实验二 琼脂糖凝胶电泳实验知识交流
琼脂糖凝胶电泳实验
琼脂糖凝胶电泳实验一、实验原理：琼脂糖凝胶电泳是分离和纯化DNA 片段的常用技术。
把DNA样品加入到一块包含电解质的多孔支持介质（琼脂糖凝胶）的样品孔中，并置于静电场上。
由于DNA分子的双螺旋骨架两侧带有含负电荷的磷酸根残基，因此在电场中向正极移动。
在一定的电场强度下，DNA分子的迁移速度取决于分子筛效应。
具有不同的相对分子质量的DNA片段泳动速度不一样，因而可依据DNA分子的大小来使其分离。
凝胶电泳不仅可分离不同分子质量的DNA，也可以分离相对分子质量相同，而构型不同的DNA分子。
在电泳过程中可以通过示踪染料或相对分子质量标准参照物和样品一起进行电泳而得到检测。
相对分子质量标准参照物相对可以提供一个用于确定DNA片段大小的标准。
在凝胶中加入少量溴化乙锭(ethidium bromide, EB)或者ＥＢ类似物，其分子可插入DNA的碱基之间，形成一种络合物，在254～365nm波长紫外光照射下，呈桔红色荧光，因此也可对分离的DNA进行检测。
一般琼脂糖凝胶电泳适用于大小在0.2kb～50kb范围内的DNA 片段。
三种不同构型分子进行电泳时的迁移速度大小顺序为：超螺旋DNA>线性DNA>开环DNA正确选择凝胶浓度对于琼脂糖凝胶电泳，浓度通常在0.5～2％之间，低浓度的用来进行大片段核酸的电泳，高浓度的用来进行小片段分析。
低浓度胶易碎，小心操作和使用质量好的琼脂糖是解决办法。
注意高浓度的胶可能使分子大小相近的DNA带不易分辨，造成条带缺失现象。
适合的电泳缓冲液常用的缓冲液有TAE和TBE，而TBE比TAE有着更好的缓冲能力。
电泳时使用新制的缓冲液可以明显提高电泳效果。
注意电泳缓冲液多次使用后，离子强度降低，PH 值上升，缓冲性能下降，可能使DNA电泳产生条带模糊和不规则的DNA带迁移的现象。
Marker的选择DNA电泳一定要使用DNA Marker或已知大小的正对照DNA来估计DNA片段大小。
琼脂糖凝胶电泳实验报告
琼脂糖凝胶电泳实验报告引言琼脂糖凝胶电泳是一种重要的实验技术，广泛应用于生物学、医学、食品科学等领域。
本文将介绍琼脂糖凝胶电泳的原理、实验步骤和结果分析，并探讨其在蛋白质分离与分析中的应用。
正文一、原理琼脂糖凝胶电泳是一种基于电荷与尺寸的分离技术。
琼脂糖是一种天然多糖，在适当条件下能形成渗透性较小的凝胶状。
当电场施加在凝胶上时，电荷带负的样品分子会被推向正电极，电荷带正的样品分子则被推向负电极，从而实现了分离。
二、实验步骤1. 准备样品：将待分离的蛋白质样品加入一定体积的载体溶液中，混合均匀。
2. 制备琼脂糖凝胶：根据需要分离的蛋白质的大小范围选择不同浓度的琼脂糖制备凝胶。
3. 装置电泳槽：将琼脂糖凝胶放置在电泳槽中，注入足够的电泳缓冲液，以确保电泳过程中的稳定性。
4. 分析样品：将样品加入琼脂糖凝胶槽中的孔上，并施加适当电压，使样品分子在凝胶中迁移。
5. 染色与可视化：电泳结束后，可以使用染料对凝胶进行染色，以可视化待分析的蛋白质条带。
6. 结果分析：根据蛋白质条带的迁移距离和形态，进行结果的解读和分析。
三、实验结果在本次实验中，我们使用琼脂糖凝胶电泳技术分离了不同分子量的蛋白质样品。
结果显示，随着样品分子量的增大，迁移距离逐渐增加，形成了不同大小的蛋白质条带。
通过与已知分子量的标准品进行对比，我们可以确定待分析样品的分子量范围。
四、讨论与应用琼脂糖凝胶电泳是一种常用的分子生物学技术，在蛋白质分离与分析中具有广泛的应用。
它可以用于研究蛋白质的结构、功能和相互作用关系。
同时，琼脂糖凝胶电泳还可以检测蛋白质的表达水平和纯度，并在生物医药领域中寻找新药靶点、分析疾病标志物等方面起到重要作用。
然而，琼脂糖凝胶电泳也存在一些局限性，如无法分离分子量较大的蛋白质，分辨率相对较低等。
因此，研究人员在分离与分析蛋白质时还需综合考虑实验目的和样本特点，选择合适的方法和技术。
总结琼脂糖凝胶电泳是一种常用的分离与分析蛋白质的技术。
实验2-PCR与琼脂糖凝胶电泳-New
1）吸取18µl水稻总DNA+3µl loading buffer, 混匀
Mark DNA: 5µl λDNA-HindⅢ
2） PCR产物+3µl loading buffer，混匀
Mark DNA : 5µl 100bp DNA 5、电泳：打开电源开关，调节电压至3-5 V/cm（约 100V），注意电极方向（可见到溴酚蓝条带 从负极向正极移动）；约30min后可观察 。
10× PCR buffer：
500mM KCl 200mM Tris-HCl（pH8.3）
0.01% 明胶 （ gelatin ）
