项目四 单相免疫扩散试验
单向免疫扩散试验1
会生活。
2．清朝黄遵宪曾作诗曰：“钟声一及时，顷刻不少留。虽
有万钧柁，动如绕指柔。”这是在描写 A．电话 C．电报 B．汽车 D．火车 ( )
轮船招商局 正式成立，标志着中国新式航运业的诞生。
(2)1900年前后，民间兴办的各种轮船航运公司近百家，几乎都是
在列强排挤中艰难求生。
2．航空 (1)起步：1918年，附设在福建马尾造船厂的海军飞机工程处开始 研制 。 (2)发展： 1918年，北洋政府在交通部下设“ 水上飞机
”；此后十年间，航空事业获得较快发展。
筹办航空事宜
处
三、从驿传到邮政 1．邮政
(1)初办邮政： 1896年成立“大清邮政局”，此后又设
邮传部 邮传正式脱离海关。
，
(2)进一步发展：1913年，北洋政府宣布裁撤全部驿站； 1920年，中国首次参加 万国邮联大会 。
2．电讯 (1)开端：1877年，福建巡抚在 办电报的开端。 (2)特点：进程曲折，发展缓慢，直到20世纪30年代情况才发生变 化。 3．交通通讯变化的影响
依据材料概括晚清中国交通方式的特点，并分析其成因。
提示：特点：新旧交通工具并存(或：传统的帆船、独轮车， 近代的小火轮、火车同时使用)。 原因：近代西方列强的侵略加剧了中国的贫困，阻碍社会发 展；西方工业文明的冲击与示范；中国民族工业的兴起与发展；
政府及各阶层人士的提倡与推动。
[串点成面· 握全局]
单向免疫扩散试验1
在琼脂胶中混入一定量抗体，使待测的抗原溶液从局 部向琼脂内自由扩散，在抗原抗体比例合适区域内形 成可见的沉淀环。(抗原抗体反应时，只有其中一种成 分发生扩散） 根据试验形式可分为试管法和平板法两种。
测量沉淀环的直径或计算环的面积。沉淀环直径或面积的 大小与抗原量相关，但不是直线相关，而是对数关系。同 时，这种沉淀环与分子量和扩散时间有关。
1.单向免疫扩散
第二十四章免疫诊断免疫学检测技术已广泛应用于医学和生物学领域的研究。
在临床医学中，免疫学检测可用于免疫相关疾病的诊断、发病机制的研究，病情监测与疗效评价等。
如传染病、免疫缺陷病、自身免疫病、肿瘤、移植排斥反应、超敏反应等。
随着免疫学理论的进展和相关技术的发展，检测技术也不断发展和更新，新方法层出不穷。
本章仅介绍免疫诊断常用技术的原理、基本步骤及其应用。
第一节抗原或抗体的检测一、抗原抗体反应的原理抗原与抗体发生结合反应的物质基础是抗原的抗原决定基与抗体的抗原结合部位之间的结构互补性，二者相互结合，在经典的凝集试验及沉淀试验中，有盐离子存在时，多分子聚合，如分子比例恰当出现肉眼可见反应。
（一）抗原抗体反应的特异性一种抗原一般只能与由它刺激所产生的抗体结合，这种抗原抗体结合反应的专一性即特异性。
抗原抗体结合力的大小，常用亲和力（affinity）或亲合力（avidity）来表示，前者指抗体分子上一个抗原结合部位与相应的抗原决定基之间的结合强度，后者指一个抗体分子与整个抗原之间的结合强度。
抗原与抗体的结合为非共价的可逆结合，它们空间构象的互补程度不同，结合力强弱也不同，互补程度越高，亲和力越高。
此外，反应的条件与抗原抗体的结合力也有关系。
例如适宜的温度、酸碱度、离子强度等能促进抗原抗体分子的紧密接触，增强分子间引力，促进分子间相互结合。
用已知抗原免疫人或动物后，机体会产生特异性抗体存在于血清中，这种抗体在实验中常称为第一抗体（简称一抗）。
由于Ig有同种型抗原特异性，将人Ig免疫动物，或将动物Ig免疫异种动物可制备出抗抗体，又称第二抗体（简称二抗）。
用上述免疫接种方法制备的血清习惯上称为抗血清(antiserum)。
抗血清在免疫学检测中十分常用。
例如，用某种细菌免疫家兔制备的抗血清含有一抗，而将兔血清Ig免疫绵羊可制备出羊抗兔Ig血清，即二抗。
在检测标本中的某种细菌时，可单独使用一抗，因为一抗与该细菌的结合是特异的；也可在使用一抗后再加用二抗，通过二抗与一抗特异性结合，来检测一抗所识别的细菌。
单向、双向免疫琼脂扩散和免疫电泳—单向双向免疫琼脂扩散
注意事项
加样时，吸取每份标本均应更换塑料吸头； 实际检测过程中，标准曲线必须与样品测定同时制备； 孵育时间应控制在24~48h，时间太短可能产生不了沉淀线，时间太长会造成沉
淀线的扩散。
双向免疫琼脂扩散
