测定蛋白质相对分子质量

SDS-PAGE测定蛋白质相对分子质量解析

• 5．支持介质的筛孔：支持介质的筛孔大小对生物大分子的电泳迁移速度有明显的影响。在筛孔大的介质中泳动速度快，反之则泳动速度慢。
电泳技术的分类
• 1. 根据电泳中是否使用支持介质分为自由电泳和区带电泳： ①自由电泳不使用支持介质，电泳在溶液中进行。②区带电泳需使用支持介质，根据支持介质不同可分为醋酸纤维薄膜电泳、薄层电泳和凝胶电泳等。根据支持介质的装置形式不同又可分为水平板式电泳、垂直板式电泳、垂直盘状电泳、毛细管电脉等。 • 2.根据电泳时电压的高低分为高压电泳和常压电泳：①高压电泳使用的电压在500～1000V，这类电泳分离速度快，但热效应较大，必须具备冷却装置，主要适用于小分子化合物的快速分离。②常压电泳使用的电压在500 V以下，电位梯度为2～10 V /cm。这类电泳的分离速度较慢，但对电泳设备要求简单。
• 4．电渗：液体在电场中对于固体支持介质的相对移动称为电渗。由于支持介质表面存在一些带电基团，如滤纸表面含有羧基，琼脂含有硫酸基等。这些基团电离后使支持介质表面带电，吸附一些带相反电荷的离子在电场作用下向电极方向移动，形成介质表面溶液的流动。 • 当电渗方向与电泳方向相同时则加快电泳速度；当电渗方向与电用的示踪剂有溴酚兰和二甲苯青FF。示踪剂一般与蔗糖、甘油组成上样缓冲液，蔗糖、甘油可增加溶液密度，使其比重增加，以确保样品均匀沉入加样孔内。
醋酸纤维薄膜电泳分离血清蛋白质
【基本原理】 • 本实验用醋酸纤维薄膜作电泳支持物分离血清蛋白质。血清蛋白质的等电点都小于7.5，在 pH=8.6的巴比妥缓冲溶液中都带有负电荷，在电场中将向正极移动。由于血清中各蛋白质的等电点不一，所带净电荷有差异，所以它们的泳动速率也不同。将微量血清点于薄膜上，通电电泳后，将薄膜置染色液中使蛋白质固定并染色，可将血清蛋白质分成5条区带，从正极端起分别为白蛋白、 α1-球蛋白、α2-球蛋白、β-球蛋白、γ-球蛋白。

凝胶层析法测定蛋白质相对分子质量

利用Andrews的实验经验式：
lgMr = a/b—Ve/bVo 式中，Ve为洗脱体积。它是自加样品开始到该组分的洗脱峰（峰顶）出现时所流出的体积。Vo为外水体积， Mr为相对分子质量，a和b为常数。葡聚糖凝胶有不同的型号，用于分离不同相对分子质量大小的物质。例如Sephardex G-75的分级范围是300080000的球形分子。在本实验中用于分离胰岛素（Mr为 6000）和牛血清蛋白（Mr75000）。
计算
分子量的测定和计算，一般都采用标准曲线法。只要测得几种标准蛋白质相对分子质量的Ve，并以它们的相对分子质量的对数 (logMr)对Ve作图得一直线，再测出待测样品的Ve，即可从图中确定它的相对分子质量。
注意事项
各接头不能漏气，连续用的小乳胶管不要有破损，否则造成漏气、漏液。注意恒压瓶内的排气管应无液体，并随着柱下口溶液的流出不断有气泡产生，则表示恒压瓶不漏气。操作过程中，层析柱内液面不断下降，则表示整个系统有漏气之处，应仔细检查并加以纠正。
凝胶层析法测定蛋白质相对分子质量
1
实验目的
掌握凝胶层析的基本原理。学习利用凝胶层析法测定蛋白质相对分子质
量的实验技能。
实验原理
凝胶层析法也称分子筛层析法，是利用具有一定孔径大小的多孔凝胶作固定相的层析技术。当混合物随流动相经过凝胶层析柱时，其中各组分按其分子大小不同而被分离的技术。该法设备简单、操作方便、重复性好、样实验成败的关键之一，若样品稀释或上柱不均，会使区带扩散，影响层析效果。上样时应尽量保持床面的稳定。先打开柱的出口，待柱中洗脱液流至距床表面1～2mm时，关闭出口，用滴管将1ml样品慢慢地加至柱床表面，应避免将床面凝胶冲起，打开出口并开始计算流出体积，当样品滲入床中接近床表面1mm时关闭出口。按加样操作，用少量（约1ml）洗脱液冲洗管壁2次。最后加入少量洗脱液于凝胶上，使高出床表面3～5cm，旋紧上口螺丝帽，柱进水口连通恒流泵，调好流速，以每管3ml/10min 流速开始洗脱。上样的体积，分析用量为柱床容积的1—2%；制备用量为柱床容积的 20%~30%。