15-20mM MgCl2
1×TBE缓冲液（1000ml）：电场中的导体 Tris 硼酸 EDTA 10.8 g 5.5 g 0.93 g
载样缓冲液（6×）：含指示剂溴芬蓝和二甲苯青，可在 可见光下指示样品的泳动过程 溴芬蓝 二甲苯青 甘油 0.25 % 0.25 % 30 %
0.2 µ l 引物R（10 µ M） :22179R
0.2 µ l Taq酶（5U/ µ l） 15.2 µ l ddH2O Total 18.0 µ l 模板DNA， 混匀，放入PCR仪中开始反应
最后加 2 µ l
PCR技术
PCR反应混合液（总体积20 µl）
成 份 ddH2O 1 15.2 n n × 15.2 10 152 25 380
72 ℃，延伸5 min PCR反应在带热盖的PCR仪上进行，大约
需要2小时。
电泳技术
3、制胶（浓度为2%）：
1）称取2.0g 琼脂糖，加入盛有200ml 1×TBE电泳缓冲 液的500ml蓝盖瓶中，摇匀，在微波炉上加热至琼脂 糖完全溶解，冷却到60 ℃，加入10µl Goldview并摇 匀。
琼脂糖凝胶电泳 (2)
琼脂糖凝胶电泳1. 引言琼脂糖凝胶电泳是一种常用的分离和纯化生物大分子的方法，尤其适用于核酸和蛋白质的分析。
琼脂糖凝胶电泳的原理是利用琼脂糖凝胶的孔隙来分离不同大小或不同电荷的生物大分子。
本文将介绍琼脂糖凝胶电泳的基本原理、实验步骤和一些常见应用。
2. 基本原理琼脂糖凝胶电泳是基于凝胶体系的电泳方法，其中琼脂糖是一种用于制备凝胶的生物高分子多糖。
琼脂糖凝胶是一种三维网状结构，其中的孔隙可以根据其浓度来调节。
通常，低浓度的琼脂糖凝胶可以分离较大的分子，而高浓度的琼脂糖凝胶可以分离较小的分子。
琼脂糖凝胶电泳的分离机制主要有两种：大小分离和电荷分离。
对于大小分离，较大的分子由于受到凝胶孔隙的限制而不能快速通过，因此迁移速度较慢；而较小的分子则可以更快地通过凝胶孔隙，迁移速度较快。
对于电荷分离，带电的分子会受到电场力的作用而迁移，不带电的分子则不会迁移。
3. 实验步骤琼脂糖凝胶电泳的实验步骤如下：3.1 准备凝胶首先，需要准备琼脂糖凝胶。
可以根据需要选择合适的琼脂糖浓度和凝胶类型。
一般情况下，使用琼脂糖浓度为0.7%-1.2%的琼脂糖凝胶。
3.2 加载样品将待分析的样品混合上染料，通常是一种含有荧光标记或色带的缓冲液。
混合后，将样品加载到凝胶孔隙中。
3.3 进行电泳将装有样品的凝胶浸泡在电泳缓冲液中，通常为含有缓冲盐和pH缓冲剂的缓冲液。
然后，将电泳槽连接到电源上，设定合适的电场强度和时间。
3.4 分析结果在电泳过程中，样品会根据其大小或电荷迁移到凝胶上。
电泳完成后，可以使用紫外线照射或染色方法来可视化样品的分离结果。
可以根据分离的位置和迁移距离来判断样品的大小或电荷。
4. 应用琼脂糖凝胶电泳在生物学研究和生物工程领域广泛应用。
以下是一些常见的应用：4.1 DNA分析琼脂糖凝胶电泳是分析和检测DNA的常用方法。
通过琼脂糖凝胶电泳，可以分离DNA片段，并确定其长度和浓度。
这对于DNA测序、基因突变分析和DNA指纹鉴定非常重要。
琼脂糖凝胶电泳实验原理和实验方法
琼脂糖凝胶电泳实验原理和实验方法琼脂糖凝胶电泳实验原理和实验方法[实验原理]电泳是现在用于分离和纯化DNA片段的最常用技术。
包含电解质的多孔支持介质----“胶”并把它置于静电场中。
则DNA分子将向阳极移动，这是因为DNA分子沿其双螺旋骨架两侧带有含负电荷的磷酸根残基。
当DNA长度增加时，来自电场的驱动力和来自凝胶的阻力之间的比率就会降低，不同长度的DNA片段就会表现出不同的迁移率。
因而就可依据DNA分子的大小来使其分离。
该过程通过把示踪染料（Purple Loading Dye）或分子量标准参照物(Ladder)和样品(DNA&RNA)一起进行电泳而得到检测。
分子量标准参照物也可以提供一个用于确定DNA片段大小的标准。
琼脂糖凝胶适用于分离大小在0.2-50Kb范围内的DNA片段。
[实验用品]1.琼脂糖 1.0%1.0g琼脂糖+100ml电泳缓冲液(TAE),微波炉中火30秒至沸腾,熔化的琼脂物冷却至60℃时可加入10mg/ml溴化乙锭10μl,充分混匀,将温热的凝胶倒入已置好梳子(鉴定胶用细密点的梳子；回收胶用粗稀的梳子）的胶膜中在室温下放置30-45min后现进行电泳。
1.5%:琼脂糖1.5g。
2.电泳缓冲液50×TAE Tris 乙酸 Tris 242g 终2 mol/L乙酸57.1ml 终1mol/L0.5M EDTA200ml pH8.0 终100mmol/LdH2O 补足至1000ml使用时稀释1×TAE。