实验原理
可溶性抗原与相应抗体在琼脂介质中相互扩散，彼此相遇后形成一定类型的特异 性沉淀线。
实验结果
用尺子测量并记录沉淀环直径，然后以沉淀环直径为纵座标，以标准参考蛋白量 （单位/ml）为横座标，绘制成标准曲线。
实验结果
注意事项
制备抗体琼脂板时，琼脂温度必须严格控制，温度太低琼脂会凝固，太高则会影 响抗体的活性；
加样孔内的琼脂应挑干净，切不可损坏孔的边缘，确保每孔的液面基本一致； 加样量一定要精确，并且不能逸出孔外，否则结果不好观察；
实验方法
加样：于中央孔加入牛IgG，周围1-5孔加入倍比稀释不同浓度的标准兔抗牛IgG 血清抗体，6孔加入生理盐水作对照。每孔各加10μl。
将琼脂板平放于湿盒内，置37℃温箱中，分别于24小时观察结果。
实验结果
观察孔间沉淀线的数目及特征。本试验1至5孔与中央孔之间是否可出现清晰的乳 白色沉淀线。
实验原理
沉淀线的特征与位置不仅取决于抗原抗体的特异性及相互间比例，而且与其分子 大小及扩散速度相关。
当抗原抗体存在多个系统时，可呈现多条沉淀线乃至交叉反应。 依据沉淀线的形态、清晰度及位置可以了解抗原或者抗体的性质。
双向琼脂扩散试验的应用
检测未知抗原或抗体 抗原性质分析 抗体效价滴定 抗原或抗体纯度鉴定
周围6个孔放不同稀释度的相应Ab。 以出现沉淀线的血清最高稀释倍数为该抗体的效价。 可进行任意稀释。
抗原抗体纯度鉴定
“1” 为单一抗原抗体系统。 “n” 为多个抗原抗体系统。 *可以用混合抗原鉴定抗体纯度。 *可以用混合抗体鉴定抗原纯度。
医学免疫学实验： 琼脂免疫扩散实验
第二次实验1：琼脂免疫扩散实验一、实验目的了解并掌握单向琼脂免疫扩散法和双向琼脂免疫扩散法。
二、实验原理1.网格学说可溶性抗原与相应抗体以合适的比例发生特异反应时，在一定温度和电解质存在的条件下，经过一定的时间，形成肉眼可见的沉淀物，称为沉淀反应。
沉淀反应的抗原可以是多糖、蛋白质、脂类等。
当抗原过剩或者抗体过剩时，只能形成微小的沉淀物。
2.单向琼脂免疫扩散法的基本原理在含有特异抗体的琼脂板中打孔，并在孔中加定量的抗原，抗原向周围扩散后与琼脂中抗体相结合，即形成白色沉淀环，其直径或面积与抗原浓度呈正相关。
同时，用标准抗原或国际参考蛋白制成标准曲线，可用以定量检测未知标本的抗原浓度（mg / ml 或IU / ml )。
3.双向琼脂免疫扩散法的基本原理双向扩散法是指可溶性抗原与相应抗体在琼脂介质中相互扩散而形成一定类型沉淀线的方法。
沉淀线的特征与位置不仅取决于抗原和抗体的特异性及相互间浓度比例，而且与其分子大小及扩散速度有关。
当抗原抗体存在多种系统时，可呈现多条沉淀线以至交叉反应。
三、实验材料1.单向琼脂免疫扩散法实验材料2％离子琼脂，载玻片，标准马抗人IgG 血清（抗体，工作标准参考蛋白，PBS ( pH 7.2,0.01M)，打孔器（孔径3mm）及打孔模板，微量加样器，湿盒（容器内湿纱布或泡沫塑料），单人份待检血清标本（浓度分别为1/30、1/40和1/50)2.双向琼脂免疫扩散法实验材料1％琼脂（生理盐水配制）管，每管约4ml载玻片；打孔器及打孔模板微量加样器及塑料吸头；抗原：0.5ug/ ml 牛血清白蛋白(BSA )、0.5ug/ ml 人血清白蛋白(HSA )；抗体：兔抗人血清白蛋白、兔抗牛血清白蛋白湿盒。
四、实验步骤（1）单向琼脂免疫扩散1按照玻片的大小，准备制作琼脂板所需要的1％离子琼脂，融化后置于56-60℃水浴锅中待用。
（分装其1/2量的2％盐水琼脂）。
稀释抗体，用pH7.2的PBS 稀释标准抗人IgG 抗体，终浓度为抗体效价的一倍。
单扩实验讲义
实验单向免疫扩散(Single immunodiffusion) 一、大体原理免疫沉淀反映是指可溶性抗原与相应抗体在有电解质存在的情形下，按适当比例所形成的可见沉淀物现象。
据此现象设计的沉淀实验要紧包括絮状沉淀实验，环状沉淀实验和凝胶内的沉淀实验。
凝胶内的沉淀实验依所用的实验方式又可分为免疫扩散实验和免疫电泳技术2类。
单向琼脂扩散扩实验是凝胶内免疫沉淀反映定量实验。
一样是用已知抗体测定未知量的相应抗原。
由于在单位体积内抗原量大，为了不使抗原多余，单向免疫扩散实验常稀释抗原，并以抗原的稀释度作为沉淀反映的效价。
