纯化步骤5中，充分溶解沉淀对提高质粒产量和纯度非常重要。 3) 操作中要动作轻柔，防止机械剪切可能对DNA的损失。 4) 可在纯化的各个步骤前后留取数微升的DNA溶液，最后电泳鉴定比较提取和纯化
4 l）
0.5 ml -20℃
试剂盒可作20次（<150ml菌液/次）质粒提取纯化。常温运输。RNase A于-20℃保存， 首次使用时加入Buffer I中混匀，置4℃保存。Buffer IV与Buffer VI置4℃保存，其余溶 液保存于室温。有效期6个月。
0.5 ml Buffer I，完全溶解沉淀团块（可用宽口吸管轻轻吹打辅助溶解）。移入新 的1.5 ml离心管中，室温放置10~20 min。 8) 质粒粗提物用台式离心机室温高速离心2 min，上清移入新的1.5 ml离心管中。
质粒纯化： 1) 0.5 ml质粒粗提液中加入100 μl Buffer IV（杂质清除液A），轻轻混匀，12,000 x g
电话：（010）58941231, （010）58941232 传真：（010）58941232
网址：
电子邮件：runon@
如在步骤6未见沉淀担心dna丢失可保留上清液待完成全部操作后电泳鉴定以确定是否获得终产物数百微克高纯度的质粒dna离心后沉淀在管的侧壁上可能无法看到明显团块
威格拉斯生物技术（北京）有限公司
质粒大量提取纯化试剂盒
(Plasmid Maxprep Kit)
产品说明：
本试剂盒用碱裂解法从培养菌中提取质粒DNA，采用全新技术，通过几次离心去除 蛋白质、多糖、内毒素、RNA等杂质，获得高质量的质粒DNA。纯化DNA的OD260/280 通常在1.9左右，可直接应用于细胞转染甚至动物体内实验等对DNA纯度要求很高的 工作中。纯化过程均在Eppendorf管中操作，方法简单，不需特殊设备，无需过柱， 不用酚氯仿抽提；无论细菌裂解释放出的质粒在1mg以下还是在10mg以上, 基本都可 完全回收，不必担心质粒DNA的丢失。本方法提取纯化质粒DNA，对质粒损伤小， 即使是10kb甚至100kb以上的大型质粒或超大型质粒，只要碱裂解法能够提取，就可 以有效纯化。纯化过程约需1.5~2小时。
HighGene plus Transfection reagent 说明书
HighGene plus Transfection reagent说明书货号：RM09014P规格：1mL，10mL◆产品描述HighGene plus Transfection reagent细胞转染试剂是一种新型的混合型高分子聚合物转染试剂。
它可以与核酸（包括质粒、siRNA、寡聚核苷酸）相互作用形成一种复合物将核酸转运到真核细胞内，适用于大部分真核细胞的细胞转染。
◆产品特点1、适用于多种细胞类型和培养板。
2、高转染效率、批次稳定重复性好、操作简单。
3、转染过程不受血清和抗生素的影响。
◆保存条件-20℃保存，24个月有效。
◆操作说明1、贴壁细胞转染（以293T细胞为例）（1）第一天，将293T细胞接种到6孔板中，细胞密度控制在70%-90%为宜；注：根据实验需求，可以选择不同的细胞培养装置，细胞接种数量和所需培养液体积详见附表1（2）第二天，先取4μg质粒加入到200μL无血清DMEM基础培养基离心管中，吹打混合均匀，然后加入8μL HighGene plus转染试剂，吹打混合；注：MEM、1640、F12等基础培养基均可用于HighGene plus转染试剂的溶剂，不同的细胞培养装置所需质粒的量和HighGene plus转染试剂剂量详见附表2（3）将200μL质粒/HighGene plus转染试剂复合物均匀滴加到6孔细胞培养板孔中，轻轻晃动细胞培养板使其均匀分布；注：6孔板中为完全培养基，轻轻晃动细胞培养板即可，切勿剧烈摇动细胞培养板，以免细胞脱落漂浮！（4）细胞转染4-6h后，半量更换新鲜完全培养基；注：半量换液时，吸弃一半原有完全培养基，补加一半新鲜完全培养基（5）细胞转染24-48h后，即可使用适当方式进行检测，如RT-PCR、Western、ELISA、报告基因等，或加入相应筛选药物（G418或Puromycin）可获得稳定细胞株。