5×TBE Tris 硼酸 Tris 54g 终445mmol/L硼酸27.5g 终445mmol/L0.5M EDTA20ml pH8.0 终10mmol/LdH2O 补足至1000ml使用时稀释10倍成0.5倍如50ml贮存液+450ml水→500ml工作液。
[实验内容与方法]1.移取适量的琼脂糖(如制备1%的琼脂糖胶液就移1g的琼脂糖溶于100ml TAE缓冲液中)微波炉加热使其溶于TAE缓冲液中。
实验琼脂糖凝胶电泳的原理和方法
实验琼脂糖凝胶电泳的原理和方法实验琼脂糖凝胶电泳（Agarose gel electrophoresis）是一种常用的分离DNA和RNA分子的技术。
它基于琼脂糖凝胶电泳原理，利用琼脂糖凝胶的孔隙大小和电泳电场的力对DNA和RNA分子进行分离。
琼脂糖是一种高分子多糖，当加热溶解后冷却凝固时，形成一个多孔的凝胶网络。
这个凝胶网络中的孔隙大小是可以调控的，通过改变琼脂糖的浓度可以得到不同孔隙大小的凝胶。
1.制备琼脂糖凝胶：按照实验需要，称取适量琼脂糖加入缓冲液中，搅拌使其溶解，然后加热至溶解。
等溶液冷却至约50℃时，在一个电泳板间夹两块玻璃片或塑料片，将琼脂糖凝胶溶液倒入电泳板中，并将梳子插入凝胶中，让凝胶固化。
2.样品制备：将要检测的DNA或RNA分子提取和纯化，并用缓冲液稀释合适浓度。
添加适量的DNA荧光染料或核酸染色剂，使其在紫外光下可见。
3.样品加载：将样品加入琼脂糖凝胶的凝胶孔口中，注意不要将样品推到凝胶中。
4.电泳分离：将凝胶板放入电泳槽中，加入适量缓冲液，注意保证电泳液中缓冲液位置高于凝胶。
然后将负极电极和正极电极分别连接到电泳槽的两端，开启电源，施加适当电压使DNA或RNA分子在电场力的作用下进行电泳分离。
5.染色和可视化：电泳结束后，取出凝胶板，并用染色剂对DNA或RNA分子进行染色。
染色剂与DNA或RNA结合后，用紫外光照射凝胶，通过相应设备观察凝胶上的条带形成。
实验琼脂糖凝胶电泳的原理是基于DNA和RNA分子在电场下按照大小进行分离的特性。
在电场作用下，DNA或RNA分子荷负性被引向正极（阴极）方向移动。
琼脂糖凝胶的孔隙大小可以根据需要调控，大分子难以通过，小分子易于通过。
因此，DNA或RNA分子根据其大小不同，通过孔隙大小的限制，从而形成条带，完成了对DNA或RNA的分离。
琼脂糖凝胶电泳技术的原理和方法
（3）溴化乙锭为扁平状分子，在紫外光照射下发射荧光。EB可与DNA分子形成 EB-DNA复合物，其荧光强度与DNA的含量成正比。据此可判断DNA分子量大小
和粗略估计样品DNA浓度。
三 仪器、材料与试剂
1.质粒样品、酶切样品和PCR样品。 2.凝胶电泳系统和电泳图像分析系统(凝胶成像系统)等。 3.琼脂糖、 1XTAE电泳缓冲液、Goldview、 6X载样缓冲
2.凝胶成像分析系统
3.Marker
一个已知分子质量的 DNA 样品做最对照，用来确定待 测样品的相对分子质量。
4.常用电泳缓冲液
缓冲液
TAE
TBE TPE
缓冲容量 最低 很高
Байду номын сангаас迁移速度 最快
(高10％)
较慢
分辨率
用途
高度复杂DNA混 高分子量高 合物；超螺旋
DNA
低分子量高
价格昂贵，不常 用
5.上样缓冲液
配制多大浓度的琼脂糖凝胶，要根据被检的DNA分子大小来确定。琼 脂糖是一种线性多糖聚合物。浓度越高，孔隙越小，其分辨能力就越强。
表1 琼脂糖凝胶的浓度与DNA分子大小的关系
琼脂糖浓度(%) 0.3 0.6 0.7 0.9 1.2 1.5 12.0
线型DNA分子的分离范围(Kb) 5～60 1～20 0.8～10 0.5～7 0.9～6 0.2～3 0.1～2
液 （ 6X loading buffer）和DNA分子量标准（Marker ） 等。
1.凝胶电泳系统
美国Bio-rad伯乐 小型水平电泳槽Mini-Sub Cell GT Cell
DYY-6C型 双稳定时电泳仪电源（北 京六一） 输出范围（显示分辨率）： 6-600V(1V) 4-400mA (1mA) 240W
实验二 琼脂糖凝胶电泳实验
实验二琼脂糖凝胶电泳实验【实验目的】（1）学习琼脂糖凝胶电泳的基本原理；（2）掌握使用水平式电泳仪的方法；（3）学习在含有甲醛的凝胶上进行RNA电泳的方法。
【实验原理】琼脂糖凝胶电泳是基因工程实验室中分离鉴定核酸的常规方法。
核酸是两性电解质，其等电点为pH2-2.5，在常规的电泳缓冲液中（pH约8.5），核酸分子带负电荷，在电场中向正极移动。
核酸分子在琼脂糖凝胶中泳动时，具有电荷效应和分子筛效应，但主要为分子筛效应。
因此，核酸分子的迁移率由下列几种因素决定：（1）DNA的分子大小。