测定蛋白质相对分子质量的方法

测定蛋白质相对分子质量的方法
蛋白质相对分子质量可用以下几种常见的实验测定：
1.同位素掺入法：能准确测定蛋白质相对分子质量的一种方法，它的原理是利用质谱方法，将蛋白质样品中的氢原子替换成同位素氢，如²H 或³⁷Cl，用质谱分析同位素掺入后的蛋白质的改变，从而推算出蛋白质的相对分子质量。

2.SDS-PAGE：蛋白质在SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）中移动的速度与分子质量有关，可用此方法推算蛋白质的相对分子质量：根据蛋白质在凝胶上移动的时间确定其相对分子质量。

3. 光波谱法：可以通过紫外拉曼光谱（UV-Raman）或者红外谱（IR），计算结合能从而计算蛋白质分子的相对分子质量。

4.质谱分析法：利用质谱技术直接测定蛋白质的大小，包括电喷雾质谱（ESI-MS）、离子化质谱（FAIMS）和质谱分析（MS）等技术。

利用质谱技术，可以测定蛋白质的相对分子质量，从而帮助我们研究蛋白质的特性和作用。

SDS-PAGE测定蛋白质相对分子质量

【实验原理】
SDS与蛋白质结合后，还引起蛋白质构象的改变。蛋白质-SDS复合物的流体力学和光学性质表明，它们在水溶液中的形状，近似于雪茄烟形的长椭圆棒。不同蛋白质的SDS复合物的短轴长度都一样，而长轴则随蛋白质相对分子质量的大小成正比的变化。这样的蛋白质-SDS复合物在凝胶中的迁移率，不再受蛋白质原有电荷和形状的影响，而只是椭圆棒的长度，也就是蛋白质相对分子质量的函数。
【实验步骤】
一、安装垂直板型电泳装置
一、安装垂直板型电泳装置
将装好的电泳装置垂直放置，在长玻璃片下端与硅胶框交界的缝隙内加入用电极缓冲溶液配制的1%琼脂糖溶液，待其凝固后，即堵住凝胶模板下面的窄缝（通电时又可作为盐桥）。
分离胶的配制
10%(ml)
H2O
10
30%丙烯酰胺
10
分离胶缓冲液(pH8.8)
【实验原理】
SDS是一种阴离子型去污剂，在蛋白质溶解液中加入 SDS和巯基乙醇后，巯基乙醇可使蛋白质分子中的二硫键还原；SDS能使蛋白质的非共价键（氢键、疏水键）打开，并结合到蛋白质分子上（在一定条件下，大多数蛋白质与SDS 结合比为1.4 g SDS/g蛋白质），形成蛋白质-SDS复合物。由于SDS带有大量负电荷，当它与蛋白质结合时，所带的负电荷的量大大超过了蛋白质原有的电荷量，因而掩盖了不同种类蛋白质间原有的电荷差异。
剥胶示意图
七、染色和脱色
倾出固定液，加入染色液。染色过夜。染色完毕，倾出染色液，加入脱色液。数小时换一次脱色液，直至背景清晰，约需一昼夜。
八、Mr的计算
量出加样端距细铜丝间的距离(cm)以及各蛋白质样品区带中心与加样端的距离(cm)，按下式计算相对迁移率mr：
蛋白质样品迁移距离(cm) 相对迁移率mr = 溴酚蓝区带距加样端距离(cm)