2、悬浮细胞转染（以HEK293F细胞为例）（1）第一天，在125mL摇瓶中接种30mL密度为1×106个/mL HEK293F悬浮细胞；（2）第二天，先取30μg质粒加入到3mL无血清DMEM基础培养基离心管中，吹打混合均匀，然后加入60μL HighGene plus转染试剂，吹打混合均匀；（3）将3mL质粒/HighGene plus转染试剂复合物均匀滴加到30mL体积HEK293F悬浮细胞的125mL摇瓶中，轻轻摇动摇瓶使其混合均匀；（4）细胞转染3-5天后，根据蛋白表达的情况（胞内表达或分泌表达），收集细胞或细胞培养上清，进行后续蛋白纯化操作。
聚焦转染：8大品牌转染试剂强中强[选购宝典]
![聚焦转染：8大品牌转染试剂强中强[选购宝典]](https://img.taocdn.com/s3/m/66b7e9b6960590c69ec376a0.png)
聚焦转染：8大品牌转染试剂强中强[选购宝典]生物通技术专评：数百万年来原核生物如大肠杆菌就经常相互分享它们的遗传物质的——受到自然的启发，出现了将DNA导入哺乳动物培养细胞的技术——这是分子生物学的又一个重要的里程碑。
也多谢这种技术的不断进步，我们终于可以在各种哺乳动物细胞中进行各种克隆化基因的表达，从而达到不同的目的－－比如，生产制备大量经过真核特有的翻译后加工的活性蛋白；研究表达蛋白的结构和生化特性；研究基因表达的调控机理；甚至调控基因的表达等等。
可以说在哺乳动物细胞中表达外源基因的2个关键：一个是选择构建合适的表达载体和表达细胞株，另一个就是选择合适的方法将克隆的基因导入培养细胞中进行表达。
转染技术的广泛使用促进了人们对外源基因在哺乳动物细胞中的表达等方面的认识，并在方法学上促进了该领域及相关领域的发展。
从磷酸钙到脂质体，到多胺，可用于转染的细胞种类已越来越多，转染试剂也不断更新换代，而转染也不再仅限于将DNA转入细胞中了，RNA，siRNA，蛋白质等等生物大分子也进入了转染的行列。
在纷纭的产品中，你会选择哪种转染试剂？生物通这个转染试剂专辑希望为大家介绍市面上主流的转染试剂和各自的个性特点和适用范围－－可以说，针对不同的细胞株，不同的转染实验目的，还有不同的转染要求，很难找到一种能满足所有的要求，十全十美的产品。
你需要一一尝试和优化条件——但是了解市面上各种产品的特点与长短，无论是对于转染新手，或者是“老革命遇到新问题”，都是有益的。
在生物通这个转染试剂专辑系列我们将分别介绍国外几个经典好用的王牌产品，以及国内物美价廉的后起之秀，以及总结一些使用心得和注意事项。
如果你有自己的心得并愿意和大家分享，欢迎投稿生物通哦:)一、打开转染之门：基本概念作为篇首还是要把老调调再弹弹。
请原谅我有点“唐僧”的回顾几种经典转染方法。
DEAE-葡聚糖（Diethylaminoethyl (DEAE)-dextran）：这个早在1965年出现的转染方法差不多是最古董级的方法之一了，直到现在竟然还有少数人坚持采用。
sirna转染试剂说明书
3
1
24-well
2
500
2 x 50
6
2
12-well
4
1000
2 x 100
12
4
6-well
10
2500
2 x 250
30
10
转染实验优化: 为了提高转染效率，最好对转染条件进行优化，特别是首次使用。例如：24 孔培养板，调整 siRNA 与 RFect 试剂的用量。
