G50固定化条件优化及载体稳定性测定实验设计方案

G50固定化条件优化及载体稳定性测定实验

设计方案

方案主要思路：考察 6种大孔树脂对脂肪酶G50的固定化情况，筛选出 3种较佳载体对脂肪酶G50进行固定化，并对固定化条件进行优化，包括Ph 和脂肪酶添加量； 选用载体刚性，球磨机试验两个参数对上述的3种树脂进行稳定性考察，最后选出脂肪酶G50最佳载体。

1.1实验方法

1.1.1采用甘油二酯乳化法测定脂肪酶G50的活力：

在三角瓶中加入甘油二酯乳化液4 mL(其中二酯 1 mL ，4%的聚

乙烯醇3 mL 并于 10 000 rpm 下均质 10 min)和pH=5.0的

KH 2PO 4-Na 2HPO 4缓冲液(0.05 mol/L)5 mL ，于30°C 的恒温磁力搅拌器中预热 5 min ，然后加入酶粉10mg ，并开始计时，保温反应10min 后立即加入95%的乙醇15 mL 终止反应；加入酚酞指示剂，用标定过的浓度约为0.05 mol/L 的KOH 溶液滴定水解释放出的游离脂肪酸，记录KOH 消耗的体积；空白试验是在预热后的反应体系中先加入 95%的乙醇再加入热失活处理过的酶液1 mL(取2 mL 的酶液100°C

下加热15 min ，冷却至室温后使用)后反应30 min ，其他操作同前。 酶活力的定义为：在上述条件下，单位时间内(每分钟)生成 1

μmol 可滴定脂肪酸所需的酶量为1个活力单位(U)。具体计算公式如下：

酶活力计算公式为：酶活力( umol / g / min)=t

m M M ⨯-21

其中：M1表示反应结束时脂肪酸的量(μmol)；M2表示空白试验中脂肪酸的量(μmol)；V表示加入的酶液质量(g)；t表示反应时间(min)。

1.1.2固定化载体的选择

选用弱极性大孔聚苯乙烯树脂AB-8，非极性大孔聚苯乙烯吸附树脂XAD1180，聚苯乙烯-二乙烯基苯大孔吸附树脂HP20，聚甲基丙烯酸酯中等极性大孔吸附树脂HP2MGL，苯乙烯型极性大孔吸附树脂DA201为固定化载体，聚乙二烯基苯-丙烯酸酯大孔树脂

ECR1030。

1.1.3树脂预处理

称取6种树脂各100 g置于500 mL 烧杯中，加入95%乙醇300 mL 浸泡24 h后抽滤，并用去离子水洗至没有乙醇味；用300 mL的5%HCl 溶液浸泡4 h，抽滤，用去离子水洗至中性；再用2%NaOH 溶液浸泡4 h后抽滤，并用去离子水洗至中性。

将洗至中性的树脂用pH=5.6 的磷酸盐缓冲液浸泡，隔一定时间抽滤，检测滤液的pH并加入新的磷酸盐缓冲液继续浸泡，直至滤液的pH与缓冲液一致。将滤干后的树脂置于4℃冰箱中保存备用。1.1.4固定化脂肪酶G50的制备

将0.6g脂肪酶Lipase G50溶解于10mlPH为5.6的磷酸盐缓冲液中，加入2g预处理的大孔树脂于30℃摇床振荡（160r/min）吸附8h 后，抽滤回收固定化酶，用同种缓冲液洗涤固定化酶,洗涤过的固定化酶于30℃下真空干燥4（水分含量15%），4℃冰箱保存待用。

