《发酵工业无菌技术》PPT课件
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4微生物工程第四章发酵工业的无菌技术
解：C0=2×105(个/ml) Ct=0.001/(40×106)=2.5×10-11(个/ml) t=2.303/k[lg(C0/Ct)]=2.303/15×lg[(2×105)/(2.5×10-11)] =2.37 min
喷淋冷却连续灭菌流程
喷射加热连续灭菌流程
薄板式换热器连续 灭菌流程
丝状菌发酵被产酸菌污染：pH不断下降，菌丝 大量自溶，发酵液粘度黏度增加，过滤困难 处理方法：①将发酵液加热后再加助滤剂； ②先加絮凝剂使蛋白质凝聚后沉淀
杂菌分泌较多蛋白质杂质时，使水相和溶媒之 间极易发生乳化。
（二）杂菌污染的防治
1. 染菌的检查与判断
显微镜检查法 平板划线培养或斜面培养检查法 肉汤培养检查法 发酵过程的异常现象判断
三、发酵工业的无菌技术——灭菌方法
干热灭菌法 湿热灭菌法 射线灭菌法 化学药剂灭菌法 过滤除菌法 火焰灭菌法
四、发酵培养基及设备管道灭菌
（一）湿热灭菌原理 （二）分批灭菌（实罐灭菌） （三）连续灭菌（连消） （四）发酵培养基及设备管道灭菌技术
（一）湿热灭菌原理 1.微生物的热阻
灭菌后弃去
发酵前期染菌
应迅速重新灭菌，补充必要的营养成分， 重新接种
发酵中期染菌
挽救困难，应早发现，应根据各种发酵的特 点和具体情况尽快处理 。
抗生素发酵
输入正常发酵的另一罐发酵液
柠檬酸发酵
a. 污染细菌：加大通风，加速产酸；加入盐 酸等条pH3.0以下，抑制细菌
b. 污染酵母：加入0.025~0.035g/L CuSO4抑制 酵母；通风加大，加速产酸。
3. 杂菌污染的途径及其预防
（1）种子带菌的防治
培养基及器具彻底灭菌 避免菌种在移接过程中受污染 避免菌种在培养及保藏过程中污染
喷淋冷却连续灭菌流程
喷射加热连续灭菌流程
薄板式换热器连续 灭菌流程
丝状菌发酵被产酸菌污染：pH不断下降，菌丝 大量自溶，发酵液粘度黏度增加，过滤困难 处理方法：①将发酵液加热后再加助滤剂； ②先加絮凝剂使蛋白质凝聚后沉淀
杂菌分泌较多蛋白质杂质时，使水相和溶媒之 间极易发生乳化。
（二）杂菌污染的防治
1. 染菌的检查与判断
显微镜检查法 平板划线培养或斜面培养检查法 肉汤培养检查法 发酵过程的异常现象判断
三、发酵工业的无菌技术——灭菌方法
干热灭菌法 湿热灭菌法 射线灭菌法 化学药剂灭菌法 过滤除菌法 火焰灭菌法
四、发酵培养基及设备管道灭菌
（一）湿热灭菌原理 （二）分批灭菌（实罐灭菌） （三）连续灭菌（连消） （四）发酵培养基及设备管道灭菌技术
（一）湿热灭菌原理 1.微生物的热阻
灭菌后弃去
发酵前期染菌
应迅速重新灭菌，补充必要的营养成分， 重新接种
发酵中期染菌
挽救困难，应早发现，应根据各种发酵的特 点和具体情况尽快处理 。
抗生素发酵
输入正常发酵的另一罐发酵液
柠檬酸发酵
a. 污染细菌：加大通风，加速产酸；加入盐 酸等条pH3.0以下，抑制细菌
b. 污染酵母：加入0.025~0.035g/L CuSO4抑制 酵母；通风加大，加速产酸。
3. 杂菌污染的途径及其预防
（1）种子带菌的防治
培养基及器具彻底灭菌 避免菌种在移接过程中受污染 避免菌种在培养及保藏过程中污染
项目四-发酵工业的无菌操作PPT课件
23
.
噬菌体是病毒的一种，是一种极微 小的生物，体积是细菌的1/1000左 右，它可以通过细菌过滤器，只有 在电子显微镜下才能看到。
24
. 25
.
26
消除潜在的污染隐患-1
▪ 涉及菌体相关的操作要尽可能在生物安全柜中进行；
▪ 在菌体培养过程中，尽量不要打开瓶口。如果实在需要打开瓶口的话，必需
从杂菌种类看：
➢耐热芽孢杆菌：与④有关
➢球菌、无芽孢杆菌：与① ② ③⑤有关
➢浅绿色菌落的杂菌：与水有关，即冷却盘管渗漏
➢霉菌：与④⑤有关，即无菌室灭菌不彻底或操作问题
➢酵母菌：糖液灭菌不彻底或放置时间较长
2021/3/20 .
57
从染菌幅度看：各个发酵罐或多数发酵罐染 菌，且所污染的是同一种杂菌，一般是空气 系统问题，若个别罐连续染菌，一般是设备 问题。
20
.
溶解氧水平异常变化显示染菌
溶氧浓度 污染噬菌体
正常发酵
溶氧浓度 正常发酵
污染嫌气性杂菌
发酵时间
污染好气性杂菌
发酵时间
21
.