siRNA 用量在 0.6-30 pmol(final concentration 1- 50 nM)之间调整，RFect 试剂用量在 1.0 - 3.0μl 之间调整。客户可按照习惯用量进行预实验，
所干扰基因本身及分析方法。可设置不同的孵育时间进行实验以确定最佳孵育时间。
转染实验要点： 转染过程不可添加抗生素，否则会导致细胞死亡； 首次实验 siRNA 的用量可稍大（一般 10 nM） ，后续实验根据实验结果修改。
RFect Transfection Reagent Formats for Various Cell Culture Vessels
传真: 0519-83382790
◎转染细胞范围广，绝大多数贴壁细胞株都能获得比较理想的转染结果
储存条件：-20℃
应用 ◎siRNA 转染 ◎antisense RNA 转染 ◎200bp 内的小分子 DNA 转染
产品介绍
RFect 小核酸转染试剂是国际知名科学家崔坤元博士领导我公司研发团队在美国西雅图实验室研发成功的一种新型的小核酸转染试剂。RFect 可用来转染 siRNA、antisense RNA、microRNA 等 200bp 以内的小分子 RNA 和 DNA，转染细胞包括绝大多数贴壁生长的细胞，如一般细胞 株、肿瘤细胞株等。目前，无论国外还是国内，转染试剂的主要成分均为脂质体或聚乙烯亚胺(Polyethylenimine, PEI)，这两种成分都具有很 大的细胞毒性，并且转染效果不好。RFect 采用新型的动物源性的纳米材料，毒性很低并且拥有非常卓越的转染性能。与其它品牌的小核酸 转染试剂相比，RFect 的细胞转染阳性率一般在 90%以上，Lamin A/C 基因抑制效率在 95%以上，而其它品牌转染试剂的细胞转染阳性率一 般不超过 70%，Lamin A/C 基因抑制效率不超过 75%。RFect 细胞毒性很低，转染细胞死亡率不到 10%，而其它品牌试剂的转染细胞死亡率 一般在 30%以上。血清对转染效果没有影响，不必刻意添加或更换培养液。有关 RFect 小核酸转染试剂的材料合成和试剂配制我们已申请了 国际专利，并通过 PCT 覆盖国际上多个国家和地区。
金品”是怎样炼成的 - 北京全式金生物(TransGen Biotech
TransStart Green qPCR SuperMix UDG 数据的准确 具有TransStart Green qPCR SuperMix的所有特点。 采用UDG酶和dUTP组合，有效防止PCR产物的交叉污染 （得到的CT值比实际CT值小或其它影响）。 原理：dUTP取代dTTP，扩增产物中“U”取代了“T”，如 果有PCR产物的残留污染，在孵育步骤时（50℃ 2 min）,UDG酶可以消化含“U”的PCR产物，而不会影响含 “T”的模板，去除污染。随后的变性步骤（ 95℃ 10 min ）， 彻底失活UDG酶，避免了降解新的扩增产物的可能。
Passive Reference Dye的校正作用（必要性）
未校准加样误差
已校准加样误差
Passive Reference Dye II，Stratagene Mx3000
Passive Reference Dye的特异性
不同的仪器公司，生产各自仪器的同时，也生产与之相 配套的qPCR SuperMix。其产品配有Passive Reference Dye。 但是不同的仪器，所需Passive Reference Dye不同，不同 厂家的仪器与试剂之间，无法实现兼容。 e.g.ABI 7900/7500， Reference Dye I/II 世界上没有任何一种Passive Reference Dye，可以适用于 各个品牌的荧光定量PCR仪。 TransGen： Reference Dye I/II/III, PCR Enhancer
保真性 速度