线状双链DNA分子在一定浓度琼脂糖凝胶中的迁移速率与DNA分子量对数成反比，分子越大则所受阻力越大，也越难于在凝胶孔隙中移动，因而迁移得越慢。
（2）DNA分子的构象。
当DNA分子处于不同构象时,它在电场中移动距离不仅和分子量有关,还和它本身构象有关。
相同分子量的线状、开环和超螺旋质粒DNA在琼脂糖凝胶中移动的速度是不一样的，超螺旋DNA移动得最快，而开环状DNA移动最慢。
如在电泳鉴定质粒纯度时发现凝胶上有数条DNA带难以确定是质粒DNA不同构象引起还是因为含有其他DNA引起时，可从琼脂糖凝胶上将DNA带逐个回收，用同一种限制性内切酶分别水解，然后电泳，如在凝胶上出现相同的DNA图谱，则为同一种DNA。
（3）电源电压。
在低电压时，线状DNA片段的迁移速率与所加电压成正比。
但是随着电场强度的增加，不同分子量的DNA片段的迁移率将以不同的幅度增长，片段越大，因场强升高引起的迁移率升高幅度也越大，因此电压增加，琼脂糖凝胶的有效分离范围将缩小。
要使大于2kb 的DNA 片段的分辨率达到最大，所加电压不得超过5v/cm。
（4）离子强度影响。
电泳缓冲液的组成及其离子强度影响DNA的电泳迁移率。
在没有离子存在时（如误用蒸馏水配制凝胶），电导率最小，DNA几乎不移动；在高离子强度的缓冲液中（如误加10×电泳缓冲液），则电导很高并明显产热，严重时会引起凝胶熔化或DNA变性。
琼脂糖凝胶电泳高中生物知识点
琼脂糖凝胶电泳高中生物知识点一、琼脂糖凝胶电泳的原理。
1. 基本原理。
- 琼脂糖凝胶电泳是一种用于分离、鉴定和纯化DNA或RNA片段的方法。
琼脂糖是一种从海藻中提取的多糖，当琼脂糖加热到90 - 100℃时溶解，冷却到35 - 45℃时形成凝胶。
- DNA和RNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时，由于它们的磷酸骨架带有负电荷，在电场的作用下向正极移动。
其迁移速度主要取决于核酸分子的大小、形状以及琼脂糖凝胶的浓度等因素。
2. 分子筛效应。
- 琼脂糖凝胶具有多孔性，像一个分子筛。
较小的DNA或RNA分子在凝胶中能够更容易地穿过孔隙，迁移速度较快；而较大的分子受到孔隙的阻碍较大，迁移速度较慢。
- 例如，100bp的DNA片段比1000bp的DNA片段在相同条件下迁移得更快。
二、琼脂糖凝胶电泳的操作步骤（以DNA电泳为例）1. 制备琼脂糖凝胶。
- 根据要分离的DNA片段大小选择合适的琼脂糖浓度。
一般来说，低浓度（如0.7% - 1%）的琼脂糖凝胶适合分离较大的DNA片段（数千bp以上），高浓度（如2% - 3%）适合分离较小的DNA片段（100 - 1000bp）。
- 称取适量的琼脂糖，加入到电泳缓冲液（如TAE或TBE缓冲液）中，加热至琼脂糖完全溶解。
例如，要制备1%的琼脂糖凝胶，称取1g琼脂糖，加入到100mL的1×TAE缓冲液中，在微波炉中加热，期间要不时搅拌，直至琼脂糖完全溶解。
- 将溶解好的琼脂糖溶液倒入电泳槽的模具中，插入梳子，待凝胶冷却凝固（约20 - 30分钟）。
2. 加样。
- 在凝胶凝固后，小心拔出梳子，将电泳槽放入电泳仪中，加入电泳缓冲液，使缓冲液没过凝胶。
- 将DNA样品与适量的上样缓冲液（通常含有甘油、溴酚蓝等指示剂）混合。
上样缓冲液的作用是增加样品的密度，使样品能够沉入加样孔中，同时溴酚蓝等指示剂可以指示电泳的进程。
- 用微量移液器将混合好的样品小心加入到加样孔中。
3. 电泳。
实验二、DNA凝胶电泳
实验二、DNA凝胶电泳
二、琼脂糖凝胶电泳：
1．DNA分子大小：线性DNA分子在一定琼脂糖浓度内的迁移率与DNA分 子量的对数成反比。
2．琼脂糖浓度：小于0.5kb 的DNA片段所需的凝胶浓度为1.2-1.5%; 分离大于10kb 的DNA片段所需的凝胶浓度为0.3-0.7%; DNA片段大 小在两者之间的所需的凝胶浓度为0.8-1.0%。
3、DNA分子构象：对相同分子量的质粒DNA的三种构象，超 螺旋DNA移动最快，而线状双链DNA移动最慢。
4．电源电压：在低电压时，线性DNA片段的移动速率与所 加电压成正比，但电压增高，不同分子量的DNA片段的移 动速率将以不同幅度增加；片段越大，升高的幅度也越 大。因此电压增高，琼脂糖有效分离范围将缩小。一般 所加电压不得超过5V/cm.
箔或黑纸包裹容器，储于温室即可。 4、DNA分子量标准：
DNA/EcoR I/Hind III: DNA/EcoR I: 21.2, 7.4, 5.8, 5.6, 4.9和 2.5kb。 DNA/ Hind III: 23.1, 9.4, 6.6, 4.4, 2.3, 2.0, 0.56和 0.12kb.