SDSPAGE测定蛋白质相对分子质量实验报告

SDS－PAGE测定蛋白质相对分子质量一、前言聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳，简称PAGE，是以聚丙烯酰胺凝胶作为支持介质的一种经常使用电泳技术。

聚丙烯酰胺凝胶由单体丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺聚合而成，聚合进程由自由基催化完成。

的经常使用方式有两种:化学聚合法和光聚合法。

化学聚合以过硫酸铵(APS)为催化剂，以(TEMED)为加速剂。

在聚合进程中，TEMED催化过硫酸铵产生自由基，后者引发单体聚合，同时甲叉双丙烯酰胺与丙烯酰胺链间产生甲叉键交联，从而形成三维。

PAGE依照其有无浓缩效应，分为持续系统和不持续系统两大类，持续系统电泳体系中缓冲液pH值及凝胶浓度相同，带电颗粒在电场作用下，要紧靠电荷和。

不持续系统中由于离子成份，pH，凝胶浓度及电位梯度的不持续性，带电颗粒在电场中泳动不仅有电荷效应，分子筛效应，还具有浓缩效应，因此其分离条带清楚度及分辨率均较前者佳。

不持续体系由电极缓冲液、浓缩胶及所组成。

浓缩胶是由AP 而成的大孔胶，凝胶缓冲液为的Tris-HCl。

分离胶是由AP催化聚合而成的小孔胶，凝胶缓冲液为Tris-HCl。

电极缓冲液是Tris-甘氨酸缓冲液。

2种孔径的凝胶、2种缓冲体系、3种pH 值使不持续体系形成了凝胶孔径、pH值、缓冲液离子成份的不持续性，这是样品浓缩的要紧因素。

SDS是阴离子去污剂，作为变性剂和助溶试剂，它能断裂分子内和分子间的氢键，使分子去折叠，破坏蛋白分子的二、三级结构。

而强如巯基乙醇，二硫苏糖醇能使半胱氨酸残基间的断裂。

在和凝胶中加入还原剂和SDS后，分子被成多肽链，解聚后的氨基酸侧链和SDS结合成蛋白- SDS，所带的负电荷大大超过了蛋白原有的电荷量，如此就排除不同分子间的电荷不同和结构不同。

SDS-PAGE一样采纳的是不持续缓冲系统，与持续缓冲系统相较，能够有较高的分辨率。

浓缩胶的作用是有堆积作用，凝胶浓度较小，孔径较大，把较稀的样品加在浓缩胶上，通过大孔径凝胶的迁移作用而被浓缩至一个狭小的区带。

SDS-PAGE测定蛋白质相对分子质量试验报告

SD9 PAGE测定蛋白质相对分子质量一、前言聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳，简称 PAGE是以聚丙烯酰胺凝胶作为支持介质的一种常用电泳技术。

聚丙烯酰胺凝胶由单体丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺聚合而成，聚合过程由自由基催化完成。

催化聚合的常用方法有两种：化学聚合法和光聚合法。

化学聚合以过硫酸铵(APS)为催化剂，以四甲基乙二胺(TEMED 为加速剂。

在聚合过程中，TEMED催化过硫酸铵产生自由基，后者引发丙烯酰胺单体聚合，同时甲叉双丙烯酰胺与丙烯酰胺链间产生甲叉键交联，从而形成三维网状结构。

PAGE根据其有无浓缩效应，分为连续系统和不连续系统两大类，连续系统电泳体系中缓冲液 pH值及凝胶浓度相同，带电颗粒在电场作用下，主要靠电荷和分子筛效应。

不连续系统中由于缓冲液离子成分，pH,凝胶浓度及电位梯度的不连续性，带电颗粒在电场中泳动不仅有电荷效应，分子筛效应，还具有浓缩效应，因而其分离条带清晰度及分辨率均较前者佳。