因此一般是把抗体先混合在琼脂中，以不同稀释度的抗原在琼脂中扩散。
将定量抗体与熔化的含缓冲液的琼脂均匀混合，倾注平板，凝固后在琼脂板上打孔，孔中加入待检抗原溶液，放室温或37℃让其自由扩散，24-48h后，可见孔的周围显现沉淀环。
抗原在必然范围内，沉淀环的直径与抗原的量成正相关，因此能够依照沉淀环的大小确信相应抗原（抗体）的量。
单向免疫扩散实验是一种定量实验，要紧用于血清中免疫蛋白（IgG、IgM、IgA）含量的测定。
单向免疫扩散示用意二、材料与器材(一)抗体：标准羊抗人IgG单价抗血清（抗体）（商品有售）。
(二)抗原：①工作标准参考蛋白（IgG，含量10mg/ml）（参考血清）（商品有售），②人全血清（作为待测血清），(三)生理盐水（采纳%的生理盐水），(四)其他用品：打孔器（孔径3mm），微量加样器（10微升），小离心管、载玻片、湿盒、量尺、水浴箱等。
三、实验方式（一）标准曲线的制备：（１）制备含抗体的琼脂凝胶板：A、制胶：用生理盐水配制%琼脂糖凝胶，微波炉中煮沸熔化至澄清后，移置56℃水浴箱中保温备用。
量取56℃的熔化琼脂置小烧杯内，加入氨苄青霉素（200μl/ml），和羊抗人IgG 抗体（1︰60，v/v）充分混合，继续保温于56℃水浴中备用。
另再制备不加抗体与氨苄青霉素的%琼脂凝胶50ml，煮沸熔化至澄清。
常见的免疫检测技术
常见的免疫检测技术(一)皮内试验(intrader rpmal test,ID) 宿主在病原体刺激后，体内产生亲细胞性抗体(IgE和IgG4)。
当其与相应抗原结合后，肥大细胞和嗜碱性粒细胞脱颗粒，释放生物活性物质，引起注射抗原的局部皮肤出现皮丘及红晕，以此便可判断体内是否某有种特异性抗体存在。
(二)免疫扩散(immunodiffusion)和免疫电泳(immunoelectrophoresis)1．免疫扩散于一定条件下，抗原与抗体在琼脂凝胶中相遇，在二者含量比例合适时形成肉眼可见的白色沉淀。
本法有两种类型：①单相免疫扩散：将一定量的抗体混入琼脂凝胶中，使抗原溶液在凝胶中扩散而形成沉淀环，其大小与抗原量成正比；②双相免疫扩散：将抗原与抗体分别置于凝胶板的相对位置，二者可自由扩散并在中间形成沉淀线。
用双相免疫扩散法既可用已知抗原检测未知抗体，也可用已知抗体检测未知抗原。
2．免疫电泳是将免疫扩散与蛋白质凝胶电泳相结合的一项技术。
事先将抗原在凝胶板中电泳，之后在凝胶槽中加入相应抗体，抗原和抗体双相扩散后，在比例合适的位置，产生肉眼可见的弧形沉淀线。
(三)间接红细胞凝集试验(indirect haemagglutination test，IHA) 以红细胞作为可溶性抗原的载体并使之致敏。
致敏的红细胞与特异性抗体结合而产生凝集，抗原与抗体间的特异性反应即由此而显现。
常用的红细胞为绵羊或O型人红细胞。
(四)间接荧光抗体试验(indirect fluorescent antibody method，IFA)vvv 本法用荧光素(异硫氰基荧光素)标记第二抗体，可以进行多种特异性抗原抗体反应，即可检测抗原又可检测抗体。
本法具有较高的敏感性、特异性和重现性等优点，除可用于寄生虫病的快速诊断，流行病学调查和疫情监测外，还可用于组织切片中抗原定位以及在细胞和亚细胞水平观察和鉴定抗原、抗体和免疫复合物。
(五)对流免疫电流试验(counter-immunoelectrophoresis，CIE) 对流免疫电泳试验是以琼脂或琼脂糖凝胶为基质的一种快速，敏感的电泳技术。
单相琼脂扩散试验的临床意义
单相琼脂扩散试验的临床意义
引言：
单相琼脂扩散试验是一种常见的临床检测方法，它可以通过测量琼脂扩散的速度来判断人体内某些物质的浓度，从而为临床诊断提供重要的参考依据。
本文将从理论原理、实验方法和临床应用三个方面来探讨单相琼脂扩散试验的临床意义。
理论原理：
单相琼脂扩散试验是基于弗里德曼定律的原理而设计的。
弗里德曼定律指出，在一定温度下，溶质在溶剂中的扩散速度与其浓度成正比，与扩散距离成反比。
因此，通过测量琼脂扩散的速度，可以推算出溶质的浓度。
实验方法：
单相琼脂扩散试验的实验方法相对简单，只需要将待测物质加入琼脂中，然后观察琼脂扩散的速度即可。
通常情况下，实验会在恒定的温度和湿度下进行，以保证实验结果的准确性。
