测定蛋白质相对分子质量

2、凝胶的制备
2）浓缩胶的制备
配 制 3% 浓 缩 胶 。 在 烧 杯 中 依 次 加 入 重 蒸 水 3.12ml,浓缩胶缓冲液1.25ml,10%SDS 0.05ml,凝 胶储备液0.6ml，10% 过硫酸铵 25ul和TEMED 5ul（两块胶的量？？？）。混匀后用注射器加到已 聚合的分离胶上方，直至距离短玻璃板上缘约 0.5cm处(立即清洗注射器及针头)。
相对迁移率mR=
蛋白质样品迁移距离(cm) 溴酚蓝区带距加样端距离(cm)
【思考题】
1、在上样缓冲液中SDS、巯基乙醇、甘油及溴 酚兰的作用分别是什么？
2、在SDS-PAGE中,分离胶中的TEMED和AP的 作用是什么?
3、样品液为何在加样前需在沸水中加热几分钟?
【目的要求】 学习SDS-PAGE测定蛋白质分子量的原理。 掌握垂直板电泳的操作方法。 运用SDS-PAGE测定蛋白质分子量及染色 鉴定。
【实验原理】
电泳 带电颗粒在电场作用下，向着与其电荷相反的电 极移动的现象。 PAGE 聚丙烯酰胺凝胶（PAG）是由单体丙烯酰胺 (Acr)和交联剂甲叉双丙烯酰胺(Bis)在加速剂四甲基乙 二胺(TEMED)和引发剂过硫酸铵(AP) 的作用下聚合交 联而成的三维网状结构的凝胶。以此凝胶作为支持介质 的电泳称为PAGE。 PAGE具有电泳和分子筛的双重作 用。
当蛋白质的分子量在17,000～165,000之间时， 蛋 白质-SDS复合物的电泳迁移率与蛋白质分子量的对 数呈线性关系：
lgMW = K - bm
将已知分子量的标准蛋白质在SDS-PAGE 中的电泳迁 移率对分子量的对数作图，即可得到一条标准曲线。 只要测得未知分子量的蛋白质在相同条件下的电泳迁 移率，就能根据标准曲线求得其分子量。
CH2=CH N, N’-甲叉 双丙烯酰胺
PAG机械强度好，有弹性，透明，化学性质稳定，改变 Acr浓度或Acr与Bis的比例可以得到不同孔径的凝胶。
PAGE分为连续系统和不连续系统两大类。连续系统电 泳体系中缓冲液pH值与凝胶中的相同.带电颗粒在电场 作用下，主要靠电荷和分子筛效应。不连续系统中带电 颗粒在电场中泳动不仅有电荷效应、分子筛效应，还具 有浓缩效应，因而其分离条带清晰度及分辨率均较前者 佳。
CH2=CH C=O NH2
丙烯酰胺
CH2-CH (CH2¯ CH )n CH2-CH( CH2-CH )mCH2-CH
C=O
C=O C=O
NH2
NH
NH2
CH2
NH
C=O
CHห้องสมุดไป่ตู้-CH ( CH2-CH )nCH2-CH( CH2-CH )mCH2-CH
C=O
C=O
NH2
NH2
聚丙烯酰胺
CH2=CH C=O NH CH2 NH C=O
轻轻插入梳齿至浓缩胶内，避免带入气泡。约 30min后凝胶聚合。
3、蛋白质样品的处理
1）标准蛋白质样品的处理 低分子量标准蛋白试剂盒:兔磷酸化酶B MW=97,400
牛血清白蛋白 MW=66,200 牛碳酸酐酶 MW=31,000 胰蛋白酶抑制剂 MW=20,100 鸡蛋清溶菌酶 MW=14,400 开封后，沸水浴中加热3-5min后上样。
2）样液的准备
用移液枪小心吸取处理好的血清50ul至1.5ml 的离心管中，再加入50ul上样缓冲液，混匀后 沸水浴中加热3min，取出冷却后加样。
Staking gel Separating gel
4、加样
用移液器分别取10 l样品液，小心将样品加 到凝胶凹形样品槽底部。
5、电泳 将电泳仪的正负极与电泳槽正负极相连接， 打开电泳仪开关，设置电压为110V，电泳 80mins,此时溴酚蓝染料达到凝胶底部，停止 电泳，关闭电源。
有许多蛋白质是由亚基或两条以上肽链组成的，它们在 SDS和巯基乙醇作用下，解离成亚基或单条肽链，因此 这一类蛋白质，测定的只是亚基或单条肽链的MW。
蛋白质分子结合SDS阴离子后，所带负电荷的量远远超 过了它原有的净电荷，从而消除了不同种蛋白质之间所 带净电荷的差异。蛋白质的电泳迁移率主要决定于亚基 的相对分子质量。而与其所带电荷的性质无关。
【操作方法】 １、垂直板电泳槽
2、凝胶的制备
1）分离胶的制备
配 制 12% 分 离 胶 。 在 烧 杯 中 依 次 加 入 重 蒸 水 3.35ml,分离胶缓冲液2.5ml,10%SDS 0.1ml,凝胶 储备液4.0ml，10% 过硫酸铵50ul和TEMED 10ul （两块胶的量？？？）。由于AP和TEMED相遇后 凝胶即开始聚合，所以应立即混匀混合液，用移液 枪抽取3.2~3.5ml凝胶液加至长、短玻璃板间的窄缝 内.再用注射器在凝胶表面沿短玻璃板边缘轻轻加一 层重蒸水,用于隔绝空气，使胶面平整。37℃烘箱下 聚合（约30 -60min）。待凝胶完全聚合.将贮槽的 蒸馏水倒去 ，用细条滤纸吸去残留的水液。
6 、染色与脱色 电泳结束后，取下玻板，在自来水下用特制板撬开短 玻璃板，从凝胶板上切下一角作为加样标记，在两侧溴 酚蓝染料区带中心，插入细铜丝作为前沿标记。加入染 色液染色60 mins，再用脱色液脱色，直至蛋白质区带 清晰，即可计算相对迁移率。
7、 结果处理 量出加样端距细铜丝间的距离(cm)以及各蛋白质样品区 带中心与加样端的距离(cm)，按下式计算相对迁移率mR：
【SDS-PAGE基本原理】
SDS-PAGE 是在蛋白质样品中加入SDS和含有巯基乙 醇的样品处理液，SDS是一种很强的阴离子表面活性剂， 它可以断开分子内和分子间的氢键，破坏蛋白质分子的 二级和三级结构。
强还原剂巯基乙醇可以断开二硫键破坏蛋白质的四级 结构。使蛋白质分子被解聚成肽链形成单链分子。解 聚后的侧链与SDS充分结合形成带负电荷的蛋白质-SDS 复合物。