实验二、DNA凝胶电泳
三、试剂： 1、5TBE缓冲液：Tris. 54g, 硼酸27.5g, 加入20ml
的0.5mol/L EDTA(pH8.0), 定溶至1000ml. 2、6上样缓冲液：0.25% 溴酚兰, 40%(w/v)蔗糖水溶液。 3、溴化乙啶（EB）溶液母液：将EB配制成10mg/L，用铝
实验二、DNA凝胶电泳
实验二、DNA凝胶电泳
一、概述
琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶电泳是分离和纯化DNA片段 的标准方法。其中，琼脂糖凝胶分离DNA片段大小范围较 广，不同浓度琼脂糖凝胶可分离长度从200bp至近50kb的 DNA片段。
实验二 琼脂糖凝胶电泳
5、原梳齿处(样品孔)即被缓冲液充满，如 发现有气泡，应设法去除。
6、样品准备：向核酸样品中加入约为样品体 积1/10的上样缓冲液，用加样器轻轻混匀。 7、上样：用加样器吸取样品，轻轻的加入 到凝胶的样品孔中。加样量一般5-7μl。
8、盖上电泳槽，接通电源，开始电泳 开始电泳前，再次确认凝胶样品孔处于电场的负极。 电泳条件：电压100v；时间20-30分钟左右
LOGO
实验二 琼脂糖凝胶电泳
1、教学目的与要求：
学习与掌握DNA电泳的技术方法，利用 琼脂糖凝胶电泳检测DNA纯度、含量以及分 子量，及分离不同大小DNA片段。
2、实验原理：
电泳概念及种类 影响琼脂糖电泳迁移的主要因素
原理
DNA 分子是两性电解质， 在高于其等电点的溶 液（ pH8.0~pH8.3 ）中 ，碱基几乎不解离， 磷酸基团全部解离， DNA 分子带负电荷，在电 场中向正极移动。 电泳时DNA 分子颗粒在电场中通过凝胶介质而泳 动。颗粒带净电荷多，直径小而接近于球形，则 在电场中泳动速度快，反之则泳动速度慢。
主要检测：分子量，含量及有无
影响DNA在琼脂糖凝胶中迁移率的因素 • 凝胶浓度 • DNA分子大小 • DNA分子的构象 • 缓冲液 • 电泳电压
DNA分子的大小
双链DNA分子在凝胶中迁移的速率与其碱基数的 常用对数成反比。 分子越大，迁移越慢。一是摩擦阻力越大，二是 大分子通过凝胶孔径的效率低于较小的分子。
电泳操作步骤(整个过程要求带一次性手套) 1、胶槽准备
①取出胶板和梳子，将胶板放入胶槽中; ②将梳子垂直插入到胶槽的小凹槽内，梳齿底 端和板面有1mm的间隙; ③将胶槽放在调整好的水平台上。
实验二质粒的酶切和琼脂糖凝胶电泳检测
评估酶切效率，判断酶切是否完全，以及酶切片段的产量是否符 合预期。
酶切产物纯度检测
通过电泳图谱分析，判断酶切产物是否纯净，是否存在其他杂质 或非特异性产物。
琼脂糖凝胶电泳检测结果分析
跑胶效果评估
评估凝胶的均匀性和完整性，判断电泳是否正常进行。
染色效果分析
判断染料的染色效果，以及是否能够清晰地显示出各条带的位置和 大小。
掌握琼脂糖凝胶电泳 的工作原理和分离机 制。
了解琼脂糖凝胶电泳 的荧光染料和检测方 法。
了解电泳过程中 DNA分子的迁移速 率与分子量的关系。
掌握琼脂糖凝胶电泳检测操作
学会配制琼脂糖凝胶和电泳缓冲液。
学会分析电泳结果，判断酶切效果。
掌握点样、电泳和染ຫໍສະໝຸດ 等操作步骤。02实验原理
质粒酶切原理
01
02
实验安全须知
实验过程中应佩戴一次性手套 、口罩和实验服，避免直接接
触试剂和样品。
酶切反应中使用的限制性内切 酶具有生物活性，应避免吸入
和直接接触皮肤。
琼脂糖凝胶电泳检测时，应注 意紫外线对人体的伤害，避免 长时间直接照射。
实验结束后，应按照实验室规 定正确处理废物，确保环境安 全。
实验拓展与思考
实验二质粒的酶切和琼脂糖凝胶电 泳检测
目录
• 实验目的 • 实验原理 • 实验步骤 • 结果分析 • 注意事项与实验拓展
01
实验目的
掌握质粒的酶切技术
01
了解限制性内切酶的种类和作用机制。
02
掌握质粒的酶切反应条件和操作步骤。
学会使用琼脂糖凝胶电泳检测酶切产物。
03
了解琼脂糖凝胶电泳检测原理
条带识别与对比
实验二 质粒DNA的琼脂糖凝胶电泳.