此外，实验中还需要控制琼脂的厚度和形状，以确保实验结果的可比性。
临床应用：
单相琼脂扩散试验在临床上有着广泛的应用。
例如，在肝功能检测中，可以通过单相琼脂扩散试验来测量血清中胆红素的浓度，从而判断肝
功能是否正常。
此外，在肾功能检测中，单相琼脂扩散试验也可以用
来测量血清中肌酐的浓度，从而判断肾功能是否正常。
此外，单相琼
脂扩散试验还可以用来检测血液中的葡萄糖、脂肪、蛋白质等物质的
浓度，从而为临床诊断提供重要的参考依据。
结论：
单相琼脂扩散试验是一种简单、快速、准确的临床检测方法，它可以
用来测量人体内某些物质的浓度，从而为临床诊断提供重要的参考依据。
在未来，随着科技的不断发展，单相琼脂扩散试验将会有更广泛
的应用，为人类健康事业做出更大的贡献。
单向琼脂扩散实验报告
1. 理解单向琼脂扩散实验的原理和方法。
2. 掌握实验操作技巧，包括制备琼脂板、打孔、加样、观察结果等。
3. 分析实验数据，如扩散速率、扩散系数等。
4. 探究单向琼脂扩散实验在实际应用中的作用和意义。
二、实验原理单向琼脂扩散实验是一种常用的免疫学检测方法，用于定量检测标本中的抗原。
其原理如下：将适量的抗体加入琼脂内制成免疫琼脂板，然后在板上打孔，孔中加入待测抗原。
抗原会向孔的四周扩散，边扩散边与琼脂中的抗体结合。
当抗原与抗体比例适宜时，形成白色沉淀环。
沉淀环的直径与抗原含量成正比。
通过测定沉淀环的直径，可以计算出标本中抗原的含量。
三、实验材料与仪器1. 实验材料：- 羊抗人IgG血清- 标准参考血清（标准IgG质控物）- 待检人血清（IgG-抗原）- pH7.4 0.01M PBS缓冲液（或NS）- 琼脂粉（制备1%免疫盐水琼脂液）- 载玻片、打孔器、37恒温箱、湿盒、可调微量加样器等2. 实验仪器：- 恒温水浴箱- 移液器- 打孔器- 显微镜1. 制备琼脂板：将1%琼脂粉与0.01M PBS缓冲液混合，加热溶解，倒入载玻片上，待凝固后制成琼脂板。
2. 打孔：在琼脂板上按一定距离（1.2~1.5 cm）打孔。
3. 加样：向孔内滴加羊抗人IgG血清、标准参考血清、待检人血清，每孔10 μl。
4. 扩散：将琼脂板放入湿盒中，37℃恒温箱中扩散24小时。
5. 观察结果：观察琼脂板上是否形成白色沉淀环，并测量沉淀环的直径。
五、实验结果与分析1. 实验结果：- 标准参考血清孔中形成明显的白色沉淀环。
- 待检人血清孔中也形成白色沉淀环，但直径较小。
2. 结果分析：- 标准参考血清孔中的白色沉淀环表明琼脂板制备成功，抗体与抗原发生了特异性结合。
- 待检人血清孔中的白色沉淀环表明待检血清中含有与羊抗人IgG血清特异性结合的抗原。
根据沉淀环的直径，可以计算出待检血清中抗原的含量。
通过制作标准曲线，可以进一步确定待检血清中抗原的具体含量。
项目四 单相免疫扩散试验
项目四单相免疫扩散试验(Single immunodiffusion test)【实验原理】单相琼脂扩散试验是一种定量血清学测定方法。
将一定量抗体混浇于琼脂凝胶板中，置于凝胶孔中的定量抗原向四周扩散，抗原与相应抗体在凝胶中结合形成白色沉淀环，其大小与抗原浓度成正比。
抗原含量可从用标准抗原测定制作的标准曲线上查得。
【试剂和器材】1．抗人IgG诊断血清(单扩效价1:80)。
2．待检人血清、标准抗原(参考血清，其中人IgG含量为8.04g/L)。
3．琼脂粉、生理盐水、NaN3。
4．玻璃板、吸管、10μl微量加样器、打孔器(绘图笔尖，直径约3mm)、湿盒等。
5．水浴箱、水平台。
【步骤和方法】1．制备琼脂凝胶用生理盐水配制浓度为30g/L的琼脂，加入NaN3使最终浓度为0.1g/L，沸水浴中溶化至澄清。
取5ml加到中试管中，将它移放到50~52℃水浴中，直到温度平衡为止(需15~30min)。
2．制备含抗人IgG抗体的琼脂凝胶板用生理盐水将单扩效价1:80的抗人IgG诊断血清作1:40稀释，取5ml 加到大试管中，置于50~52℃水浴中平衡。
将上述平衡后的琼脂加到含抗血清的大试管中，迅速颠倒数次混匀。
用刻度吸管吸取，浇注玻璃板(置水平台上，最好加热至45~50℃)，使琼脂凝胶厚度为1.5~2.0mm，置室温冷却凝固(需15~20 min)。
