项目四 单相免疫扩散试验

项目四单相免疫扩散试验

(Single immunodiffusion test)

【实验原理】

单相琼脂扩散试验是一种定量血清学测定方法。将一定量抗体混浇于琼脂凝胶板中，置于凝胶孔中的定量抗原向四周扩散，抗原与相应抗体在凝胶中结合形成白色沉淀环，其大小与抗原浓度成正比。抗原含量可从用标准抗原测定制作的标准曲线上查得。

【试剂和器材】

1．抗人IgG诊断血清(单扩效价1:80)。

2．待检人血清、标准抗原(参考血清，其中人IgG含量为8.04g/L)。

3．琼脂粉、生理盐水、NaN3。

4．玻璃板、吸管、10μl微量加样器、打孔器(绘图笔尖，直径约3mm)、湿盒等。

5．水浴箱、水平台。

【步骤和方法】

1．制备琼脂凝胶用生理盐水配制浓度为30g/L的琼脂，加入NaN3使最终浓度为0.1g/L，沸水浴中溶化至澄清。取5ml加到中试管中，将它移放到50~52℃水浴中，直到温度平衡为止(需15~30min)。

2．制备含抗人IgG抗体的琼脂凝胶板用生理盐水将单扩效价1:80的抗人IgG诊断血清作1:40稀释，取5ml 加到大试管中，置于50~52℃水浴中平衡。将上述平衡后的琼脂加到含抗血清的大试管中，迅速颠倒数次混匀。用刻度吸管吸取，浇注玻璃板(置水平台上，最好加热至45~50℃)，使琼脂凝胶厚度为1.5~2.0mm，置室温冷却凝固(需15~20 min)。

3．打孔用绘图笔尖按图1-4打孔，孔径3mm，孔距10~12mm。要求孔打得圆整、光滑、不要破裂。

标准抗原孔

待检血清孔

图1-4单相免疫扩散试验

4．加样将参考血清用0.5ml蒸馏水溶解，再用生理盐水按下表1-3稀释成不同浓度。将待检血清用生理盐水1:50稀释。按编号顺序将它们分别加入各孔中，每孔加10μl。

表1-3 血清稀释表

稀释倍数12.5 25 50 100 200

IgG含量(mg/L) 643.2 321.6 160.8 80.4 40.2

5．扩散将加好样的琼脂凝胶板平放于湿盒中，置37℃24h观察结果(图1-4)。

【结果判定】

1．精确测量各孔沉淀环直径。

2．绘制标准曲线：以各稀释度参考血清孔的沉淀环直径为横坐标，相应孔中IgG含量为纵坐标，在半对数纸上绘制出标准曲线。以1:12.5~1:200稀释参考血清的沉淀环直径为9、8、7、6、5mm为例制作的标准曲线见图1-5。

3．根据待检血清标本的沉淀环直径，从标准曲线上查出相应的IgG含量，再

乘以血清稀释倍数，即为待检血清中的IgG含量。

【注意事项】

1．由于琼脂厚度和浓度、加样孔的大小对结果有较大影响，条件应予统一。

2．浇板时抗血清与琼脂要充分混匀，抗血清平衡时温度不要过高(通常为50～52℃，不要超过56℃)，时间不能过长(不要超过30min)，否则容易变性失去抗体活性。

3．稀释抗血清、测定标本、参考血清及加样均要准确，且每个样品加2个孔。

4．浇琼脂板及扩散时应保持水平，以免沉淀环变形，影响结果判定。

5．沉淀环测量务必准确，若有误差，当乘以稀释倍数后误差会成倍增长。

6．每次测定均需加参考血清，测定误差应在±10%以内。

7．如实验条件改变应重新制作标准曲线。

【方法评价】

1．方法较稳定，要求设备简单，参考血清及抗血清均易购得，易于掌握和开展工作。

2．观察结果需时间较长，敏感度较低，每次测定需同时作参考血清对照。

4567

891010

20

30

40

60

100200300

400

600

1000

沉淀环直径

(mm)(mg/L)抗

原

浓

度

图1-5 单相免疫扩散标准曲线

【临床意义】

单向琼脂扩散试验为定量测定法，常用于人血清中IgG 、IgM 、IgA 、C3、C4、前白蛋白、白蛋白、α1-抗胰蛋白酶、α2-巨球蛋白、结合珠蛋白、铁传递蛋白、C-反应蛋白等蛋白质含量的定量测定，以帮助临床诊断和分析疾病。

【思考题】

1．简述单相免疫扩散试验定量测定原理及实验操作注意事项。

2．标准曲线在什么情况下应重新制作? 为何每次试验都须同时测定参考血清，意义何在?