CO2异常显示染菌
工艺一定，尾气中CO2量变化有一定规律 污染杂菌，糖耗加快，尾气中CO2量增加 污染噬菌体，糖耗减慢，尾气中CO2量减少
22
.
2.污染噬菌体的检测
噬菌体是什么？
46
.
常见的设备、管道“死角” 发酵罐的“死角”：不锈钢衬里破裂造成死角，
发酵罐罐底脓疱状积垢。
47
法兰连接不当造成的“死角”
2021/3/20 .
48
灭菌时蒸汽不易通达的“死角”及其消除方法
2021/3/20 .
49
（4）设备渗漏染菌及防止 原因
.
噬菌体是病毒的一种，是一种极微 小的生物，体积是细菌的1/1000左 右，它可以通过细菌过滤器，只有 在电子显微镜下才能看到。
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消除潜在的污染隐患-1
▪ 涉及菌体相关的操作要尽可能在生物安全柜中进行；
▪ 在菌体培养过程中，尽量不要打开瓶口。如果实在需要打开瓶口的话，必需
从杂菌种类看：
➢耐热芽孢杆菌：与④有关
➢球菌、无芽孢杆菌：与① ② ③⑤有关
➢浅绿色菌落的杂菌：与水有关，即冷却盘管渗漏
➢霉菌：与④⑤有关，即无菌室灭菌不彻底或操作问题
➢酵母菌：糖液灭菌不彻底或放置时间较长
2021/3/20 .
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从染菌幅度看：各个发酵罐或多数发酵罐染 菌，且所污染的是同一种杂菌，一般是空气 系统问题，若个别罐连续染菌，一般是设备 问题。
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溶解氧水平异常变化显示染菌
溶氧浓度 污染噬菌体
正常发酵
溶氧浓度 正常发酵
污染嫌气性杂菌
发酵时间
污染好气性杂菌
发酵时间
21
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CO2异常显示染菌
工艺一定，尾气中CO2量变化有一定规律 污染杂菌，糖耗加快，尾气中CO2量增加 污染噬菌体，糖耗减慢，尾气中CO2量减少
22
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2.污染噬菌体的检测
噬菌体是什么？
46
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常见的设备、管道“死角” 发酵罐的“死角”：不锈钢衬里破裂造成死角，
发酵罐罐底脓疱状积垢。
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法兰连接不当造成的“死角”
2021/3/20 .
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灭菌时蒸汽不易通达的“死角”及其消除方法
2021/3/20 .
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（4）设备渗漏染菌及防止 原因
发酵工业无菌技术演示教学
• 在连续发酵过程中，杂菌的生长速度有时会比 生产菌生长得更快，结果使发酵罐中以杂菌为 主；
• 杂菌及其产生的物质，使提取精制发生困难 • 杂菌会降解目的产物； • 杂菌会污染最终产品，杂菌会污染最终产品；
• 发酵时如污染噬菌体，可使生产菌发生溶菌现 象。
4，培养基灭菌的要求 （1）达到要求的无菌程度（10-3） （2）尽量减少营养成分的破坏，在灭菌过程中， 培养基组分的破坏，是由两个基本类型的反应引 起的： 培养基中不同营养成分间的相互作用； 对热不稳定的组分如氨基酸和维生素等的分解。
4.5.3空气过滤除菌
（一）、空气过滤除菌流程
1、高空采风、两次冷却、两次分油水、 适当加热流程
• 特点 ：两次冷却、两次分油水、适当加热。 空气第一次冷却到30～35℃，第二级冷却 至20～25℃，经分水后加热到30～35℃， 因为温度升高，相对湿度下降。
2、冷热空气直接混合式空气除菌流程
第四章 发酵工业的无菌技术
• 4.1 灭菌与消毒的区别
灭菌：用物理或化学方法杀死或除去环境中 所有微生物，包括营养细胞、细菌芽孢和 孢子
消毒：用物理或化学方法杀死物料、容器、 器皿内外的病源微生物。
• 培养基灭菌的目的
• 1，在发酵过程中夹杂其它杂菌造成的后果： • 生产菌和杂菌同时生长，生产菌丧失生产能力；
七、补料液的灭菌
在发酵过程中，往往要向发酵罐中补入各种不同的料液。这 些料液都必需经过灭菌。灭菌的方法则视料液的性质、体积和补 料速率而定。如果补料量较大，而具有连续性时，则采用连续灭 菌较为合适。也有利用过滤法对另补料液进行除菌。补料液的分 批灭菌，通常是向盛有物料的容器中直接通入蒸汽。所有的附属 设备和管道都要经过灭菌。
缺点 –设备比较复杂，投资较大。
• 杂菌及其产生的物质，使提取精制发生困难 • 杂菌会降解目的产物； • 杂菌会污染最终产品，杂菌会污染最终产品；
• 发酵时如污染噬菌体，可使生产菌发生溶菌现 象。
4，培养基灭菌的要求 （1）达到要求的无菌程度（10-3） （2）尽量减少营养成分的破坏，在灭菌过程中， 培养基组分的破坏，是由两个基本类型的反应引 起的： 培养基中不同营养成分间的相互作用； 对热不稳定的组分如氨基酸和维生素等的分解。
4.5.3空气过滤除菌
（一）、空气过滤除菌流程
1、高空采风、两次冷却、两次分油水、 适当加热流程