不连续体系由电极缓冲液、浓缩胶及分离胶所组成。

浓缩胶是由 AP 催化聚合而成的大孔胶,凝胶缓冲液为的 Tris-HCl 。

分离胶是由 AP 催化聚合而成的小孔胶,凝胶缓冲液为 Tris-HCl 。

电极缓冲液是 Tris- 甘氨酸缓冲液。

2 种孔径的凝胶、 2 种缓冲体系、3种pH值使不连续体系形成了凝胶孔径、pH值、缓冲液离子成分的不连续性,这是样品浓缩的主要因素。

SDS是阴离子去污剂，作为变性剂和助溶试剂，它能断裂分子内和分子间的氢键，使分子去折叠，破坏蛋白分子的二、三级结构。

而强还原剂如巯基乙醇，二硫苏糖醇能使半胱氨酸残基间的二硫键断裂。

在样品和凝胶中加入还原剂和 SDS后，分子被解聚成多肽链，解聚后的氨基酸侧链和SDS结合成蛋白-SDS胶束，所带的负电荷大大超过了蛋白原有的电荷量，这样就消除了不同分子间的电荷差异和结构差异。

SDS-PAG一般采用的是不连续缓冲系统，与连续缓冲系统相比，能够有较高的分辨率。

SDS-PAGE测定蛋白质相对分子质量实验报告

SDS－PAGE测定蛋白质相对分子质量一、前言聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳，简称PAGE，是以聚丙烯酰胺凝胶作为支持介质的一种常用电泳技术。

聚丙烯酰胺凝胶由单体丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺聚合而成，聚合过程由自由基催化完成。

催化聚合的常用方法有两种:化学聚合法和光聚合法。

化学聚合以过硫酸铵(APS)为催化剂，以四甲基乙二胺(TEMED)为加速剂。

在聚合过程中，TEMED 催化过硫酸铵产生自由基，后者引发丙烯酰胺单体聚合，同时甲叉双丙烯酰胺与丙烯酰胺链间产生甲叉键交联，从而形成三维网状结构。

PAGE根据其有无浓缩效应，分为连续系统和不连续系统两大类，连续系统电泳体系中缓冲液pH值及凝胶浓度相同，带电颗粒在电场作用下，主要靠电荷和分子筛效应。

不连续系统中由于缓冲液离子成分，pH，凝胶浓度及电位梯度的不连续性，带电颗粒在电场中泳动不仅有电荷效应，分子筛效应，还具有浓缩效应，因而其分离条带清晰度及分辨率均较前者佳。

不连续体系由电极缓冲液、浓缩胶及分离胶所组成。

浓缩胶是由AP催化聚合而成的大孔胶，凝胶缓冲液为pH6.7的Tris-HCl。

分离胶是由AP催化聚合而成的小孔胶，凝胶缓冲液为pH8.9 Tris-HCl。

电极缓冲液是pH8.3 Tris-甘氨酸缓冲液。

2种孔径的凝胶、2种缓冲体系、3种pH值使不连续体系形成了凝胶孔径、pH值、缓冲液离子成分的不连续性，这是样品浓缩的主要因素。

SDS是阴离子去污剂，作为变性剂和助溶试剂，它能断裂分子内和分子间的氢键，使分子去折叠，破坏蛋白分子的二、三级结构。

而强还原剂如巯基乙醇，二硫苏糖醇能使半胱氨酸残基间的二硫键断裂。

在样品和凝胶中加入还原剂和SDS后，分子被解聚成多肽链，解聚后的氨基酸侧链和SDS结合成蛋白- SDS胶束，所带的负电荷大大超过了蛋白原有的电荷量，这样就消除了不同分子间的电荷差异和结构差异。