3．打孔用绘图笔尖按图1-4打孔，孔径3mm，孔距10~12mm。
要求孔打得圆整、光滑、不要破裂。
标准抗原孔待检血清孔图1-4单相免疫扩散试验4．加样将参考血清用0.5ml蒸馏水溶解，再用生理盐水按下表1-3稀释成不同浓度。
将待检血清用生理盐水1:50稀释。
按编号顺序将它们分别加入各孔中，每孔加10μl。
表1-3 血清稀释表稀释倍数12.5 25 50 100 200IgG含量(mg/L) 643.2 321.6 160.8 80.4 40.25．扩散将加好样的琼脂凝胶板平放于湿盒中，置37℃24h观察结果(图1-4)。
单向扩散试验平板法
双向扩散试验 （平板法）
应用
3.抗原性质的分析
双向扩散试验 （平板法）
应用
4.抗体效价的滴定
5.抗原或抗体纯度 的鉴定
第四节 免疫电泳技术
immunoelectrophoresis technique
免疫电泳技术
电泳分析 ＋ 沉淀反应
优点： 1.加快反应的速度。 2.提高了灵敏度。 3.增加了分辨率。
单向扩散试验 （平板法）
single diffusion test
定量试验
原理：抗体与待测的抗原, 在两者比例合适的部位 结合形成沉淀环。
环的大小与抗原的浓度成 正相关。
技术要点：将抗体混入0.9%琼 脂糖内（50℃ ），未凝固前倾 注成平板，凝固后打孔（直径 3～5mm ），孔中加入抗原溶 液和不同浓度的标准品，置湿 盒内37℃,24～48h 观察孔周 围是否出现沉淀环。
免疫电泳原理，不同之 处是将抗血清直接加于电泳 后的蛋白质区带表面，抗原 抗体在凝胶中直接发生沉淀 反应，在适当位置形成抗原 抗体复合物 ，经染色后， 可对各类免疫球蛋白及其轻
链进行分型
免疫固定电泳
技术要点
先将患者血清或血浆在醋纤膜 或琼脂上作区带电泳，根据血 清蛋白质的电荷不同将其分开， 然后将IgG、IgA、IgM、κ轻 链和λ轻链的抗血清加于分离 的蛋白质泳道，参考泳道则加 蛋白质固定剂，用于区带对照， 作用一定时间后洗去游离蛋白 质，染色后则可见被固定的相
区带电泳双向扩散1将蛋白质抗原在凝胶中电泳分成肉眼不可见的若干2沿电泳方向挖一与之平行的抗体槽加入相应抗血清进行双向扩散泳23macm051h后槽内加入相应抗血清作双向扩散纯化抗原和抗体成分的分析及正常和异常免疫球蛋白的识别与鉴定影响因素抗原抗体比例不当需测抗原抗体最适比抗血清的的抗体谱混合抗血清的使用电泳条件直接影响分辨率immunofixationelectrophoresisife免疫电泳原理不同之处是将抗血清直接加于电泳后的蛋白质区带表面抗原抗体在凝胶中直接发生沉淀反应在适当位置形成抗原抗体复合物经染色后可对各类免疫球蛋白及其轻链进行分型原理区带电泳沉淀反应先将患者血清或血浆在醋纤膜或琼脂上作区带电泳根据血清蛋白质的电荷不同将其分开然后将iggigaigm轻链和轻链的抗血清加于分离的蛋白质泳道参考泳道则加蛋白质固定剂用于区带对照作用一定时间后洗去游离蛋白质染色后则可见被固定的相应m蛋白成分
免疫扩散技术——IgG测定
扩散
• 将加样完毕的凝胶板放入湿盒 • 37 ℃，扩散24小时
结果判读
• 准确测量S1 -S5沉淀环的直径（单位： mm）
• 以沉淀环直径与相应标准品浓度在 半对数纸上绘制标准曲线。
• 准确测量待测样品的沉淀环的直径， 在标准曲线上查出待测样本中IgG的 浓度。
注意事项
倒板： 1. 严格控制加入诊断血清时的温度：56 ℃
• 但是，该方法灵敏度较低，观察结 果需时间较长，每次测定需同时做 标准曲线。
胶乳凝集试验——RF测定
实验原理
以聚苯乙烯胶乳颗粒为载体的间接凝集试验： 聚苯乙烯颗粒具有很强的吸附蛋白质的能
力，借此将抗原或抗体与胶乳颗粒结合成致 敏颗粒，直接与待测标本中的抗体或抗原发 生凝集反应。
RF为抗变性IgG的抗体，因此 本实验使用的是人IgG致敏的聚 苯乙烯颗粒。
结果判断
• 胶乳颗粒凝集且液体澄清者为阳性， 胶乳颗粒不凝集仍保持均匀胶乳状者为阴性；
• 首先观察阳性血清和阴性血清的反应结果， 若前者为阳性反应后者为阴性反应，说明试 剂有效；
• 然后再观察待测样品的反应情况，并判断阴 阳性。
方法学评价
• 该试验方法简单、快速、特异性强、 结果清晰易观察判断。
• 观察时应注意排除非特异性凝集反 应。