• 特点 ：两次冷却、两次分油水、适当加热。 空气第一次冷却到30～35℃，第二级冷却 至20～25℃，经分水后加热到30～35℃， 因为温度升高，相对湿度下降。
2、冷热空气直接混合式空气除菌流程
第四章 发酵工业的无菌技术
• 4.1 灭菌与消毒的区别
灭菌：用物理或化学方法杀死或除去环境中 所有微生物，包括营养细胞、细菌芽孢和 孢子
消毒：用物理或化学方法杀死物料、容器、 器皿内外的病源微生物。
• 培养基灭菌的目的
• 1，在发酵过程中夹杂其它杂菌造成的后果： • 生产菌和杂菌同时生长，生产菌丧失生产能力；
七、补料液的灭菌
在发酵过程中，往往要向发酵罐中补入各种不同的料液。这 些料液都必需经过灭菌。灭菌的方法则视料液的性质、体积和补 料速率而定。如果补料量较大，而具有连续性时，则采用连续灭 菌较为合适。也有利用过滤法对另补料液进行除菌。补料液的分 批灭菌，通常是向盛有物料的容器中直接通入蒸汽。所有的附属 设备和管道都要经过灭菌。
缺点 –设备比较复杂，投资较大。
【发酵工程】第四章_发酵工业无菌技术
柠檬酸发酵 （分别处理） a.污染细菌：加大通风，加速产酸，调pH3.0以 下，抑制细菌生长。 b.污染酵母：加入0.025~0.035g/L CuSO4抑制酵 母；通风加大，加速产酸。 c.染黄曲霉：加入另一罐将近发酵成熟的醪液， pH下降，黄曲霉自溶。
d.染青霉菌：在pH很低下能够生长。提前放罐。
2、污染原因分析
主要原因： ① 种子带菌 ② 无菌空气带菌 ③ 设备渗漏 ④ 灭菌不彻底 ⑤ 操作失误 ⑥ 技术管理不善
从污染时间看：早期污染可能与①②④⑤→接 种操作不当有关；后期污染可能与③⑤及中间 补料有关。 从染菌幅度看：各个发酵罐或多数发酵罐染菌， 且所污染的是同一种杂菌，一般是空气系统问 题，若个别罐连续染菌，一般是设备问题。
五、过滤灭菌法
原理：利用过滤方法阻留微生物以达到除菌的 目的。 适宜对象：不耐高温的液体培养基组分和空气 过滤除菌。
六、火焰灭菌法
原理：利用火焰直接杀死微生物以达到除菌的 目的。 优点：方法简单，灭菌彻底。 适宜对象：金属器具（接种针、接种环、接种 铲、小刀及镊子）和玻璃器具灭菌。
第四节
1）一般紫外线杀灭； 2）如有较多的细菌，用石碳酸或土霉素杀灭； 3）如有较多的霉菌，用制霉菌素杀灭； 4）如有噬菌体，用甲醛、双氧水或高锰酸钾等杀灭。
B、过滤空气带菌的防治 从空气的除菌净化流程和设备的设计、过滤介 质的选用和填装，以及过滤介质的灭菌和管理 等方面完善空气净化系统。
1）正确选择采气口 提高采气口的位置或安装前置粗过滤器，提高空压机 进口空气的洁净度。 2）设计合理的空气预处理流程，尽可能减少过滤空气的 含油量和湿度，提高温度，保持过滤介质的干燥状态。
发酵工业的无菌技术
间 1.设备要求低，不需另外 1.培养基的营养物质损 加热、冷却装置。 失大，灭菌后培养基 歇 质量下降 灭 2.操作要求低，适合小批 量生产规模 2.发酵罐的利用率较低 菌
3.适合含大量固体物料的 3.不适合大规模生产的 灭菌 灭菌
作业
1、连续灭菌的流程与设备 2、对数残留定律 3、分批灭菌、连续灭菌 4、P273第8题
二、影响培养基灭菌的因素p68
杂菌的种类与数量 灭菌温度与时间 培养基成分 pH值 培养基中的颗粒 泡沫
培养基成分
油脂、糖类及一定浓度的蛋白质增加微生物的耐热性 在固形物含量高的情况下，灭菌温度可高些。 环境 耐热性 60～65℃便死亡
水
大肠杆菌
10％糖液
30％糖液
70℃，4～6min
喷射加热连续灭菌流程
薄板换热器连续灭菌流程
3、灭菌时间的计算 ㏑(Ct/C0)=－kt t=2.303 [lg(C0/Ct)] /k 式中：C0、Ct分别为单位体积培养基灭菌前、 后的含菌数。
例2．某发酵罐内装40m3培养基，采用连续灭菌， 灭菌温度为1310C，原污染程度为每1ml含有 2×105个杂菌，已知1310C时灭菌速度常数为 15min-1，求灭菌所需的维持时间。
解：C0=2×105(个/ml)
Ct=0.001/(40×106)=2.5×10-11(个/ml)
t=2.303 [lg(C0/Ct)] /k=2.303×lg[(2×105)/(2.5×10-11)]
/15 =2.37 min
间歇灭菌与连续灭菌的比较
优 点 缺 点
连 1.高温短时灭菌，培养基 1.设备复杂，操作麻烦, 营养成分损失少。 染菌机会多。 续 灭 2.发酵罐占用时间缩短， 2.不适合含大量固体物 利用率高。 料的灭菌。 菌
3.适合含大量固体物料的 3.不适合大规模生产的 灭菌 灭菌
作业
1、连续灭菌的流程与设备 2、对数残留定律 3、分批灭菌、连续灭菌 4、P273第8题
二、影响培养基灭菌的因素p68
杂菌的种类与数量 灭菌温度与时间 培养基成分 pH值 培养基中的颗粒 泡沫
培养基成分
油脂、糖类及一定浓度的蛋白质增加微生物的耐热性 在固形物含量高的情况下，灭菌温度可高些。 环境 耐热性 60～65℃便死亡
水
大肠杆菌
10％糖液
30％糖液
70℃，4～6min
喷射加热连续灭菌流程
薄板换热器连续灭菌流程
3、灭菌时间的计算 ㏑(Ct/C0)=－kt t=2.303 [lg(C0/Ct)] /k 式中：C0、Ct分别为单位体积培养基灭菌前、 后的含菌数。
例2．某发酵罐内装40m3培养基，采用连续灭菌， 灭菌温度为1310C，原污染程度为每1ml含有 2×105个杂菌，已知1310C时灭菌速度常数为 15min-1，求灭菌所需的维持时间。
解：C0=2×105(个/ml)
Ct=0.001/(40×106)=2.5×10-11(个/ml)