SDS-PAGE一般采用的是不连续缓冲系统，与连续缓冲系统相比，能够有较高的分辨率。

SDS-PAGE测定蛋白质相对分子质量

• 聚丙烯酰胺凝胶的聚合体系有两种： • （1）化学聚合：通常采用过硫酸铵(AP)为催化剂，四甲基乙二胺（TEMED）为加速剂。在TEMED 催化下，过硫酸铵可使丙烯酰胺单体的双键打开、活化形成自由基丙烯酰胺，从而引发聚合作用。 • （2）光聚合：通常采用核黄素作催化剂，核黄素在光照下光解成无色基，后者再被氧化成自由基而引发聚合作用。光聚合的凝胶孔径较大，而且随时间延长而逐渐变小，不太稳定。化学聚合的凝胶孔径较小，且各次制备的重复性好。故一般采用化学聚合。
四电泳
• 将上槽接负极，下槽接正极，打开电源，开始时将电流控制在15～20 mA,待样品进入分离胶后，改为30～50 mA。待蓝色染料迁移至下端约1～1.5 cm时，停止电泳，约需1～2小时。
五剥胶
取下凝胶模子，将凝胶片取出，滑入一白瓷盘或大培养皿内，在染料区带的中心插入细铜丝作为标志。
六染色和脱色
染色用一块胶，另一块胶用于转膜。加入染色液，染色45分钟。脱色染色完毕，倾出染色液，加入脱色液。 20～30min换一次脱色液，2～3次后可初步观察电泳条带，然后脱色过夜，直至背景清晰。
七 Mr的计算
• 通常以相对迁移率(mr)来表示迁移率。相对迁移率的计算方法如下：用直尺分别量出样品区带中心及铜丝与凝胶顶端的距离，按下式计算： • 相对迁移率(mr) = 样品迁移距离(cm)／染料迁移距离(cm)。 • 以标准蛋白质相对分子质量的对数对相对迁移率作图，得到标准曲线。根据待测样品的相对迁移率，从标准曲线上查出其相对分子质量
牛血清样品2 样品1 蛋白样品1 marker 样品2 牛血清
第一组加样
第二组加样
第二块胶加样顺序与第一块胶相同

SDS-PAGE测定蛋白质相对分子质量

【实验原理】
当蛋白质的分子量在15,000～200,000之间时，蛋白质-SDS复合物的电泳迁移率与蛋白质相对分子质量的对数呈线性关系：
lgMr = K - bm 将已知相对分子质量的标准蛋白质在SDS-PAGE 中的电泳迁移率对Mr的对数作图，即可得到一条标准曲线。只要测得未知分子量的蛋白质在相同条件下的电泳迁移率，就能根据标准曲线求得其分子量。
【实验步骤】
一、安装垂直板型电泳装置
一、安装垂直板型电泳装置
将装好的电泳装置垂直放置，在长玻璃片下端与硅胶框交界的缝隙内加入用电极缓冲溶液配制的1%琼脂糖溶液，待其凝固后，即堵住凝胶模板下面的窄缝（通电时又可作为盐桥）。
分离胶的配制
10%(ml)
H2O
10
30%丙烯酰胺
10
分离胶缓冲液(pH8.8)
以标准蛋白质相对分子质量的对数对相对迁移率作图，得到标准曲线。根据待测样品的相对迁移率，从标准曲线上查出其相对分子质量。标准蛋白质相对分子质量从大到小依次为116, 66.2, 45, 35, 25, 18.4, 14.4 KDa。
【注意事项】
1、再用SDS-PAGE测定蛋白质的相对分子质量时，每次测定样品必须同时作标准曲线，而不能用上一次电泳的标准曲线；
浓缩胶的配制
H2O 30%丙烯酰胺浓缩胶缓冲液(pH6.8)
10% SDS TEMED 10%过硫酸铵总体积
4%(ml) 3.05 0.65 1.25 0.05 0.03 0.05 5ml
二、凝胶的制备
2、浓缩胶的制备按表配制浓缩胶，混匀后用细长头的滴管将凝胶溶液加到已聚合的分离胶上方，直至距短玻璃片上缘1 cm处，轻轻将“梳子”插入浓缩胶内（插入“梳子” 的目的是使胶液聚合后，在凝胶顶部形成数个相互隔开的凹槽）。约30 min后凝胶聚合，再放置30 min。小心拔去“梳子”，用窄条滤纸吸去样品凹槽内多余的水分。