• 如何进行半定量分析？
CIC测定
实验原理： PEG沉淀法
聚乙二醇（PEG），分子量 6000，具有较强的脱水作用，可引 起蛋白质沉淀，沉淀具有选择性且对 蛋白质生物活性无影响。是免疫浊度 测定技术中常用的增浊剂。
• PEG沉淀蛋白质的选择性与其浓度相关： 2%PEG只能沉淀大分子， 4%PEG能沉淀较小分子的循环免疫复合物 大于5%PEG，选择性沉淀特性消失。
抗体检测技术与类风湿因子
detection of rotavirus in feces detection of hepatitis B markers in serum
WESTERN BLOT
步骤： 试剂准备：
3. 底物：
HRP可溶性底物及呈色：
邻苯二胺(OPD)：橙红(492nm)；四甲基联苯胺(TMB)：蓝色(450nm)
5-氨基水杨酸(5-ASA)：棕色(550nm) 鲁咪诺+H2O2：荧光
HRP不可溶性底物及呈色：
DAB：棕黄色 α-萘酚：红色 3-氧基-9-乙基卡唑：红色 4-氯-1-萘 酚：灰蓝色
1、SDS-PAGE试剂:见电泳实验。 2、匀浆缓冲液：1.0M Tris-HCl(pH 6.8)1.Oml；10%SDS 6.0ml；β-巯基乙醇 0.2ml；
ddH2O 2.8ml。 3、转膜缓冲液：甘氨酸 2.9g；Tris 5.8g；SDS 0.37g；甲醇200ml；加ddH2O定容至
方法类型
ELISA既可测抗原又可测抗体，根据试剂来源、标本性状以及检测的 具体条件，可设计出不同类型的检测方法：
1.直接法 2.间接法 3.双抗体夹心法 4.双夹心间接法
直接法： 此法用于未知抗原的检测，将未知待测抗原吸附于固相载体，加入已知酶标针对特定抗原的 抗体。 间接法： 此法用于未知抗体的检测，将已知抗原吸附于固相载体，加入待检标本（含相应抗体）与之 结合，洗涤后，加入酶标抗球蛋白抗体（酶标抗抗体）和底物进行测定。 双抗体夹心法 此法常用于测定抗原，将已知抗体吸附于固相载体，加入待检标本（含相应抗原）与之结合， 洗涤后，加入酶标抗体和底物进行测定。 双夹心间接法 此法常用于测定抗体，将已知抗原（捕获抗体的抗原）吸附于固相载体，加入待检标本（含 相应抗体）与之结合，洗涤后，加入特异性抗抗体，洗涤，再加入抗抗体特异性的酶标抗体 和底物进行测定。
单向扩散的实验报告(3篇)
第1篇一、实验目的1. 了解单向扩散的原理和实验方法。
2. 掌握单向扩散实验的操作步骤。
3. 学会通过单向扩散实验测定抗原浓度。
二、实验原理单向扩散实验是一种用于测定抗原浓度的方法。
其原理是：在一定条件下，抗原在含有相应抗体的琼脂凝胶中向四周扩散，当抗原与抗体相遇比例适宜时，形成抗原抗体复合物，于抗原孔周围出现可见的白色沉淀环。
沉淀环的直径与抗原浓度成正比。
通过测定沉淀环直径大小，可从标准曲线中读出抗原的含量。
三、实验材料1. 羊抗人IgG血清（兔抗人血清，购买）2. 标准参考血清（标准IgG质控物，购买）3. 待检人血清（IgG—抗原）4. pH7.4 0.01M PBS缓冲液（或NS）5. 琼脂粉（制备1%免疫盐水琼脂液）6. 载玻片、打孔器、37℃恒温箱、湿盒、可调微量加样器等7. 实验记录表四、实验方法1. 制备抗体琼脂板：将琼脂粉与PBS缓冲液按比例混合，加热溶解，冷却至50℃左右，加入羊抗人IgG血清，混匀后倒入载玻片，凝固。
2. 打孔：用打孔器在琼脂板上打孔，孔径约为3mm。
3. 加样：在孔中加入标准参考血清和待检人血清，每孔加入量为10μl。
4. 孵育：将载玻片放入37℃恒温箱中，孵育24小时。
5. 观察结果：观察沉淀环直径，记录数据。
6. 绘制标准曲线：以标准参考血清的浓度为横坐标，沉淀环直径为纵坐标，绘制标准曲线。
7. 计算待检人血清中抗原浓度：根据待检人血清沉淀环直径，从标准曲线中读出抗原浓度。
五、实验结果1. 标准曲线绘制成功，线性关系良好。
2. 待检人血清中抗原浓度为10mg/ml。
六、实验讨论1. 实验过程中，琼脂温度控制非常重要，温度过低琼脂会凝固，过高则会影响抗体的活性。
2. 加样孔内的琼脂应挑干净，切不可损坏孔的边缘，确保每孔的液面基本一致。
3. 加样精确，不能逸出孔外，否则结果不好观察。
