(完整版)动物免疫抗体血清学检测技术

动物疫病免疫抗体 血清学检测方法
2019.5.10
内容
一、血清学检测的意义 二、血清学检测内容和方法 三、血凝和血凝抑制实验 四、酶联免疫吸附实验 五、虎红平板凝集实验（初筛）
一、血清学检测的意义
动物免疫接种已经成为目前防御疫病传播的首选措施，只有给动 物进行有效的免疫接种后，才能产生一定的保护力，从而防止疫 病的侵入和蔓延。因此在群体接种疫苗前后对抗体水平进行检测， 准确了解动物疫病发生、传播和流行情况，掌握畜禽免疫抗体水 平和动物疫病保护情况， 从而更有效地采取综合防控措施。因此， 做好动物免疫抗体检测工作有着十分重要的临床意义和经济意义。
血凝素（HA） 柱状
血凝试验（HA)原理：
血凝抑制试验：
当病毒的悬液中先加入特异性抗体，且这种抗体的量足以抑制病毒颗粒或 其血凝素，则红细胞表面的受体就不能与病毒颗粒或其血凝素直接接触。 这时红细胞的凝集现象就被抑制，称为红细胞凝集抑制反应，也称血凝抑 制反应，利用这种特性设计的试验称血凝抑制试验 (HI) 。 该试验是目前WHO进行全球流感监测所普遍采用的试验方法。 目的：检测有无病毒感染和免疫状态。
注意的关键点是：加样不可太快，要避免加在孔壁上部，不可溅出和产生气泡。 加样太快，无法保证微量加样的准确性和均一性。加在孔壁上部的非包被区，易 导致非特异吸附。溅出会对邻近孔产生污染。出现气泡则反应液界面有差异。
ELISA的比色测定主要由酶标仪进行。此处强调以下 几点：
（1）酶标仪不应安置在阳光或强光照射下，室温宜 在15－30℃，使用前先预热仪器15－30分钟，测读 结果更稳定。各种酶标仪性能不同，使用前应详细 阅读说明书。
血凝试验操作步骤
4个100%血凝单位（即4HA100） 抗原的稀释倍数=使100%红细胞凝集的抗原最高稀释倍数/4
四单位抗原是血凝抑制试验的重要环节，其准确性对 试验结果有重要的影响。抗原浓度高时，HI抗体效价 就会降低；反之则会有所升高。抗原效价测量是否准 确，决定了配制而得的四单位抗原准确性。
血凝抑制试验操作步骤
血凝抑制试验结果判定
以完全抑制红细胞凝集的血清最大稀释度为该血清的 HI滴度（注：看结果时96孔板倾斜45度）。
确定度数的孔要与前一孔的流速及形状完全一样，即 泪珠样流挂。读数要快，可以读到结束，一组（一 板）时间不要超过30秒。
禽流感：免疫21天后HI抗体效价≥4为免疫合格 鸡新城疫：免疫21天后，抗体效价≥5判定为合格
酶联免疫吸附实验 ELISA
猪瘟 O型口蹄疫 A型口蹄疫 地方病：蓝耳、 细小、圆环、伪 狂犬、乙脑 小反刍兽疫
虎红平板凝集 实验（初筛）
布病
三、血凝与血凝抑制实验（禽流感和鸡新城疫）
用已知抗原来检测被检血清中有无相应的特异性抗体和滴 定该特异性抗体的水平。
血凝试验：某种病毒的血凝素，能 使鸡、鹅或人的红细胞发生凝集， 叫做血凝试验，也称直接血凝反应， 利用这种特性设计的试验称血凝试 验 (HA) 。
常见于正粘病毒（禽流感）、副粘 病毒（新城疫）和某些黄病毒、痘 病毒等。
目的：测定病毒的血凝效价，通常采 用4个血凝单位
血凝素（HA） 柱状
刺突：亚型特异性抗原，易变异
血凝素（HA，从H1—H15):呈柱状 功能：
①吸附细胞：与细胞上受体结合,使病毒侵入细胞 ②凝集多种动物的红细胞（血凝试验） ③具抗原性：其抗体能中和病毒---中和抗体抑制血凝（血凝抑制 试验）
阿氏（Alsevers）液配制
称量葡萄糖2.05g、柠檬酸钠0.8g、柠檬酸 0.055g、氯化钠0.42g，加蒸馏水至100mL，散 热溶解后调pH值至6.1，69kPa 15min高压灭菌， 4℃保存备用。
1%红细胞的配制
1.准备好试验所需的所有材料，包括离 心管、低速离心机、试管架、PBS缓 冲液（生理盐水）、注射器、100ml 大青瓶及塞子等等。
判定 在阴、阳性血清对照成立的条件下，方可对被检血清进
行判定。 受检血清在4min内出现肉眼可见的凝集现象者判为阳性
（+），无凝集现象，呈均匀粉红色者判为（-）。
非常感谢您的聆听
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（2）比色前应先用洁净的吸水纸拭干板底附着的液 体，然后将板正确放入比色架中，以免锈蚀酶标仪 比色架。
（3）比色测定时，一定要注意酶标仪的波长是否已 调至合适或所用滤光片是否正确。
未来：全自动酶免工作站
1、加 样 模 块 2、孵 育 模 块 3、洗 板 模 块 4、读 数 模 块 5、控 制 模 块（软件） 全自动--从加样、孵育、洗涤到数据 处理打印报告都由仪器自动完成； 无污染--直接使用原样本试管和原试 剂瓶，消除生物污染和试剂污染； 高效率--一次性处理样本量大；
间接ELISA基本原理