t=2.303 [lg(C0/Ct)] /k=2.303×lg[(2×105)/(2.5×10-11)]
/15 =2.37 min
间歇灭菌与连续灭菌的比较
优 点 缺 点
连 1.高温短时灭菌，培养基 1.设备复杂，操作麻烦, 营养成分损失少。 染菌机会多。 续 灭 2.发酵罐占用时间缩短， 2.不适合含大量固体物 利用率高。 料的灭菌。 菌
生物化学 第四章 发酵工业的无菌技术
BEIJING INSTITUTE OF PETROCHEMICAL TECHNOLOGY
第四章 发酵工业的无菌技术
湿热：121 ℃ 0.1MPa 20～30分钟饱和蒸汽 高温瞬间灭菌法 干热：160℃ 1小时 烧灼 巴斯德消毒法 冷冻 冷藏
温度
HIST灭菌法：温度升高时，微生物死亡速率常数远远大于 营养成分分解速率常数，因而可以采用在较高温度下缩短灭菌 时间而减少营养成分的损失。
BEIJING INSTITUTE OF PETROCHEMICAL TECHNOLOGY
第四章 发酵工业的无菌技术
第二节 培养基灭菌——分批灭菌和连续灭菌 一、分批灭菌（间歇灭菌）
dN dt
kN
t 2 . 303 /( k lg
N0 Nt
)
BEIJING INSTITUTE OF PETROCHEMICAL TECHNOLOGY
生物化工基础
第四章 发酵工业的无菌技术
化工学院 应用化学系 沈齐英
BEIJING INSTITUTE OF PETROCHEMICAL TECHNOLOGY
第四章 发酵工业的无菌技术
第一节 概述 灭菌：用物理或化学方法杀灭或清除设备及物料中所有 微生物的技术。 消毒：用物理或化学方法杀灭或清除致病微生物的技术。 防腐：防止或抑制微生物生长的方法。 温度 湿度 物理 射线 过滤 消毒剂 方法 化学 防腐剂 化学治疗剂 生物
t 2 . 303 ( k lg
N0 Nt
第四章 发酵工业的无菌技术
BEIJING INSTITUTE OF PETROCHEMICAL TECHNOLOGY
第四章 发酵工业的无菌技术
第三节 空气除菌 空气过滤除菌是发酵工业中最常用、最经济的方法。 解决： 1、压缩空气及其 冷却 2、除水
第四章 发酵工业的无菌技术
湿热：121 ℃ 0.1MPa 20～30分钟饱和蒸汽 高温瞬间灭菌法 干热：160℃ 1小时 烧灼 巴斯德消毒法 冷冻 冷藏
温度
HIST灭菌法：温度升高时，微生物死亡速率常数远远大于 营养成分分解速率常数，因而可以采用在较高温度下缩短灭菌 时间而减少营养成分的损失。
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第四章 发酵工业的无菌技术
第二节 培养基灭菌——分批灭菌和连续灭菌 一、分批灭菌（间歇灭菌）
dN dt
kN
t 2 . 303 /( k lg
N0 Nt
)
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生物化工基础
第四章 发酵工业的无菌技术
化工学院 应用化学系 沈齐英
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第四章 发酵工业的无菌技术
第一节 概述 灭菌：用物理或化学方法杀灭或清除设备及物料中所有 微生物的技术。 消毒：用物理或化学方法杀灭或清除致病微生物的技术。 防腐：防止或抑制微生物生长的方法。 温度 湿度 物理 射线 过滤 消毒剂 方法 化学 防腐剂 化学治疗剂 生物
t 2 . 303 ( k lg
N0 Nt
第四章 发酵工业的无菌技术
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第四章 发酵工业的无菌技术
第三节 空气除菌 空气过滤除菌是发酵工业中最常用、最经济的方法。 解决： 1、压缩空气及其 冷却 2、除水
第四章 发酵工业的无菌技术 2
第四章发酵工业的无菌技术内容提要•常用技术概念•发酵工业污染的防治策略•发酵工业的无菌技术•发酵培养基及设备管道的灭菌•空气除菌目前，绝大多数的工业发酵都采用纯种培养，即发酵全过程只有生产菌，不允许有“杂菌”污染。
为了保障纯种发酵的顺利进行，在进行生产菌接种之前，必须对整个发酵系统进行灭菌，对发酵环境进行消毒，防治杂菌和噬菌体的感染。
在实际生产中，为了防止杂菌污染，而采用的消毒和灭菌技术，统称为发酵工业的无菌技术。
一般采用“污染概率”作为评价标准。
发酵工业中允许的染菌概率为10-3，即灭菌1000批次的发酵中只允许有1次染菌。
一、常用技术概念几个容易混淆的概念说明：1、灭菌：指用物理或化学的方法杀死物料或设备中所有生命物质的过程。
2、消毒：指用物理或化学的方法杀死空气、地表以及容器和器具表面的微生物。
3、除菌：指用过滤的方法去除空气或液体中的微生物及其孢子。
4、防腐：指指用物理或化学的方法杀死或抑制微生物的生长和繁殖。
灭菌和消毒的区别和主要用途。
二、发酵工业污染的防治策略（一）、污染的危害1、污染杂菌，造成培养基的异常消耗，生产菌的生产能力下降；2、杂菌合成的代谢产物改变发酵环境，造成产物收率降低或质量下降；3、杂菌代谢产物使发酵系统的PH变化，造成生产菌自溶；4、杂菌分解产物，使发酵失败；5、噬菌体污染，造成生产菌细胞破裂，发酵失败。
目前，国内抗生素发酵，如青霉素发酵染菌率为2%；链霉素、红霉素和四环霉素发酵染菌率为5%；谷氨酸发酵噬菌体感染率为1%-2%。
（二）、发酵生产的产品不同，染菌的种类和性质不同、染菌发生的时间、染菌的途径和程度各不同。