4. 本实验成功测定了待检人血清中抗原浓度，结果可靠。
七、实验结论单向扩散实验是一种简单、灵敏、特异的测定抗原浓度的方法，在临床医学和免疫学领域具有广泛的应用。
单向、双向免疫琼脂扩散和免疫电泳(Single Immunodiffusion and
单向、双向免疫琼脂扩散和免疫电泳（Single Immunodiffusion and可溶性抗原与相应抗体以合适的比例发生特异反应时，在一定温度和电解质存在的条件下，形成肉眼可见的沉淀物，称为沉淀反应。
沉淀反应的抗原可以是多糖、蛋白质、脂类等。
根据抗原与抗体的不同条件及其它因素，沉淀反应可以分为以下三种主要形式。
即：环状沉淀反应(ring precipitation reaction)，凝胶中沉淀反应(precipitation reaction in gel)，如单向扩散、双向扩散、对流电泳、免疫电泳以及微生物学实验中的絮状沉淀反应(floccu lation precipitation reaction)，如梅毒血清检验中的康氏（Kahn）及克莱氏（Kline）试验以及检测白喉杆菌毒力的体外试验-Elek 氏试验，检测毒素或类毒素的絮状沉淀单位测定等。
本实验主要介绍凝胶中的沉淀反应。
（一）单向免疫扩散(Single immunodiffusion)—人群血清IgG 正常值测定一、基本原理在含有特异抗体的琼脂板中打孔，并在孔中加入定量的抗原，当抗原向周围扩散后与琼脂中抗体相结合，即形成白色沉淀环，其直径或面积与抗原浓度呈正相关。
同时用标准抗原或国际参考蛋白制成标准曲线，即可用以定量检测未知标本的抗原浓度(mg/ml 或U/ml)。
应用这一实验方法可检测正常人群或患者血清中IgG、IgA 及IgM 的水平。
二、实验材料2%离子琼脂或生理盐水琼脂（内含2%NaN3）。
标准马抗人IgG 血清（抗体）（北京生物制品研究所生产）工作标准参考蛋白（北京生物制品研究所生产）pH7.2 PBS.打孔器（孔径3mm）及打孔模板微量加样器湿盒（容器内加湿纱布或泡沫塑料）已制备好的含有1%马抗人IgG 抗体的琼脂板1/50 稀释的单人份待检血清标本三、实验方法（一）标准曲线的制备：1．按照玻片的大小，准备制做琼脂板所需要的1%离子琼脂。
基础免疫学指导书(学生用)
实验一、免疫扩散反应一、实验目的1、了解免疫扩散反应的原理。
2、学习几种免疫扩散实验方法。
二、实验原理可溶性抗原和相应抗体在含有电解质的琼脂凝胶中扩散相遇，特异性地结合，在比例合适处，形成肉眼可见的沉淀物的一种免疫血清学技术。
（一）单向扩散实验一种定量实验，将一定量的抗体混合于琼脂内，倾注于玻片上，凝固后，在琼脂层上打孔，再将抗原加入孔中，使其向四周扩散。
抗原抗体复合物形成的沉淀环直径与抗原的浓度成正比。
如事先用不同浓度的标准抗原制成标准曲线，则未知标本中的抗原含量即可从标准曲线中求出。
本实验主要用于检查标本中各种免疫球蛋白和血清IgG含量。
（二）双向扩散实验抗原抗体在一定pH和离子存在的琼脂糖凝胶中相向扩散，一定时间后，两者相遇而形成不明显的抗原抗体聚合物并继续扩散，当扩散至两者的适当比例时便形成大的抗原抗体复合物而出现明显沉淀，形成垂直于扩散方向的免疫沉淀线即等价线。
三、实验材料及设备1、抗体：羊抗人IgG单价抗血清（双流正龙，效价1:100）2、抗原：人的免疫球蛋白（双流正龙）3、琼脂、生理盐水、0.01mol/LPBS缓冲液载玻片、自制打孔器、移液枪，培养皿4、0.05%氨基黑10B染色液称取0.5g氨基黑10B溶于500mL lmol/L乙酸及500mL 0.1mol/L乙酸钠溶液中。
四、实验内容（一）单向扩散实验——平板法1、制备含抗体的琼脂板取3%生理盐水琼脂，电炉加热使之溶解，然后置56℃水浴中，待琼脂温度降至56℃时，立即加入等体积已稀释一定倍数（40倍稀释）的羊抗人IgG抗体（混合前已在56℃水浴中预热），迅速轻轻混匀，勿使产生气泡，迅速倾入载玻片上，待凝固。
（建议制片时多个载玻片放在一起同时到平板，琼脂板效果较佳）2、稀释人的免疫球蛋白抗原（教师已做好）将人的免疫球蛋白抗原用生理盐水作相应倍数稀释（1:10～1:80），3、打孔、加样用自制打孔器打孔，如下图所示。
（打孔时注意不要将孔打穿）用10u L移液枪加抗原。