实验二质粒DNA的琼脂糖凝胶电泳一、实验目的掌握琼脂糖凝胶电泳的原理和方法，初步估算双链线性未知DNA分子的大小。
学习质粒的琼脂糖凝胶电泳方法。
二、实验原理琼脂糖是从琼脂中分离制备的链状多糖，是由β－D－吡喃型半乳糖和3,6－脱水－β－L－吡喃型半乳糖以糖苷键相互交替（1,3－1,4）连接而成的一种线性半乳多聚糖，它能够在热的溶剂中溶化并在冷却过程中形成凝胶。
许多琼脂糖分子依靠氢键及其他力的作用使其互相盘绕形成绳状琼脂糖束，构成大网孔型凝胶。
该物质对尿素和盐酸胍等破坏氢键的试剂有较强的抵抗力。
在 pH4.0－9.0的缓冲液中是稳定的。
由于其分子上无带电基团，在缓冲液离子强度大于 0.05 时，对蛋白质无吸附作用，也无电渗现象，因而分辨率和重现性均较好，是一种优良的电泳材料。
在一定浓度的琼脂糖凝胶介质中，如 DNA 分子的电泳迁移率与其分子量、分子构型和所用缓冲液对迁移率相关。
当凝胶浓度太高时，凝胶孔径变小，环状DNA 不能进入胶中，相对迁移率为零，而同等大小的线性 DNA 可以按长轴方向前移，相对迁移率大于零。
DNA分子在电场中会向正极方向移动，不同长度的DNA由于受到凝胶介质的阻力不同，表现为不同的迁移率而被分开。
三、仪器设备、材料与试剂仪器设备电泳仪电炉凝胶成像系统电子天平 pH计量筒（10 mL，100 mL，500 mL，1 000 mL）烧杯（50 mL，100 mL，500 mL，1 000 mL）一次性手套无粉乳胶手套（光明牌，大、中、小三种号码）玻璃棒称量勺微量移液器（1 000 μL，200 μL，20 μL）灭菌的1.5 mL离心管（eppendorf管）灭菌吸头（1 000 μL，200 μL，20μL），相应的吸头盒吸水纸 100mL三角瓶材料：碱法提取获得的质粒DNA样品，标准相对分子量DNA（Marker）四、试剂配制：● 50×TAE电泳缓冲液母液：50ml母液加入体积终浓度Tris碱12.1g冰乙酸 2.85ml0.1M Na2EDT A·2H2O （pH8.0）25ml无菌水至50ml实验时，取1mL50×TAE电泳缓冲液母液，加49mL双蒸水稀释成1×TAE ● 6×DNA电泳上样液母液加入体积终浓度溴酚蓝0.25%二甲苯氰0.25%蔗糖水溶液40%（W/V）● Gel Red贮存液操作时应戴一次性手套五、实验步骤(一电泳前准备准备内容作用1.刷干净电泳制胶的梳子，板子，槽子，蒸馏水洗净晾干防止不必要的重复污染，减少外来的污染。
琼脂糖凝胶电泳!相关知识
琼脂糖凝胶电泳！相关知识原理琼脂糖凝胶电泳是用琼脂糖作支持介质的一种电泳方法。
其分析原理与其他支持物电泳的最主要区别是：它兼有“分子筛”和“电泳”的双重作用。
琼脂糖凝胶具有网络结构，物质分子通过时会受到阻力，大分子物质在涌动时受到的阻力大，因此在凝胶电泳中，带电颗粒的分离不仅取决于净电荷的性质和数量，而且还取决于分子大小，这就大大提高了分辨能力。
但由于其孔径相当大，对大多数蛋白质来说其分子筛效应微不足道，现广泛应用于核酸的研究中。
蛋白质和核酸会根据pH不同带有不同电荷，在电场中受力大小不同，因此跑的速度不同，根据这个原理可将其分开。
电泳缓冲液的pH在6~9之间，离子强度0.02~0.05为最适。
常用1%的琼脂糖作为电泳支持物。
琼脂糖凝胶约可区分相差100bp的DNA片段，其分辨率虽比聚丙烯酰胺凝胶低，但它制备容易，分离范围广。
普通琼脂糖凝胶分离DNA的范围为0.2-20kb，利用脉冲电泳，可分离高达10^7bp的DNA片段。
操作流程准备干净的配胶板和电泳槽注意DNA酶污染的仪器可能会降解DNA，造成条带信号弱、模糊甚至缺失的现象。
选择电泳方法一般的核酸检测只需要琼脂糖凝胶电泳就可以；如果需要分辨率高的电泳，特别是只有几个bp的差别应该选择聚丙烯酰胺凝胶电泳；用普通电泳不合适的巨大DNA链应该使用脉冲凝胶电泳。
注意巨大的DNA链用普通电泳可能跑不出胶孔导致缺带。
正确选择凝胶浓度对于琼脂糖凝胶电泳，浓度通常在0.5～2％之间，低浓度的用来进行大片段核酸的电泳，高浓度的用来进行小片段分析。
低浓度胶易碎，小心操作和使用质量好的琼脂糖是解决办法。
注意高浓度的胶可能使分子大小相近的DNA带不易分辨，造成条带缺失现象。
适合的电泳缓冲液常用的缓冲液有TAE和TBE，而TBE比TAE有着更好的缓冲能力。
电泳时使用新制的缓冲液可以明显提高电泳效果。
注意电泳缓冲液多次使用后，离子强度降低，pH值上升，缓冲性能下降，可能使DNA电泳产生条带模糊和不规则的DNA带迁移的现象。
琼脂糖凝胶电泳注意事项和常见问题
琼脂糖凝胶电泳注意事项和常见问题核酸分子是两性解离分子，在高于其等电点的电泳缓冲液中，其碱基不解离，而磷酸基团全部解离，核酸分子因而带负电荷，电泳时向正极迁移。
琼脂糖主要从海洋植物琼脂中提取而来并经糖基化修饰，为一种聚合链线性分子，使用琼脂糖凝胶作为电泳支持介质，发挥分子筛功能，使得大小和构象不同的核酸分子的迁移率出现较大差异，从而达到分离的目的。