1、不同种类的杂菌对发酵的影响（1）、细菌发酵：发酵周期短。
主要防止噬菌体感染。
例如：谷氨酸发酵菌种：棒状杆菌营养缺陷型细菌发酵（2）、霉菌发酵：发酵周期较细菌发酵长，产物类型各不相同。
主要防止细菌感染。
例如：青霉素发酵——水解产物。
（3）、酵母菌发酵：发酵周期最长。
发酵工程第四章发酵工业的无菌技术
15
3）发酵中期染菌
➢ 发酵中期染菌，处理困难，危害很大。
➢发酵中期染菌会严重干扰产生菌的代谢。杂菌大量 产酸，培养液pH下降；糖、氮消耗快，发酵液发粘， 菌丝自溶，产物分泌减少或停止，有时甚至会使已产 生的产物分解。有时也会使发酵液发臭，产生大量泡 沫。
➢措施 降温培养，减少补料，密切注意代谢变化情况 。如果发酵单位到达一定水平可以提前放罐，或者抗 生素生产中可以将高单位的发酵液输送一部分到染菌 罐，抑制杂菌。
18
➢污染杂菌的种类对过滤的影响程度有差异，如 污染霉菌时，影响较小，而污染细菌时很难过 滤。由于过滤困难，过滤时间拉长，影响发酵 液储罐和过滤设备的周转使用，破坏了生产平 衡。染菌发酵液还会因过滤困难而大幅度降低 过滤收率，直接影响提取总收率。
19
丝状菌发酵被产酸菌污染：pH不断下降，菌丝大量自溶， 发酵液粘度增加，过滤困难
2
控制有害微生物主要有以下几种措施：
杀灭一切微生物 杀灭病原微生物
3
比较项目 处理因素
处理对象
灭菌
消毒
防腐
化疗
强、理化因 素
任何物体内 外
理、化因素
生物体表， 酒、乳等
理、化因素
有机物体内 外
化学治疗剂 宿主体内
微生物类型 一切微生物 有关病原菌 一切微生物 有关病原菌
对微生物作 彻底杀灭 用
杀死或抑制 抑制或杀死 抑制或杀死
7
A．细菌 谷氨酸(棒状杆菌)：发酵周期短，培养基不
太丰富，较少染杂菌，但噬菌体威胁大。 肌苷（枯草杆菌）：缺陷型生产菌，培养基
丰富，易染菌，营养成分迅速被消耗，严重 抑制菌生长和合成代谢产物。
8
B. 霉菌 PenG：绝大多数杂菌都能直接产生青霉素酶，而
3）发酵中期染菌
➢ 发酵中期染菌，处理困难，危害很大。
➢发酵中期染菌会严重干扰产生菌的代谢。杂菌大量 产酸，培养液pH下降；糖、氮消耗快，发酵液发粘， 菌丝自溶，产物分泌减少或停止，有时甚至会使已产 生的产物分解。有时也会使发酵液发臭，产生大量泡 沫。
➢措施 降温培养，减少补料，密切注意代谢变化情况 。如果发酵单位到达一定水平可以提前放罐，或者抗 生素生产中可以将高单位的发酵液输送一部分到染菌 罐，抑制杂菌。
18
➢污染杂菌的种类对过滤的影响程度有差异，如 污染霉菌时，影响较小，而污染细菌时很难过 滤。由于过滤困难，过滤时间拉长，影响发酵 液储罐和过滤设备的周转使用，破坏了生产平 衡。染菌发酵液还会因过滤困难而大幅度降低 过滤收率，直接影响提取总收率。
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丝状菌发酵被产酸菌污染：pH不断下降，菌丝大量自溶， 发酵液粘度增加，过滤困难
2
控制有害微生物主要有以下几种措施：
杀灭一切微生物 杀灭病原微生物
3
比较项目 处理因素
处理对象
灭菌
消毒
防腐
化疗
强、理化因 素
任何物体内 外
理、化因素
生物体表， 酒、乳等
理、化因素
有机物体内 外
化学治疗剂 宿主体内
微生物类型 一切微生物 有关病原菌 一切微生物 有关病原菌
对微生物作 彻底杀灭 用
杀死或抑制 抑制或杀死 抑制或杀死
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A．细菌 谷氨酸(棒状杆菌)：发酵周期短，培养基不
太丰富，较少染杂菌，但噬菌体威胁大。 肌苷（枯草杆菌）：缺陷型生产菌，培养基
丰富，易染菌，营养成分迅速被消耗，严重 抑制菌生长和合成代谢产物。
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B. 霉菌 PenG：绝大多数杂菌都能直接产生青霉素酶，而
第四章-发酵工业的无菌技术
2024/7/17
8
（3）不同发酵时期染菌对发酵的影响
种子扩大时期染菌:
易染菌、应灭菌后除去，并对种子罐、管道进行检查和彻底灭菌。
发酵前期染菌： 应迅速重新灭菌，补充必要的营养成分，重新接种
发酵中期染菌：挽救困难，应早发现，快处理 ，处理方法应根据 各种发酵的特点和具体情况来决定 ▪ 抗生素发酵
=20.34(min)
由于升温阶段就有部分菌被杀灭，特别是当培 养基加热至1000C以上，这个作用较为显著，故实际保 温阶段时间比计算值要短。
2024/7/17
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（三）连续灭菌（连消）
工艺流程 喷淋冷却连续灭菌流程 喷射加热连续灭菌流程 薄板式换热器连续灭菌流程
灭菌时间的计算 ㏑(Ct/C0)=－kt t=2.303/k[lg(C0/Ct)] 式中：C0、Ct分别为单位体积培养基灭菌前、 后的含菌数。
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2. 污染原因分析
从污染时间看：早期污染可能与①②④⑤→接种操作不当有关； 后期污染可能与③⑤及中间补料有关。
从杂菌种类看： 耐热芽孢杆菌：与④有关 球菌、无芽孢杆菌：与① ② ③⑤有关 浅绿色菌落的杂菌：与水有关，即冷却盘管渗漏 霉菌：与④⑤有关，即无菌室灭菌不彻底或操作问题 酵母菌：糖液灭菌不彻底或放置时间较长