SDS-PAGE测定蛋白质相对分子质量实验报告

SDS－PAGE测定蛋白质相对分子质量一、前言聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳，简称PAGE，是以聚丙烯酰胺凝胶作为支持介质的一种常用电泳技术。

聚丙烯酰胺凝胶由单体丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺聚合而成，聚合过程由自由基催化完成。

催化聚合的常用方法有两种:化学聚合法和光聚合法。

化学聚合以过硫酸铵(APS)为催化剂，以四甲基乙二胺(TEMED)为加速剂。

在聚合过程中，TEMED催化过硫酸铵产生自由基，后者引发丙烯酰胺单体聚合，同时甲叉双丙烯酰胺与丙烯酰胺链间产生甲叉键交联，从而形成三维网状结构。

PAGE根据其有无浓缩效应，分为连续系统和不连续系统两大类，连续系统电泳体系中缓冲液pH值及凝胶浓度相同，带电颗粒在电场作用下，主要靠电荷和分子筛效应。

不连续系统中由于缓冲液离子成分，pH，凝胶浓度及电位梯度的不连续性，带电颗粒在电场中泳动不仅有电荷效应，分子筛效应，还具有浓缩效应，因而其分离条带清晰度及分辨率均较前者佳。

不连续体系由电极缓冲液、浓缩胶及分离胶所组成。

浓缩胶是由AP催化聚合而成的大孔胶，凝胶缓冲液为pH6.7的Tris-HCl。

分离胶是由AP催化聚合而成的小孔胶，凝胶缓冲液为pH8.9 Tris-HCl。

电极缓冲液是pH8.3 Tris-甘氨酸缓冲液。

2种孔径的凝胶、2种缓冲体系、3种pH值使不连续体系形成了凝胶孔径、pH值、缓冲液离子成分的不连续性，这是样品浓缩的主要因素。

SDS是阴离子去污剂，作为变性剂和助溶试剂，它能断裂分子内和分子间的氢键，使分子去折叠，破坏蛋白分子的二、三级结构。

而强还原剂如巯基乙醇，二硫苏糖醇能使半胱氨酸残基间的二硫键断裂。

在样品和凝胶中加入还原剂和SDS后，分子被解聚成多肽链，解聚后的氨基酸侧链和SDS结合成蛋白- SDS胶束，所带的负电荷大大超过了蛋白原有的电荷量，这样就消除了不同分子间的电荷差异和结构差异。