琼脂糖凝胶电泳操作简单、快速，通过调整其使用浓度，使得分辨率达到大多数实验的要求，因此成为分离、鉴定、纯化核酸分子的常用方法。
但操作过程中仍有不少要注意的问题。
1 凝胶制作1．1 凝胶浓度配制凝胶的浓度据实验需要而变，一般在0．8％～2．0％之间，如果一次配制凝胶100 ml，没用完的凝胶可以再次融化，但随着融化次数的增加，水分丢失也越多，凝胶浓度则会越来越高，导致实验结果不稳定，补水办法：一是在容器上标记煮胶前的刻度，煮胶后补充相应的水分至原刻度；二是在煮胶前称重，煮胶后补充水至原重量。
粗略一点的方法是通过多次较恒定的煮胶条件得出一个经验补水值。
以保证凝胶浓度基本维持在原浓度。
核酸染色剂溴化乙锭(ethidium bromide)可加在融化的琼脂糖中，终浓度为0．5 t*g ／ml；也可在电泳结束后染色。
1、2 梳板的选用一般每个制胶模具均配有多个齿型不同的梳板，梳齿宽厚，形成的点样孑L容积较大，用于DNA 片段回收实验等；相反，梳齿窄而薄，形成的点样孑L容积就较小，用于PCR产物、酶切产物鉴定等。
梳板的选择主要是看上样量的多少而定，一般来说，上样量小时尽量选择薄的梳板制胶，此时电泳条带致密清晰，便于结果分析。
另外，每次制胶时都要注意梳齿与底板的距离至少要1 mm，否则，拔梳板时易损坏凝胶孑L底层，导致点样后样品渗漏。
当然，点样孑L的破坏还与拔梳板的时间和方法有关，一般凝胶需冷却30 min 以上方可拔梳板，应急的情况下可以将成型的凝胶块放4℃冰箱中冷却15 min 左右，拔梳板的方法是将制胶槽放置在电泳槽中的电泳缓冲液中，然后垂直向上慢慢用力，因为有液体的润滑作用，梳板易拔出且不易损坏点样孑L。
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实验二琼脂糖凝胶电
泳实验
实验二琼脂糖凝胶电泳实验
【实验目的】
（1）学习琼脂糖凝胶电泳的基本原理；
（2）掌握使用水平式电泳仪的方法；
（3）学习在含有甲醛的凝胶上进行RNA电泳的方法。
【实验原理】
琼脂糖凝胶电泳是基因工程实验室中分离鉴定核酸的常规方法。
核酸是两性电解质，其等电点为
pH2-2.5，在常规的电泳缓冲液中（pH约8.5），核酸分子带负电荷，在电场中向正极移动。
核酸分子在琼脂糖凝胶中泳动时，具有电荷效应和分子筛效应，但主要为分子筛效应。
因此，核酸分子的迁移率由下列几种因素决定：
（1）DNA的分子大小。
线状双链DNA分子在一定浓度琼脂糖凝胶中的迁移速率与DNA分子量对数成反比，分子越大则所受阻力越大，也越难于在凝胶孔隙中移动，因而迁移得越慢。
（2）DNA分子的构象。
当DNA分子处于不同构象时,它在电场中移动距离不仅和分子量有关,还和它本身构象有关。
相同分子量的线状、开环和超螺旋质粒DNA在琼脂糖凝胶中移动的速度是不一样的，超螺旋DNA移动得最快，而开环状DNA移动最慢。
如在电泳鉴定质粒纯度时发现凝胶上有数条DNA带难以确定是质粒DNA不同构象引起还是因为含有其他DNA引起时，可从琼脂糖凝胶上将DNA带逐个回收，用同一种限制性内切酶分别水解，然后电泳，如在凝胶上出现相同的DNA图谱，则为同一种DNA。
（3）电源电压。
在低电压时，线状DNA片段的迁移速率与所加电压成正比。
但是随着电场强度的增加，不同分子量的DNA片段的迁移率将以不同的幅度增长，片段越大，因场强升高引起的迁移率升高幅度也越大，因此电压增加，琼脂糖凝胶的有效分离范围将缩小。
要使大于2kb 的DNA 片段的分辨率达到最大，所加电压不得超过5v/cm。
（4）离子强度影响。
电泳缓冲液的组成及其离子强度影响DNA的电泳迁移率。
在没有离子存在时（如误用蒸馏水配制凝胶），电导率最小，DNA几乎不移动；在高离子强度的缓冲液中（如误加10×电泳缓冲液），则电导很高并明显产热，严重时会引起凝胶熔化或DNA变性。
溴化乙啶(Ethidium bromide, EB)（1）能插入DNA分子中形成复合物，在波长为254nm紫外光照射下EB能发射荧光，而且荧光的强度正比于核酸的含量，如将已知浓度的标准样品作电泳对照，就可估算出待测样品的浓度。
由于溴化乙啶有致癌的嫌疑，所以现在也开发出了安全的染料，如Sybergreen。
常规的水平式琼脂糖凝胶电泳适合于DNA和RNA的分离鉴定；但经甲醛进行变性处理的琼脂糖电泳更适用于RNA的分离鉴定和Northern 杂交，因为变性后的RNA是单链，其泳动速度与相同大小的DNA分子量一样，因而可以进行RNA分子大小的测定，而且染色后条带更为锐利，也更牢固结合于硝酸纤维素膜上，与放射性或非放射性标记的探针发生高效杂交。
【试剂与器材】
（一）材料
电泳仪、水平电泳槽、样品梳子、琼脂糖等
（二）试剂
1、 50TAE(1000mL)：242g Tris,
57.1mL 冰醋酸，
18.6g EDTA。
2、 EB溶液：100mL水中加入1g溴化乙啶，磁力搅拌数小时以确保其完全溶解，分装，室温避光保存。