从染菌幅度看：各个发酵罐或多数发酵罐染菌，且所污染的是同 一种杂菌，一般是空气系统问题，若个别罐连续染菌，一般是设 备问题。
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3. 预防
种子带菌的防治 灭菌彻底 接种可靠：无菌室及设备可靠，无菌操作 可靠 保藏可靠
过滤空气带菌的防治（第五节“空气除菌”） 设备的渗漏或“死角”造成的染菌及其防治
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对无菌是很难做到的，也是不必要的。因此 在工程设计中常取N=10-3。
• 二、分批灭菌
• 分批灭菌的设计
在发酵罐中进行实罐灭菌，是典型的分 批灭菌。全过程包括升温、保温、降温三个 过程。
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孢子热死亡的规律符合
d d N tkN
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积分得（8）
ln N N 0 K t
在分批灭菌过程中
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4.4发酵培养基及设备管道灭菌
• 4.4.1湿热灭菌原理
湿热灭菌中的相关定义
杀死微生物的极限温度称为致死温度。在致死温度下，杀死 全部微生物所需的时间称为致死时间；在致死温度以上，温度 愈高，致死时间愈短。
微生物的热阻：是指微生物在某一特定条件（主要是温度和加 热方式）下的致死时间。相对热阻是指某一微生物在某条件下 的致死时间与另一微生物在相同条件下的致死时间的比值。
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实验证明，微生物营养细胞的均相热死灭动力学符合化学反应的 一级反应动力学，即：
d d N tkN 1
N：任一时刻的活细菌浓度（个/L） t：时间（min） 活菌的减少率与N的关系
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K：比热死速率常数（min-1） 取边界条件t=0，N=N0，对（1）积分得 或
ln N N 0 K t 2
一，培养基湿热灭菌需解决的工程问题 1.将培养基中的杂菌总数N0 杀灭到可以接受的总数N（10－3）， 需要多高的温度、多长的时间为合理。 2.灭菌温度和时间的确定取决于： （1）杂菌孢子的热灭死动力学 （2）反应器的形式和操作方式 （3）培养基中有效成分受热破坏的可接受范围
二、微生物的热死灭动力学方程
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6
4.2.2杂菌污染的防治
• 杂菌的检查与类型判断
显微镜检查法
平板划线培养
肉汤培养
发酵过程的异常观察法：溶解氧水平异常变化、通过 传变感化器或取样分析观察PH的变化、尾气中CO2异常
污染的原因分析
种子带菌、空气带菌、设备渗漏、灭菌不彻底、操作 失误和技术管理不善
分析污染杂菌的种类
分析污染杂菌的时间
灭菌温度0C 100 110 115 120 130 145 150
灭菌时间min 400 36 15 4 0.5 0.08 0.01
营养成分破坏率（％） 99.3 67 50 27 8 2 1
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4.4.2 培养基灭菌的工程设计
• 一、无菌的标准 • 根据微生物热死灭方程，要求灭菌后达到绝
分析污染杂菌的程度
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7
• 杂菌污染的途径及其预防 种子带菌及其预防： 1.培养基及其器具彻底灭菌 2.避免菌种在移接中污染 3.避免菌种在培养和保藏中污染 过滤空气带菌及其防治 设备的渗漏或死角染菌及其防治 培养基灭菌不彻底导致染菌及其防治 操作不当造成染菌 噬菌体染菌及其防治
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4，培养基灭菌的要求 （1）达到要求的无菌程度（10-3） （2）尽量减少营养成分的破坏，在灭菌过程中， 培养基组分的破坏，是由两个基本类型的反应引 起的： 培养基中不同营养成分间的相互作用； 对热不稳定的组分如氨基酸和维生素等的分解。
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4.2发酵工业污染的防治策略
4.2.1污染的危害
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各种微生物对湿热的相对热阻
微生物 相对 热阻
营养细 1.0
胞和酵 3×1
母
06
细ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ芽 2~1
孢 霉湿菌孢热灭01菌~5的优点
子 病蒸蒸蒸毒汽汽汽和来有有源强很容的大易穿的，透潜操力热作，；费灭用菌低易，于本彻身底无；毒； 噬操菌作体方便，易管理。
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4.4.1湿热灭菌的理论基础
• 在连续发酵过程中，杂菌的生长速度有时会比 生产菌生长得更快，结果使发酵罐中以杂菌为 主；