SDS-PAGE一般采用的是不连续缓冲系统，与连续缓冲系统相比，能够有较高的分辨率。

SDS-PAGE测定蛋白质相对分子质量

CH2=CH C=O NH2
CH2=CH
丙烯酰胺
C=O NH CH2
CH2-CH (CH2¯ CH )n CH2-CH( CH2-CH )m CH2-CH C=O C=O C=O NH2 NH NH2 CH2 NH C=O CH2-CH
NH C=O CH2=CH N, N’-甲叉 N’双丙烯酰胺
( CH2-CH )nCH2-CH( CH2-CH )m CH2-CH
当蛋白质的分子量在17,000～165,000之间时，当蛋白质的分子量在17,000～165,000之间时，蛋 17,000 之间时白质-SDS复合物复合物的电泳迁移率与蛋白质分子量的对白质-SDS复合物的电泳迁移率与蛋白质分子量的对数呈线性关系：数呈线性关系：
lgMW = K - bm
C=O NH2 C=O NH2
化学性质稳定， PAG机械强度好，有弹性，透明，化学性质稳定，改变机械强度好 Acr浓度或Acr与Bis的比例可以得不同孔径的凝胶。 Acr浓度或Acr与Bis的比例可以得到不同孔径的凝胶。浓度或Acr 的比例可以得到 PAGE分为连续系统和不连续系统两大类。连续系统电 PAGE 分为连续系统和不连续系统两大类。连续系统电分为连续系统和不连续系统两大类泳体系中缓冲液pH值与凝胶中的相同. 泳体系中缓冲液pH值与凝胶中的相同.带电颗粒在电场缓冲液 pH 值与凝胶中的相同作用下，主要靠电荷和分子筛效应不连续系统中带电靠电荷和分子筛效应。作用下，主要靠电荷和分子筛效应。不连续系统中带电颗粒在电场中泳动不仅有电荷效应、分子筛效应，颗粒在电场中泳动不仅有电荷效应、分子筛效应，还具有浓缩效应，有浓缩效应，因而其分离条带清晰度及分辨率均较前者佳。

测定蛋白质含量和相对分子质量的方法

测定蛋白质含量的方法1、凯式定氮法（Kjedahl法）；2、福林（Folin）-酚试剂法(Lowry法)；3、双缩脲法；4、染料结合法（Bradford法）5、紫外分光光度法；6、BCA比色法1、凯式定氮法原理：在催化剂（如CuSO4，K2SO4等）存在的条件下，将植物材料与浓硫酸共热，有机物氧化分解为CO2和H2O，其中的氮转变为氨，并进一步生成(NH4)2SO4，这个过程称为消化。

在消化后的样品中，加入过量的NaOH，经强碱碱化使之分解释放出NH3，通过蒸馏借助蒸汽将NH3导入过量的硼酸溶液，再用标准的盐酸滴定，直到硼酸溶液恢复到原来的H+浓度，根据盐酸的用量即可计算出样品中总氮的含量。

优点：1、是一种测定蛋白质含量的经典方法，操作相对简单；2、实验费用较低。

缺点：1、最终测定的是总有机氮，而不是蛋白质氮；2、耗时较长；3、试剂具有腐蚀性。

适用范围：可用于所有食品的蛋白质分析2、福林（Folin）-酚试剂法此法的显色原理与双缩脲方法相同，只是加了第二种试剂，即Folin酚是试剂，以增加显色量，从而提高了检测蛋白质的灵敏度。

这两种显色反应产生深蓝色的原因是：（1）在碱性条件下，蛋白质中的肽键与铜结合生成复合物。

（2）Folin-酚试剂中的磷钼酸盐-磷钨酸盐被蛋白质中的酪氨酸和苯丙氨酸残基还原，产生深蓝色（钼兰和钨兰的混合物）。

在一定条件下，蓝色深度与蛋白的量成正比。

优点：灵敏度高，操作简单，不需要特殊仪器设备。

缺点：费时长，需要精确控制操作时间，标曲也不是严格的直线形式，专一性差，干扰物质较多。

测定蛋白质的浓度范围是25~250μg/mL。

3、双缩脲法名词解释：是肽和蛋白质所特有的，而为氨基酸所没有的一种颜色反应。

一般含有两个或两个以上的肽键化合物与CuSO4碱性溶液都能发生双缩脲反应，而生成紫红色或蓝紫色的复合物，利用这个反应借助分光光度计可以测定蛋白质的含量。

（2肽只有一个肽键，故要发生双缩脲反应至少是三肽）原理：紫色络合物颜色的深浅与蛋白浓度成正比，而与蛋白质分子量及氨基酸成分无关，故可以用来测定蛋白质的含量。

蛋白质相对分子质量的测定——SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法

蛋白质相对分子质量的测定——SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法一、实验目的1、学会SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法原理。