Pfu酶能否和Taq 酶 具有同样的扩增速度呢？ 但一般认为，合成速度的提升，往往会以牺牲保真性为代价。 如何在提高聚合速度的同时还能确保保真性，成为改造Pfu酶 必须解决的问题。
MST1通过促进PEPCK的表达调控小鼠肝脏糖异生
基础医学与临床Basic & Clinical MedicineDecember 2020Vol.40 No.122020年 12月 第40卷第12期文章编号：1001-6325 ( 2020 ) 12-1656-05研究论文MST1通过促进PEPCK 的表达调控小鼠肝脏糖异生解相宏1,耿 超1,赵 微1,李春美1,张伟虹2,杨佳卉2,刘晓军1**收稿日期:2020- 09-11 修回日期：2020-10- 24基金项目：中国医学科学院医学与健康科技创新工程(CIFMS2017-I2M-1-008)*通信作者(corresponding author ) : xiaojunliu@ (1.中国医学科学院基础医学研究所北京协和医学院基础学院医学分子生物学国家重点实验室，北京100005；2.山西医科大学基础医学院微生物学与免疫学教研室，山西太原030001)摘要：目的探讨哺乳动物不育系20样激酶1(MST1)在小鼠肝脏糖异生途径中的作用及调节机制。
方法RT-qPCR 检测MST1 mRNA 在糖尿病模型db/db 小鼠和对照db/m 小鼠肝脏组织中的表达。
通过腺病毒感染小鼠肝原代细胞，检测MST1过表达后肝细胞的糖输出能力。
在HepG2细胞中，运用荧光素酶报告基因实验检测MST1对磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEPCK )编码基因的启动子活性的作用。
利用干扰腺病毒在小鼠肝原代细胞中敲 低叉头盒转录因子O1( FOXO1),检测MST1过表达对PEPCK mRNA 水平的影响。
结果MST1 mRNA 在糖尿病db/db 小鼠的肝脏组织中高表达(P<0. 001)。
在小鼠肝原代细胞过表达MST1促进了葡萄糖的输出(P <0. 05)。
在HepG2中，过表达MST1促进了 PEPCK mRNA 的表达(P <0. 001)和启动子活性(P <0.01)。
进而，当敲低FOXO1表达后，MST1诱导PEPCK mRNA 表达的作用消失。
Eastep
技术手册V3.7Eastep ® Super 总RNA 提取试剂盒 (Eastep ® Super Total RNA Extraction Kit) 产品目录号：LS1040上海普洛麦格生物产品有限公司目录◼产品描述 (1)◼试剂盒组分 (1)◼存储条件 (1)◼试剂配制 (2)◼预防RNase污染的注意事项 (2)◼不同细胞的破碎方法 (2)◼不同样品起始用量 (3)◼RNA分离纯化流程图 (4)◼从动物组织中提取RNA (5)◼从贴壁或悬浮细胞中提取RNA (6)◼从植物组织中提取RNA (8)◼从革兰氏阳性（枯草杆菌）和革兰氏阴性（大肠杆菌）细菌中提取RNA (10)◼不同材料提取RNA的得率 (11)◼问题及解决办法 (12)◼附录 (14)1.PBS缓冲液，(10×)，pH 7.4 (14)2.胰蛋白酶-EDTA溶液(1×) (14)3.1×TE缓冲液，pH 8.0 (14)◼产品描述RNA的纯度和完整性在RT-PCR、qRT-PCR、RNase保护、Northern Blot、体外翻译和微阵列分析等分子生物学实验中至关重要。
近年来，RT-PCR和qRT-PCR已经演变成定性、定量分析某些特定mRNA的有力工具。
随着基因扩增技术的不断成熟，从组织、培养细胞等小量样本中快速纯化得到无基因组DNA污染的高质量RNA的需求越来越迫切，Eastep® Super总RNA提取试剂盒也因此应运而生。
Eastep® Super总RNA提取试剂盒（LS1040）为客户提供了一套从动物组织、植物组织、培养细胞、细菌中小量纯化高质量、完整总RNA的解决方案。