3、 DNA加样缓冲液：0.25%溴酚蓝，0.25%二甲苯青，50%甘油（w/v）。
4、 RNA甲醛变性胶上样缓冲液：0.25%溴酚蓝，0.25%二甲苯青，1mM EDTA(PH8.0)，50%甘油（w/v），用DEPC水配制，高压灭菌备用。
5、 5甲醛变性胶电泳缓冲液：0.1m MOPS(PH7.0)，40mM醋酸钠，5mM EDTA(PH8.0)，用DEPC 水配制，过滤除菌，室温避光保存。
淡黄色缓冲液可正常使用，深黄色应弃用。
【操作方法】
（一）常规的水平式琼脂糖电泳
制备琼脂糖凝胶：按照被分离DNA分子的大小，决定凝胶中琼脂糖的百分含量；一般情况下，可参考下表：
琼脂糖的含量（%）分离线状DNA分子的有效范围（Kb）
0.3 60-5
0.6 20-1
0.7 10-0.8
0.9 7-0.5
1.2 6-0.4
1.5 4-0.2
2.0 3-0.1
1．制备琼脂糖凝胶：称取琼脂糖，加入1x电泳缓冲液，待水合数分钟后，置微波炉中将琼脂糖融化均匀。
在加热过程中要不时摇动,使附于瓶壁上的琼脂糖颗粒进入溶液；加热时应盖上封口膜,以减少水份蒸发。
2．胶板的制备：将胶槽置于制胶板上,插上样品梳子,注意观察梳子齿下缘应与胶槽底面保持1mm左右的间隙，待胶溶液冷却至50℃左右时，加入最终浓度为0.5微克/毫升的EB(也可不把EB加入凝胶中,而是电泳后再用0.5μg/ml的EB溶液浸泡染色15分钟)，摇匀，轻轻倒入电泳制胶板上，除掉气泡；待凝胶冷却凝固后，垂直轻拔梳子；将凝胶放入电泳槽内，加入1x电泳缓冲液，使电泳缓冲液液面刚高出琼脂糖凝胶面；
3．加样：点样板或薄膜上混合DNA样品和上样缓冲液，上样缓冲液的最终稀释倍数应不小于1X。
用10 μL微量移液器分别将样品加入胶板的样品小槽内，每加完一个样品，应更换一个加样头，以防污染，加样时勿碰坏样品孔周围的凝胶面。
（注意：加样前要先记下加样的顺序和点样量）。
4．电泳：加样后的凝胶板立即通电进行电泳，DNA的迁移速度与电压成正比，最高电压不超过
5V/cm。
当琼脂糖浓度低于0.5%，电泳温度不能太高。
样品由负极（黑色）向正极（红色）方向移动。
电压升高，琼脂糖凝胶的有效分离范围降低。
当溴酚蓝移动到距离胶板下沿约1cm处时，停止电泳。
5．观察和拍照：电泳完毕，取出凝胶。
在波长为254nm的紫外灯下观察染色后（2）的或已加有EB的电泳胶板。
DNA存在处显示出肉眼可辨的桔红色荧光条带。
于凝胶成像系统中拍照并保存之。
（二）在含有甲醛的凝胶上进行的RNA电泳（选做）
配制23 mL甲醛电泳胶：0.336g琼脂糖溶于20mL DEPC水中，冷却至60C，加入5mL的5x 甲醛变性胶电泳缓冲液和5.5mL的甲醛，在通风橱内倒胶，冷却30分钟后使用。
甲醛变性胶RNA样品的制备：1μL RNA，5甲醛变性胶电泳缓冲液0.5μL，甲醛0.7μL，甲酰胺2μL，65oC加热15min，迅速冰浴，加1μL上样缓冲液和0.2μL的EB。
步骤：
1．用3%过氧化氢浸泡电泳槽、胶板、梳子30分钟以上。
2．胶板的制备：按常规琼脂糖电泳法。
3．预电泳：1×甲醛变性胶电泳缓冲液，预电泳10 min。
电压为5V/cm。
4．小心地进行点样，记录样品次序与点样量；然后开始电泳，电压为3-4V/cm。
5．观察和拍照：在波长为254nm的紫外灯下观察电泳胶板并拍照保存图片。
【注意事项与提示】
（1）EB是强诱变剂并有中等毒性，易挥发，配制和使用时都应戴手套，并且不要把EB洒到桌面或地面上。
凡是沾污了EB的容器或物品必须经专门处理后才能清洗或丢弃。
简单处理方法为：加入大量的水进行稀释（达到0.5mg/mL以下），然后加入0.2倍体积新鲜配制的5%次磷酸（由50%次磷酸配制而成）和0.12倍体积新鲜配制的0.5mol/L 的亚硝酸钠，混匀，放置1天后，加入过量的1mol/L碳酸氢钠。
如此处理后的EB的诱变活性可降至原来的1/200左右。
（2）由于EB会嵌入到堆积的碱基对之间并拉长线状和带缺口的环状DNA，使DNA迁移率降低。
因此，如果要准确地测定DNA的分子量，应该采用跑完电泳后再用0.5μg/ml的EB溶液浸泡染色的方法。
（3）总RNA的分析：哺乳动物的RNA由28S rRNA、18S rRNA和mRNA以及其它小分子RNA组成，28S和18S rRNA处为明显的亮带（相当于4.5kb和1.9kb），28S/18S应为1.5-2.5/1；植物、昆虫、酵母和两栖动物的RNA带分布较小，约为0.5-3.0kb左右；假如28S/18S小于1/1，或者出现拖带，说明RNA已经有部分降解，如果28S和18S rRNA大部分已降解，则需重新制备。
【实验安排】
只需一天：上午配试剂倒胶，下午跑电泳并观察拍照。
【实验报告要求与思考题】
1、附上电泳结果的图片并进行正确的标注（如下图）
M：1Kb DNA ladder；1：质粒DNA
2、琼脂糖凝胶电泳中DNA分子迁移率受哪些因素的影响？
3、如果样品电泳后很久都没有跑出点样孔，你认为有哪几方面的原因？电泳流程图：。