2、掌握用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定蛋白质相对分子质量的操作技术。

二、实验原理SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）是对蛋白质进行量化，比较及特性鉴定的一种经济、快速、而且可重复的方法。

该法主要依据蛋白质的分子量对其进行分离。

SDS与蛋白质的疏水部分相结合，破坏其折叠结构，并使其稳定地存在于一个广泛均一的溶液中。

SDS-蛋白质复合物的长度与其分子量成正比。

由于在样品介质和聚丙烯酰胺凝胶中加入离子去污剂和强还原剂后，蛋白质亚基的电泳迁移率主要取决于亚基分子量的大小，而电荷因素可以被忽略。

SDS-PAGE因易于操作和广泛的用途，使它成为许多研究领域中一种重要的分析技术。

Acr和bis单独存在或混合在一起时是稳定的，但在具有自由基团体系时就能聚合。

引发自由基的方法有化学法和光化学法两种。

化学法的引发剂是过硫酸铵（Ap），催化剂十四甲基乙二胺（TEMED）；光化学法是以光敏感物核黄素来代替过硫酸铵，在紫外光照射下引发自由基团。

采用不同浓度的acr、bis、Ap、TEMED使之聚合，产生不同孔径的凝胶。

因此可按分离物质的大小、形状来选择凝胶浓度。

SDS是十二烷基硫酸钠（sodium dodecyl sulfate）的简称，它是一种阴离子表面活性剂，加入到电泳系统中能使蛋白质的氢键和疏水键打开，并结合到蛋白质分子上（在一定条件下，大多数蛋白质与SDS的结合比为1.4gSDS/1g蛋白质），使各种蛋白质-SDS复合物都带上相同密度的负电荷，其数量远远超过了蛋白质分子原有的电荷量，从而掩盖了不同种类蛋白质间原有的电荷差别。

这样就使电泳迁移率只取决于分子大小这一因素，于是根据标准蛋白质分子量的对数和迁移率所作的标准曲线，可求得未知物的分子量。

三、实验器材及数据30%分离胶储存液、10%浓缩胶储存液、分离胶缓冲液、浓缩胶缓冲液、电泳缓冲液、样品溶解液、染色液、脱色液；标准蛋白，样品蛋白；电泳槽，移液管1ml，烧杯100ml四、注意事项1、acr和bis均为神经毒剂，对皮肤有刺激作用，操作时应戴口罩和手套，纯化应在通风处内进行。

测定蛋白质相对分子量的方法

测定蛋白质相对分子量的方法
《测定蛋白质相对分子量的方法》
测定蛋白质相对分子量是生物学研究中常用的技术之一，它可以帮助研究者了解蛋白质的结构、功能和互作关系。

测定蛋白质相对分子量的方法主要有电泳、沉淀和放射免疫测定等。

电泳是最常用的测定蛋白质相对分子量的方法，它通过将蛋白质电泳到电泳凝胶板上，然后将凝胶板置于电压场中，使蛋白质在凝胶中移动，根据蛋白质在凝胶中的移动距离来测定其相对分子量。

沉淀法是另一种测定蛋白质相对分子量的方法，它是通过将蛋白质溶液与沉淀剂混合，使蛋白质沉淀，然后测定沉淀物的质量来计算蛋白质的相对分子量。

放射免疫测定是一种特殊的测定蛋白质相对分子量的方法，它是通过将蛋白质混合物接种到动物体内，使其产生免疫反应，然后收集抗体，测定抗体的浓度来计算蛋白质的相对分子量。

以上是测定蛋白质相对分子量的几种方法，它们都能够帮助研究者更好地了解蛋白质的结构、功能和互作关系。