• 杂菌及其产生的物质，使提取精制发生困难
• 杂菌会降解目的产物；
• 杂菌会污染最终产品，杂菌会污染最终产品；
• 发酵时如污染噬菌体，可使生产菌发生溶菌现 象。
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3
2，工业上具体措施包括： （1）使用的培养基和设备须经灭菌； （2）好氧培养中使用的空气须除菌处理； （3）设备应严密，发酵罐维持正压环境； （4）培养过程中加入的物料应经过灭菌； （5）使用无污染的纯粹种子。 3，培养基灭菌的目的 杀灭培养基中的微生物，为后续发酵过程创造无 菌的条件。
8
lN N 0 n lN N 0 n N N 1 2 N N 2 lN N 0 n lN N 1 2 n lN N 2 n9
因为升温、冷却阶段T是时间t的函数，K不是常数，所以：
4.3发酵工业的无菌技术
• 工业上具体措施包括： • （1）使用的培养基和设备须经灭菌； • （2）好氧培养中使用的空气应经除菌处理； • （3）设备应严密，发酵罐维持正压环境； • （4）培养过程中加入的物料应经过灭菌； • （5）使用无污染的纯粹种子。
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• 灭菌的方法
• （1）化学法 • 化学药品灭菌法 • （2）物理法 • 干热灭菌法 • 湿热灭菌法 • 射线灭菌法 • 过滤除菌法 • 火焰灭菌法
N N 0 e Kt 3
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• lnN0/N=kt
2.303logN0/N=kt
t=2.303 /k logN0/N 对数残存规律 工厂的经验数据，高温灭菌时间15－30s,
维持8－25min。
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• 培养基达到完全灭菌时，灭菌温度和灭菌时间对培养基养分 破坏的比较（以VitB1为准）
第四章 发酵工业的无菌技术
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1
• 4.1 灭菌与消毒的区别
灭菌：用物理或化学方法杀死或除去环境中 所有微生物，包括营养细胞、细菌芽孢和 孢子
消毒：用物理或化学方法杀死物料、容器、 器皿内外的病源微生物。
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2
• 培养基灭菌的目的
• 1，在发酵过程中夹杂其它杂菌造成的后果：
• 生产菌和杂菌同时生长，生产菌丧失生产能力；
1.使生物反应的基质或产物，因杂菌的消耗而 损失，造成生产能力的下降。
2. 杂菌也会产生代谢产物，这就使产物的提取 更加困难，造成得率降低，产品质量下降。
3. 有些杂菌会分解产物，使生产失败。 4. 杂菌大量繁殖后，会改变反应液的pH值，使
反应异常。 5. 如果发生噬菌体污染，生产菌细胞将被裂解，
使生产失败。
• 二、分批灭菌
• 分批灭菌的设计
在发酵罐中进行实罐灭菌，是典型的分 批灭菌。全过程包括升温、保温、降温三个 过程。
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孢子热死亡的规律符合
d d N tkN
7
积分得（8）
ln N N 0 K t
在分批灭菌过程中
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4.4发酵培养基及设备管道灭菌
• 4.4.1湿热灭菌原理
湿热灭菌中的相关定义
杀死微生物的极限温度称为致死温度。在致死温度下，杀死 全部微生物所需的时间称为致死时间；在致死温度以上，温度 愈高，致死时间愈短。
微生物的热阻：是指微生物在某一特定条件（主要是温度和加 热方式）下的致死时间。相对热阻是指某一微生物在某条件下 的致死时间与另一微生物在相同条件下的致死时间的比值。
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实验证明，微生物营养细胞的均相热死灭动力学符合化学反应的 一级反应动力学，即：
d d N tkN 1
N：任一时刻的活细菌浓度（个/L） t：时间（min） 活菌的减少率与N的关系
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K：比热死速率常数（min-1） 取边界条件t=0，N=N0，对（1）积分得 或
ln N N 0 K t 2
一，培养基湿热灭菌需解决的工程问题 1.将培养基中的杂菌总数N0 杀灭到可以接受的总数N（10－3）， 需要多高的温度、多长的时间为合理。 2.灭菌温度和时间的确定取决于： （1）杂菌孢子的热灭死动力学 （2）反应器的形式和操作方式 （3）培养基中有效成分受热破坏的可接受范围
二、微生物的热死灭动力学方程
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4.2.2杂菌污染的防治
• 杂菌的检查与类型判断
显微镜检查法
平板划线培养
肉汤培养
发酵过程的异常观察法：溶解氧水平异常变化、通过 传变感化器或取样分析观察PH的变化、尾气中CO2异常
污染的原因分析
种子带菌、空气带菌、设备渗漏、灭菌不彻底、操作 失误和技术管理不善
分析污染杂菌的种类
分析污染杂菌的时间