该试剂盒采用独特的细胞裂解系统，无需使用苯酚、氯仿等有害物质，通过离心柱硅基质膜高效、专一地吸附核酸分子，再经DNA酶处理去除基因组DNA的污染，最终得到高纯度的总RNA。
本产品具有高效、快速、方便之特点，单个样品提取纯化一般可在30分钟内完成。
转染试剂 vigofect对 hela细胞转染的方案优化
中国图书分类号 ：Ｑ２－３３ 文献标识码 ：Ｂ
０ 前言
＂转染试剂 Ｖｉｇｏｆｅｃｔ对 ＨｅＬａ细胞转染的方案 优化＂是为生物学一年级研究生开设的细胞及组 织培养课程中，学生做的开放实验课题。在学习了 转染技术基本原理与操作、荧光显微镜成像技术、 蛋白印迹技术后，学生综合运用以上技术，使用转 染试剂，对 ＨｅＬａ细胞的转染条件进行研究，分析 影响转染效率的因素，探究转染条件的优化方案， 以便为自己今后的实验工作提供借鉴。同时，这种 问题导向性实验的设置，是为培养学生的创新性 思维，改进研究生教学工作进行的探索。
转染是采用除病毒感染外的其他方法将外源 核酸（ＤＮＡ或者 ＲＮＡ）人工导人真核细胞的过程。 通过转染能改变细胞内蛋白表达，改变细胞特性， 是研究基因或其产物功能和调控机制的一种非常 重要的技术手段 （１］。将外源基因导人真核细胞的方 法有很多种，例如 ：ＤＥＡＥ－葡聚糖转染法、磷酸钙转 染法、脂质体法、显微注射法及电穿孔法等 ［２］ 。
１．３．２．２ 细胞密度对转染效率的影响 １２孔板
中，转染前一天调整铺人皿中的细胞数量，使细胞 在转染当天分别达到 ４０％ 、７０％ 、１００％的汇合度。
２０１９年第 ５４卷第 １２期
生物学通报
４５
转染试剂 Ｖｉｇｏｆｅｃｔ对 ＨｅＬａ细胞转染的方案优化
李思琦；李春雅；翁梦露；杨悦；张健翔；刘进；商瑜；张晓嫣
（北京师范大学生命科学学院 北京 １００８７５）
摘要 ＂转染试剂 Ｖｉｇｏｆｅｃｔ对 ＨｅＬａ细胞转染的方案优化＂是研究生细胞及组织培养实验 课程设直的开放性研究项目，学生利用课堂学到的技术，在 ＨｅＬａ细胞转染过程中，通过调整 ＤＮＡ 与转染试剂比例、细胞密度、转染时间这 ３个条件，考察了影响转染效率的因素，获得了 适合其实验室要求的细胞瞬时转染优化条件。其实验结果表明：用 Ｖｉｇｏｆｅｃｔ转染 ＨｅＬａ 细胞时， 提前 １１ ｈ接种细胞，细胞汇合度达到 ４０％ ，每孔的质粒转染量为 ２．５μｇ时为最优条件。
近红外双荧光系统在磷酸酯酶筛选中的应用
近红外双荧光系统在磷酸酯酶筛选中的应用杨昕霆;阎海霞;沈珝琲;张业【摘要】目的应用奥德赛(Odyssey)近红外双荧光系统筛选去甲基化酶KDM3A 去磷酸化的磷酸酯酶.方法使用磷酸酯酶干扰质粒转染HEK293T细胞,使用磷酸化的KDM3A抗体对细胞进行杂交,近红外荧光染料DRAQ5标记细胞核,利用奥德赛(Odyssey)近红外双荧光系统对细胞进行荧光扫描,荧光强度的比值可代表细胞内相对KDM3A磷酸化水平,进而筛选出相关的磷酸酯酶.结果磷酸酯酶广谱抑制剂冈崎酸OA处理转染后的细胞,近红外双荧光扫描系统可以检测到KDM3A的磷酸化,初步筛选出4个可能参与KDM3A去磷酸化的磷酸酯酶亚基.结论近红外双荧光系统可以应用于磷酸酯酶的初步筛选.【期刊名称】《医学研究杂志》【年(卷),期】2014(043)005【总页数】3页(P52-54)【关键词】奥德赛近红外双荧光扫描系统;KDM3A;磷酸酯酶【作者】杨昕霆;阎海霞;沈珝琲;张业【作者单位】100005 中国医学科学院基础医学研究所/北京协和医学院基础学院生物化学与分子生物学系、医学分子生物学国家重点实验室;100005 中国医学科学院基础医学研究所/北京协和医学院基础学院生物化学与分子生物学系、医学分子生物学国家重点实验室;100005 中国医学科学院基础医学研究所/北京协和医学院基础学院生物化学与分子生物学系、医学分子生物学国家重点实验室;100005中国医学科学院基础医学研究所/北京协和医学院基础学院生物化学与分子生物学系、医学分子生物学国家重点实验室【正文语种】中文【中图分类】R393奥德赛(Odyssey)近红外双荧光扫描系统是近年来引进的一种新技术。
