膜片钳技术的发展和应用

膜片钳的发展和应用

1．背景

细胞是生物的基本组成单元，细胞外围有一层薄膜，彼此分离又互相联系，细胞间与细胞内的通信、信号传递依靠其膜上的离子通道来进行，离子和离子通道是细胞兴奋性的基础，亦是产生生物电的基础。生物电信号通常是用电学或电子学的方法进行测量。早期多采用双电极电压钳技术作胞内记录，近年来逐渐被膜片钳所取代，这项技术为从细胞和分子水平了解生物膜离子单通道“开启”和“关闭”的门控动力学及各种不同离子通道的通透性和选择性等膜信息提供了最直接的手段。

膜片钳记录(patch clamp recording)是利用玻璃微电极吸引封接面积仅为几个um2的细胞膜片，在10-12A水平，记录单个或几个通道的离子电流，已达到当今电子测量的极限。此技术广泛用于细胞膜离子通道电流的测量和细胞分泌、药理学、病理生理学、神经科学、脑科学、植物细胞的生殖生理等领域的研究。从而点燃了细胞和分子水平的生理学研究的生命之火，并取得了丰硕的成果。

2．膜片钳技术简介

2.1 基本原理和记录方法

电压钳(V oltage-clamp)是由英国学者Huxley和Katz最先应用的[1]。其实质是通过负反馈微电流放大器在兴奋性细胞膜上外加电流，保持细胞跨膜电位不变，并迅速控制其数值，以观察在不同膜电位条件下膜电流的情况。膜电流的改变反映了膜电阻和膜电容的变化，因此电压钳可用来研究整个细胞膜或一大块细胞膜上所有离子通道的活动，但该技术由于在细胞内插人两根电扳，对细胞损伤很大，在小细胞中难以实现，又因细胞形态复杂，很难保持细胞膜各处生物特性的一致，而逐渐被膜片钳所取代。

膜片钳技术(patch-clamp)是在电压钳基础上发展起来一种新技术，与电压钳的主要区别有二：一是钳制膜电位的方法不同；二是电位固定的细胞膜面积不同，即所研究的离子通道数目不同。与电压钳一样，膜片钳也是利用负反馈电子线路，将微电板尖端所吸附的一个至几个平方微米的细胞膜电位固定在一定水平，观察流过通道的离子电流。其实现膜电位固定的关键是在玻璃微电极尖端边缘与细胞膜之间形成高阻封接，使电极尖开口处与相接的细胞膜小区域(膜片)形成无论是从机械上还是电学上都极为紧密地封接，从而可反映细胞上单一(或多数)离子通道的分子活动[2]。1976年，德国科学家Neher和Sakmann首先用此技术对蛙胸皮肌细胞膜上的己酰胆碱受体通道进行了研究，记录出了量值在皮安级(10-12 A)的微弱电流[3,4]。1981年，经Hamill等[5]后人的进一步完善，其电流测量灵敏度已达1pA，时间和空间分辨率达10 us和1 um。

随着膜片钳技术的出现，目前有几种不同的记录方式：

(1)细胞吸附式(cell-attached patch)将两次拉制后，经热抛光的微管电极置于清洁的细胞膜表面, 形成高阻封接，在细胞膜表面隔离出一小片膜，即通过微管电极对膜片进行电压钳制，从而测量膜电流。

(2)内面向外模式(inside-out patch)高阻封接形成后，将微管电极轻轻提起，使其与细胞分离，电极端形成密封小泡，在空气中短暂暴露几秒钟后，小泡破裂再回到溶液中，使小泡的外半部分破裂即得。

(3)外面向外模式(outside-out patch)高阻封接形成后，继续以负压抽吸，膜片破裂，再将玻管慢慢从细胞表面提起，断端游离部分自行融合形成脂质双层而得到。

(4)全细胞模式(whole-cell mode)在细胞吸附式的基础上，继续以负压抽吸，使电极管内细胞膜破裂，电极内液与胞内液直接相通而得到。此方式既可记录膜电位又可记录膜电流。

(5)穿孔膜片钳记录(perforated patch mode)，为克服常规全细胞模式的胞质渗漏问题，有学者将与离子亲和的制霉菌素或二性霉素B经微电极灌流到含有类甾醇的细胞膜上，形成只允许一价离子通过的孔，用此法在膜片上做很多导电性孔道借此对全细胞膜电流进行记录。由于此模式的胞质渗漏极为缓慢，局部串联阻抗较常规全细胞模式高，所以钳制速度很慢，故也称为缓慢全细胞模式。

2.2 膜片钳的技术特点

膜片钳技术是用微玻管电极(膜片电极或膜片吸管)接触细胞膜。以吉欧姆(GΩ)以上的阻抗使之封接．使与电极尖开口处相接的细胞膜的小区域(膜片)与其周围在电学上绝缘，在此基础上固定电位，对此膜片上的离子通道的离子电流(pA级)进行监测记录的方法。

膜片钳记录技术的优点有：

①最主要的是在GΩ封接形成的结果使漏出的电流极少，所以能正确地进行电压固

定；

②GΩ封接使背底噪声水平达到极低。因为由热噪声(Johnson噪声)引起漂动的标准误

差与阻抗的平方根值成正比，所以，巨阻抗封接时可达到最小；

③膜片钳法对一般较小细胞也能在电位固定的条件下记录出膜电流；

④膜片钳技术可以直接控制细胞内环境。

2.3 应用领域和最新进展

膜片钳技术广泛用于细胞膜离子通道电流的测量和细胞分泌、药理学[6]、病理生理学、神经科学[7]、脑科学、植物细胞的生殖生理等领域的研究。从而点燃了细胞和分子水平的生理学研究的生命之火，并取得了丰硕的成果。

在体膜片钳技术

在体膜片钳是指在麻醉动物上直接对其脊髓或大脑神经元进行膜片钳记录的技术。与分散神经元或组织片膜片钳技术比，最突出的优点是能够在整体条件下研究中枢神经元离子通道和突触活动的生理特点，还可通过口服及注射等整体给药途径观察药物作用，为从宏观角度研究和探讨作用于中枢神经系统药物的作用机制提供了新的途径。

在体膜片钳面临的难点在于：1）前期准备步骤复杂。动物麻醉后，还要继续静脉滴注麻醉剂以维持深度麻醉状态，同时适量补偿葡萄糖；另外还需要做胸廓切开术，使用人工呼吸机，同时检测CO2潮气量、血压、心跳等。2）形成高阻封接困难。目前在体全细胞记录仍采用“盲插”，即在看不到细胞的情况下进行电极穿插。由于在体神经元的体积较小，这样电极是否遇到细胞就很难判断。另外，在体情况时，软脑膜几乎不可能剥离，并且神经元周围有大量的胶质细胞和纤维包围，这样电极在穿插过程中很容易堵塞。目前只有通过施加正压保持电极清洁。有实验室尝试使用辅助电极清理神经元表面。辅助电极的尖端略大于膜片电极，施加较大正压，吹散周围组织，暴露神经元。但这样增大了操作难度，并很可能损伤脑或脊髓组织，违背应用在体膜片钳技术的初衷。

德国马普研究所在最新研究报告中提出了靶向定位的方案，通过结合双光子显微镜、基因操作表达荧光标志技术，建立了双光子靶向膜片钳技术(two-photon targeted patching，TPTP)，进行在体全细胞记录研究[8]。首先通过基因操作在动物脑内目标神经元中构建特异