灭菌温度0C 100 110 115 120 130 145 150
灭菌时间min 400 36 15 4 0.5 0.08 0.01
营养成分破坏率（％） 99.3 67 50 27 8 2 1
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4.4.2 培养基灭菌的工程设计
• 一、无菌的标准 • 根据微生物热死灭方程，要求灭菌后达到绝
分析污染杂菌的程度
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• 杂菌污染的途径及其预防 种子带菌及其预防： 1.培养基及其器具彻底灭菌 2.避免菌种在移接中污染 3.避免菌种在培养和保藏中污染 过滤空气带菌及其防治 设备的渗漏或死角染菌及其防治 培养基灭菌不彻底导致染菌及其防治 操作不当造成染菌 噬菌体染菌及其防治
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4，培养基灭菌的要求 （1）达到要求的无菌程度（10-3） （2）尽量减少营养成分的破坏，在灭菌过程中， 培养基组分的破坏，是由两个基本类型的反应引 起的： 培养基中不同营养成分间的相互作用； 对热不稳定的组分如氨基酸和维生素等的分解。
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4.2发酵工业污染的防治策略
4.2.1污染的危害
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各种微生物对湿热的相对热阻
微生物 相对 热阻
营养细 1.0
胞和酵 3×1
母
06
细ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ芽 2~1
孢 霉湿菌孢热灭01菌~5的优点
子 病蒸蒸蒸毒汽汽汽和来有有源强很容的大易穿的，透潜操力热作，；费灭用菌低易，于本彻身底无；毒； 噬操菌作体方便，易管理。
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4.4.1湿热灭菌的理论基础
• 在连续发酵过程中，杂菌的生长速度有时会比 生产菌生长得更快，结果使发酵罐中以杂菌为 主；
• 杂菌及其产生的物质，使提取精制发生困难
• 杂菌会降解目的产物；
• 杂菌会污染最终产品，杂菌会污染最终产品；
• 发酵时如污染噬菌体，可使生产菌发生溶菌现 象。
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2，工业上具体措施包括： （1）使用的培养基和设备须经灭菌； （2）好氧培养中使用的空气须除菌处理； （3）设备应严密，发酵罐维持正压环境； （4）培养过程中加入的物料应经过灭菌； （5）使用无污染的纯粹种子。 3，培养基灭菌的目的 杀灭培养基中的微生物，为后续发酵过程创造无 菌的条件。
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lN N 0 n lN N 0 n N N 1 2 N N 2 lN N 0 n lN N 1 2 n lN N 2 n9
因为升温、冷却阶段T是时间t的函数，K不是常数，所以：
4.3发酵工业的无菌技术
• 工业上具体措施包括： • （1）使用的培养基和设备须经灭菌； • （2）好氧培养中使用的空气应经除菌处理； • （3）设备应严密，发酵罐维持正压环境； • （4）培养过程中加入的物料应经过灭菌； • （5）使用无污染的纯粹种子。
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• 灭菌的方法
• （1）化学法 • 化学药品灭菌法 • （2）物理法 • 干热灭菌法 • 湿热灭菌法 • 射线灭菌法 • 过滤除菌法 • 火焰灭菌法
N N 0 e Kt 3
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• lnN0/N=kt
2.303logN0/N=kt
t=2.303 /k logN0/N 对数残存规律 工厂的经验数据，高温灭菌时间15－30s,
维持8－25min。
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• 培养基达到完全灭菌时，灭菌温度和灭菌时间对培养基养分 破坏的比较（以VitB1为准）
第四章 发酵工业的无菌技术
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• 4.1 灭菌与消毒的区别
灭菌：用物理或化学方法杀死或除去环境中 所有微生物，包括营养细胞、细菌芽孢和 孢子
消毒：用物理或化学方法杀死物料、容器、 器皿内外的病源微生物。
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• 培养基灭菌的目的
• 1，在发酵过程中夹杂其它杂菌造成的后果：
• 生产菌和杂菌同时生长，生产菌丧失生产能力；
1.使生物反应的基质或产物，因杂菌的消耗而 损失，造成生产能力的下降。
2. 杂菌也会产生代谢产物，这就使产物的提取 更加困难，造成得率降低，产品质量下降。
3. 有些杂菌会分解产物，使生产失败。 4. 杂菌大量繁殖后，会改变反应液的pH值，使
反应异常。 5. 如果发生噬菌体污染，生产菌细胞将被裂解，
使生产失败。