1.1.6.2固定化酶酯化活力的测定

脂肪酶酯化活力定义为在标准反应条件下每分钟生成1μmol 的丙基月桂酸酯所需的酶量为一个酶活力单位（U ）。固定化脂肪酶活力参照诺维信标准分析方法进行。

测定方法：将8 g 月桂酸与2.4 g 丙醇（摩尔比1:1）加入50 mL 锥形瓶中，置于恒温摇床（60 °C ，180 rpm ）振荡30 min ，待月桂酸为液态后，加入0.1 g 固定化酶，恒温振荡反应10 min ，取样。用气相色谱检测，计算月桂酸酯化率。固定化酶的酯化活力按下式计算：

M C N X ⨯⨯⨯=101000000

（式2）

式中：X ——固定化酶酯化活力，U/g ；N ——初始加入的月桂酸摩尔数；

C ——月桂酸酯化率；10——反应时间， min ；M ——加入固定化酶的质量，g 。

固定化酶比酯化活力按下式计算：

P C N X ⨯⨯⨯=101000000

（式3）

式中：X ——固定化酶比酯化活力，U/g ；N ——初始加入的月桂酸摩尔数；

C ——月桂酸酯化率，10——反应时间，min ；P ——加入固定化酶中吸附的蛋白质量，mg 。

固定化酶比酯化活力＇按下式计算：

N C N X ⨯⨯⨯=101000000

（式４）

式中：X ——固定化酶酯化活力，U/g ；N ——初始加入的月桂酸摩尔数；

C ——月桂酸酯化率；10——反应时间，min ；N ——加入固定化酶载体质量和吸附蛋白质量之和，g 。

1.1.5固定化条件的优化

1.1.5.1固定化pH 的优化

树脂加酶量80 mg/g ，缓冲液的pH 分别设定为 (4.0,4.5, 5.0,5.5, 6.0,6.5,7.0, 7.5)，缓冲液离子浓度为优化条件下的离子浓度，室温震荡8 h 后进行抽滤，真空35 °C 下干燥6 h 后，比较各固定化酶的蛋白吸附量和酶活情况；

1.1.5.2 固定化加酶量的优化

树脂加酶量分别设定为（40 mg/g ，60 mg/g ，80 mg/g ，100 mg/g ，120 mg/g ），缓冲液的pH 为优化条件下的pH ，缓冲液离子浓度为优化条件下的离子浓度，室温震荡8 h 后进行抽滤，真空35 °C 下干燥6 h 后，比较各固定化酶的蛋白吸附量和酶活情况；

1.1.6固定化酶的性质研究

1.1.6.1蛋白吸附量的测定

称取0.10 g 牛血清蛋白，用水溶解，摇匀，定容至1000 mL ，得

到浓度为100 mg/L 的蛋白标准溶液。分别准确吸取该蛋白溶液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL 于10 mL 具塞试管中，补加去离子水至1 mL ，再分别加入5 mL 考马斯亮蓝G250溶液，摇匀，静置2 min ，于595nm 处测吸光度，每个操作重复3次，误差不超过5%。以蛋白量/mg 为横坐标，以吸光度A 为纵坐标，绘制蛋白标准曲线。 蛋白质含量采用考马斯亮蓝法测定。吸附量的计算公式如下：

%100g /mg 121⨯-=W X X ）（单位树脂的蛋白吸附量 （式1） 式中：X1表示吸附前酶液的蛋白含量（mg ）；X2表示吸附后酶液的蛋白含量；W1表示加入树脂的量（g ）。

1.1.6固定化载体参数及表征 载体参数

表征方法 粒径（mm ）

SEM 统计法 比表面积 (m2/g ）

BET 氮气吸附法 孔径（A ）

BJH 计算模型 水分含量（%）

水分自动分析仪 孔体积（mg/g ）

汞泵仪 载体刚性

紫外可见吸收光谱法 机械稳定性

球磨机试验

1.1.6.1粒径

SEM 统计法：扫描电镜下，统计载体颗粒的粒径。

1.1.6.2比表面积 (m 2/g ）

BET 氮气吸附法：原理：在等温条件下，通过测定不同压力下材料对气体的吸附量, 获得等温吸附线，应用适当的数学模型推算材料