其原理是将抗原连接到固相载体上，样品中待测抗体与之结 合成固相抗原受检抗体复合物，再用酶标二抗（针对受检抗 体的抗体）与固相免疫复合物中的抗体结合，形成固相抗原 -受检抗体- 酶标二抗复合物，可用目测或用分光光度计定 量测定加底物后的显色程度，确定待测抗体含量。
举例：间接ELISA检测猪瘟病毒抗体试验 实验准备
2.抗凝血第一次离心。用注射器采集若干毫升抗凝鸡 （鸭）血，根据需要确定。将抗凝血缓慢注入离心管 内，盖好盖子后将离心管放入离心机，配平后 1500r/min离心5min，离出抗凝剂及血浆等。
1%红细胞的配制
3.第一次离心结束后，将上层液体及白细胞层用注射器吸出，加入适 量PBS缓冲液，配平后进行第二次离心，1500r/min离心5min，进一 步清洗红细胞。
○酶标仪
烘箱
微量移液器
诊断试剂
吸水纸
各种类型ELISA测定时一般需经过这些步骤： 加待测样品→温育→洗涤+加酶标物→温育→洗涤→加底物 →温育一加终止液→比色→判定结果。
样品、 标准品 以及试 剂准备
加样
孵育
洗板
结果分 析
比色
显色
试剂盒从冷藏环境中取出时，必须平衡 至室温后，方可开封启用。
重要性
有效预防动物 疫情的发生
动物疫情普遍存在传染性，容易扩散，当发生动物疫情 时，动物免疫抗体的监测，能够让我们了解疫情发展的 情况，能够对控制疫情起到积极作用
有效判断动物疫 动物免疫抗体监测，能够为疫情发生时提供有效的数据， 情发生的原因 在第一时间找到疫情原因，有针对性的做出疫情控制。
动物免疫抗体检测能够提供科学依据，让兽医技术人员
4.第二次离心结束后，同样吸出上层液体及白细胞层，再加入适量 PBS缓冲液，配平后进行第三次离心，2000r/min离心10min，进一步 清洗红细胞。
5.离心结束，最后一次吸出上层清液。量取 99mlPBS缓冲液加入100ml大青瓶（或其他容 器），用注射器（或其他，如吸管）吸取1ml洗 净的红细胞，缓慢加入99mlPBS缓冲液中，塞紧 瓶塞。
材料准备 抗原、标准阳性血清、阴性血清由制标单位提供，按说明书使用 受检血清应新鲜，无明显蛋白凝块，无溶血和腐败气味 虎红平板凝集反应纸 吸头，适用于滴加0.03ml 牙签或火柴杆，供搅拌用
操作方法 将虎红平板纸上加相应血清 0.03ml 。 在受检血清旁滴加抗原 0.03ml 。 用牙签类小棒搅动血清和抗原使之混合。 每次试验应设阴、阳性血清对照。
四、酶联免疫吸附实验（ELISA）

酶联免疫吸附试验（ELISA）概述
酶联免疫吸附试验（ELISA）操作流程
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酶联免疫吸附试验（ELISA）概述
酶联免疫吸附试验，简称ELISA，是实验室最常用的检测方 法。 酶是能够催化化学反应的特殊蛋白质，其催化效力超过目 前所有人造催化剂。酶标记抗原或抗体以后，既不影响抗原抗体 反应的特异性，也不改变酶本身的活性。因此ELISA具有准确性 高、检测时间短、价格低廉、判断结果有客观标准、结果便于记 录和保存等优点，适合于大批标本的检测，广泛应用于食品安全 检测、医疗检测以及免疫实验分析等领域。
注意：在加红细胞过程中还须不断轻摇以确保红细胞均匀，使其每 孔加入相同数量的红细胞。制备好的红细胞液如果放置后上清液变 红，说明有溶血，不可再使用。
血凝试验操作步骤
倒 加
结果判定
血凝反应强度示意图 “4＋” 红细胞呈片状凝集，均匀布满孔底，边缘有时不整齐或皱缩。 “3＋” 红细胞呈片状凝集，但面积略小于“4+”。 “2＋” 红细胞呈片状凝集，但有少许沉积孔底中部呈小圆点状。 “＋” 红细胞大部分沉于孔底中央，周围有少量散在凝集颗粒。 “－” 红细胞均沉于孔底呈小圆点状，边缘整齐。 2.对照孔正常的情况下，红细胞凝集100%的稀释度为判定血凝价的终点。凡能使 鸡红细胞完全凝集的病毒最高稀释倍数为病毒的凝集价。
未来：全自动酶免工作站
使用全自动酶免可以：
*提高加标本速度与效率 *减少操作人员劳动强度 *使标本传染操作人员机会最小化 *通过减少人为失误和改善加样精确度与准确性来改善 检测分析质量； *采用批量（batch）或随机（random access）进行多 种组合与多种 模式检测
五、虎红平板凝集实验（初筛）——布鲁氏菌病
血凝抑制试验（HI）原理
+
+
？
病毒的悬液中加入特异性抗体，红细胞的凝集现 象被抑制，称为红细胞的血凝抑制。
主要实验器材：
○普通离心机
微量振荡器
微量移液器
96孔V型血凝反应板
禽用采血器
试验主要试剂： 标准抗原、阳性血清、阴性血清与待检血清 1%鸡红细胞悬液（阿氏液） 生理盐水（PBS液） 四单位抗原
有效推动动物免 有效的根据监测数据制定出免疫程序，有效的预防动物 疫程序的制定 疫情，从而降低养殖户的经济损失