近红外双荧光扫描系统的工作原理是使用激光激发带有特殊标记的抗体或者荧光染料，受激发的抗体或染料释放出近红外荧光，样品发射出的700nm和800nm近红外荧光信号可以被扫描仪器接收，并且计量近红外荧光值，从而完成蛋白质的定性或定量测量。
细胞生物学技术-真核细胞转染、感染技术
阳离子脂质体介导的转染
威格拉斯 Vigofect
脂质体转染的特点
• 适用于把ＤＮＡ转染入悬浮或贴壁培养细胞，可 用于瞬时转染和稳定转染。
哺乳动物细胞常规转染有两种： • 瞬时转染
是指外源基因进入受体细胞后，存在于游离的载体上，不 整合到细胞的染色体上。
• 稳定转染
被转染外源基因整合到染色体中，产生稳定或永久转染的 细胞系。
瞬时和稳定转染
瞬时转染
• 外源表达载体不整合到宿主染色体中，导入细胞1-3天 后收获细胞进行检测和分析(48h-72h）是蛋白表达高峰）。
哺乳动物细胞表达载体
大多数表达载体是为容纳cDNA片段而设计的，一般含有多种元件，包括: 1）SV40复制起始点，可在COS细胞中扩增至高拷贝数； 2）有效的启动子元件，如CMV、SV40启动子，可起始高水平转录； 3）mRNA加工信号，如mRNA切割和聚腺苷化序列等； 4）含有多个限制性内切酶位点供外源DNA插入的接头(多克隆位点）； 5）筛选标记，可用于选择稳定整合质粒DNA的细胞，如胸苷激酶基因、 新霉素抗性基因和潮霉素B磷酸转移酶基因； 6）质粒骨架序列，以允许在细菌中增殖。 7）正确的翻译起始序列，如核糖体结合位点和 起始密码子。
电穿孔法的特点
优点：转染效率较高 缺点：
• 需要电穿孔仪和昂贵的转染试剂。
Lonza的AmaxaNucleofector电转仪采用专利的Nucleofector技术，通过调整
优化电转参数（内设程序），将外源基因直接导入细胞核中。能高效转染DNA、
TRAF6和IFN-λR1相互作用后的泛素化变化对IFN-λ1信号通路的影响
TRAF6和IFN-λR1相互作用后的泛素化变化对IFN-λ1信号通路的影响张俊文;杨霞;米蕊芳;刘福生;陈虹;黄秉仁【摘要】目的研究IFN-λ1抑制NF-κB激活和TRAF6抑制ISRE激活的分子机制.方法利用细胞培养、细胞转染、免疫共沉淀、SDS-PAGE及Western blot等方法检测IFN-λ1对TRAF6泛素化,以及泛素连接酶TRAF6对IFN-λ1的受体IFN-λR1泛素化的作用.结果 IFN-λ1会抑制TRAF6的自身泛素化,TRAF6能泛素化受体IFN-λR1,并且IFN-λ1会增加IFN-λR1与泛素K63位点的结合.结论 IFN-λ1抑制了NF-κB的激活的原因是IFN-λ1能够抑制TRAF6的自身泛素化.TRAF6能泛素化IFN-λR1,从而抑制ISRE的激活.【期刊名称】《医学研究杂志》【年(卷),期】2016(045)009【总页数】6页(P43-48)【关键词】IFN-λ1;IFN-λR1;TRAF6;NF-κB;ISRE【作者】张俊文;杨霞;米蕊芳;刘福生;陈虹;黄秉仁【作者单位】100050 首都医科大学附属北京天坛医院/北京市神经外科研究所脑肿瘤研究中心;100005北京,中国医学科学院基础医学研究所/清华大学医学部北京协和医学院基础学院医学分子生物学国家重点实验室;100005北京,中国医学科学院基础医学研究所/清华大学医学部北京协和医学院基础学院医学分子生物学国家重点实验室;100050 首都医科大学附属北京天坛医院/北京市神经外科研究所脑肿瘤研究中心;100005北京,中国医学科学院基础医学研究所/清华大学医学部北京协和医学院基础学院医学分子生物学国家重点实验室;100050 首都医科大学附属北京天坛医院/北京市神经外科研究所脑肿瘤研究中心;100005北京,中国医学科学院基础医学研究所/清华大学医学部北京协和医学院基础学院医学分子生物学国家重点实验室;100005北京,中国医学科学院基础医学研究所/清华大学医学部北京协和医学院基础学院医学分子生物学国家重点实验室【正文语种】中文【中图分类】R73-36干扰素-λs(interferon-λs，IFN-λs)是近年新发现的一类新型干扰素，其在基因组结构上与IL-10家族成员相似，而在氨基酸组成和功能方面与Ⅰ型IFN接近[1]。
GeneCopoeia 转染试剂Z0104 说明书
EndoFectin™-MAX 转染试剂■ 产品概述：EndoFectin™ MAX 转染试剂是一种具有专利的阳离子聚合物试剂，它能与核酸形成复合物，并使该复合物进入哺乳动物细胞。
EndoFectin™ MAX 转染试剂广泛适用于常见细胞系，如HEK-293, HEK293T , Hep G2, HeLa, CHO-K1, COS-1, COS-7, NIH/3T3, and Sf9. 该试剂经过毒性去除处理，有效地达到了低毒性和转染的高效率，广谱的适用于各种细胞系。
即使在有血清存在的情况下，它仍然能高效的将核酸导入细胞。
GeneCopoeia 公司提供的 EndoFectin™ MAX 转染试剂有如下优点：• 优越的转染效率• 重组蛋白的高表达水平• 与含血清的培养基相兼容• 低细胞毒性• 易于操作■ 成分及储存条件：• 每管含有经过滤除菌的EndoFectin™ MAX 转染试剂• EndoFectin™ MAX 转染试剂 可于常温下运输。
4-8℃密闭保存。
该试剂在4-8℃的条件下，可保持稳定至少12个月。
■ 质量控制：每批EndoFectin™ MAX 均经过转染测试。
我们将eGFP 表达质粒(GeneCopoeia Catalog No. EX-EGFP-Lv01)用EndoFectin™ MAX 转染试剂转入subconfluent HEK-293 细胞。
转染16小时后，超过95%的细胞表达eGFP 。
■ 实验开始前的注意事项：质粒的质量：请务必使用高质量转染级无内毒素的质粒。
通过260nm 光吸收测定DNA 浓度，260nm/280nm 比值确定DNA 纯度（比值应该在1.8~2.0的范围之内）。
如有可能，请通过琼脂糖凝胶电泳检测质粒的完整性。
细胞的条件：使用适当保存和经常传代的健康细胞。
确保培养基没有被细菌，真菌或支原体污染。
如果细胞是近期复苏的液氮冻存细胞，请在转染前至少传代两次。
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表：建议的起始转染条件。
培养容器
96孔板 24孔板 6孔板 35mm平皿 60mm平皿
转染前一天接 种细胞数 万 1-1.5 5-10 20-40 20-40 40-60
转染时培 养液体积
ml 0.1 0.5 2 2 4
DNA用量与稀释 VigoFect 用量与
后体积
稀释后体积
µg
µl
µl
µl
0.25
操作方法：
准备培养细胞： 1) 转染前24小时，接种适量细胞（接种数量可参考附表）。至转染时细胞密度以
40~60%为宜（80~90%亦可）。 2) 转染前1小时，更换新鲜的完全培养液（体积可参考附表），置37℃，5% CO2 培
养。 配制转染工作液：（6孔板或35 mm平皿，2 ml培养液） 3) 取5~8 μg DNA（起始用量5 μg），加入稀释液中至总体积为100 μl，轻轻混匀，室
电子邮件：runon@
威格拉斯生物技术（北京）有限公司
注意事项：
1) 少量使用Vigofect时，可取精确量的VigoFect用无菌超纯水稀释一定倍数，以便精 确取样量。该稀释液可在4℃保存1月左右。
2) 细胞的生长状态是转染效率的一个主要决定因素。在实验条件许可的情况下，使 用高质量的培养液、优质血清等，可能会明显提高转染效率。
培养。 细胞后续处理： 7) 24~48小时后，观察或收取细胞。 8) 稳定转染时，于转染后24~48小时消化细胞分至3~5个培养皿中，加适当浓度的相
应抗生素（如G418）筛选。
电话：（010）58941231, （010）58941232 传真：（010）58941232
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降低细胞毒性的方法：
通常本转染试剂对细胞的毒性很低。如个别种类细胞对本转染试剂特别敏感，可通过 以下方法降低细胞的毒性反应。 1) 确保质粒DNA无杂质污染。 2) 检查表达蛋白对细胞是否有毒性。 3) 增加转染时培养液体积，或略减低转染工作液的用量。 4) 转染后3~6小时去除含转染液的培养液，更换为新鲜的完全培养液。 5) 转染时细胞密度不能过低。
温放置。 4) 取VigoFect 1~4μl（起始用量2 μl），加入稀释液中至总体积为100 μl，轻轻混匀，
室温放置5分钟。 5) 将稀释的VigoFect逐滴加入稀释的DNA溶液中，轻轻混匀，所得的转染工作液在室
温放置15分钟。 6) 将转染工作液轻轻混匀，逐滴加入2 ml培养液中，轻轻混匀培养液，置37℃，5% CO2
体积不变），以确定不同细胞的最佳转染条件。一般固定DNA用量（5 μg），与 系列含量的VigoFect混合，选取VigoFect的最佳用量；也可固定VigoFect用量（2 μl ），与系列含量的DNA混合，选取DNA的最佳用量。 4) 进一步减少转染时培养液体积（转染后6~16小时再补加足量培养液）。 5) 如有可能，且细胞可以耐受，可将培养容器在加入转染工作液后立即250 g离心5 min。
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高效真核转染试剂
( VigoFect )
产品说明：
本试剂采用一类阳离子非脂性物质为主的配方，可以与DNA形成稳定的复合物，透 过细胞膜进入细胞内，并保护DNA免受核酸酶的降解。该试剂对细胞毒性很小，可 在含血清与抗生素的完全培养液中充分发挥作用。对多数培养细胞种类都有较高的 转染效率（不同种类细胞的转染效率可有明显差异）。此类试剂是目前非病毒介导 方法中效率最高的转染试剂。
产品内容与储存方法：
名称
数量 保存条件
VigoFect
06孔板或35 mm平皿）。常温运输，4℃保存。有效期6个月。
所需其它试剂：
使用者需准备150 mM NaCl （超纯水配制，高压或过滤灭菌）或注射用生理盐水作为 VigoFect及DNA的稀释液，和要转染的DNA溶液（高纯度，浓度0.1~2 μg/μl）。
5
0.1
5
1.25
25
0.5
25
5
100
2
100
5
100
2
100
10
200
4
200
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3) DNA和VigoFect的混合比例，决定了形成复合物的颗粒大小和性质；复合物颗粒 的大小和性质，对细胞的DNA吸收能力有重要影响。不同细胞达到最佳转染效率 ，所需复合物的颗粒大小、性质和数量，可能又有微小或很大差异。
提高转染效率的方法：
1) 使用高质量、高纯度的质粒DNA。 2) 转染时细胞应处在生长旺盛状态。 3) 从起始用量开始，调整配制转染液中DNA和VigoFect的用量（保持转染工作液总