微波——免疫单向扩散法快速测定免疫球蛋白
微波——免疫单向扩散法快速测定免疫球蛋白
史恩祥;沈喜
【期刊名称】《医学理论与实践》
【年(卷),期】1998(011)001
【摘要】单向扩散平板法(简称常规法)于1965年由Mancini提出,至目前仍然是最常用、最简易的免疫球蛋白定量技术。
由于常规方法需24—48小时才能回报结果,远不能满足如今高时效的要求。
我们将微波技术与单向扩散法结合起来,确立了一种快速测定免疫球蛋白的方法(简称快速法)。
1 材料 1.1 质控血清制备:取20份体检正常人血清混匀后,3000转/分,离心5分钟,取上清1:4生理盐水稀释,常规法测定20次,取均值。
1.2 琼脂平板及标准曲线制备:实验室可以根据有关资料自制。
【总页数】1页(P46)
【作者】史恩祥;沈喜
【作者单位】河北张家口251医院;河北张家口251医院
【正文语种】中文
【中图分类】R446.62
【相关文献】
1.单向免疫扩散法检测免疫球蛋白标准曲线的制定 [J], 汪培山
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3.琼脂单向扩散法在猪血清免疫球蛋白定量中的应用 [J], 金钊;丘黎明
4.火箭免疫电泳法测定人血清载脂蛋白A-Ⅰ、A-Ⅱ与单向免疫扩散法比较 [J], 王
中权;傅阳恒;郑白蒂;钟学礼
5.透射比浊法与单向琼脂扩散法检测血清免疫球蛋白的比较和分析 [J], 常玉荣;石峻;殷华;夏静;高红霞;张晓峰;阎红
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用扫描仪检测的单向免疫扩散法
用扫描仪检测的单向免疫扩散法
曲路
【期刊名称】《畜牧兽医科技信息》
【年(卷),期】2003(0)1
【摘要】成都生物制品研究所苗松等,对用扫描仪检测的单向免疫扩散法进行了试验。
首先将琼脂凝胶置水浴中加热融化,在56℃～60℃条件下,加入适量羊抗人IgG血清轻轻摇均,倒板,凝固后打孔。
将标
【总页数】2页(P34-35)
【作者】曲路
【作者单位】
【正文语种】中文
【中图分类】S8
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项目四单相免疫扩散试验
(Single immunodiffusion test)
【实验原理】
单相琼脂扩散试验是一种定量血清学测定方法。
将一定量抗体混浇于琼脂凝胶板中，置于凝胶孔中的定量抗原向四周扩散，抗原与相应抗体在凝胶中结合形成白色沉淀环，其大小与抗原浓度成正比。
抗原含量可从用标准抗原测定制作的标准曲线上查得。
【试剂和器材】
1．抗人IgG诊断血清(单扩效价1:80)。
2．待检人血清、标准抗原(参考血清，其中人IgG含量为8.04g/L)。
3．琼脂粉、生理盐水、NaN3。
4．玻璃板、吸管、10μl微量加样器、打孔器(绘图笔尖，直径约3mm)、湿盒等。
5．水浴箱、水平台。
【步骤和方法】
1．制备琼脂凝胶用生理盐水配制浓度为30g/L的琼脂，加入NaN3使最终浓度为0.1g/L，沸水浴中溶化至澄清。
取5ml加到中试管中，将它移放到50~52℃水浴中，直到温度平衡为止(需15~30min)。
2．制备含抗人IgG抗体的琼脂凝胶板用生理盐水将单扩效价1:80的抗人IgG诊断血清作1:40稀释，取5ml 加到大试管中，置于50~52℃水浴中平衡。
将上述平衡后的琼脂加到含抗血清的大试管中，迅速颠倒数次混匀。
用刻度吸管吸取，浇注玻璃板(置水平台上，最好加热至45~50℃)，使琼脂凝胶厚度为1.5~2.0mm，置室温冷却凝固(需15~20 min)。
3．打孔用绘图笔尖按图1-4打孔，孔径3mm，孔距10~12mm。
要求孔打得圆整、光滑、不要破裂。
标准抗原孔
待检血清孔
图1-4单相免疫扩散试验
4．加样将参考血清用0.5ml蒸馏水溶解，再用生理盐水按下表1-3稀释成不同浓度。
将待检血清用生理盐水1:50稀释。
按编号顺序将它们分别加入各孔中，每孔加10μl。
表1-3 血清稀释表
稀释倍数12.5 25 50 100 200
IgG含量(mg/L) 643.2 321.6 160.8 80.4 40.2
5．扩散将加好样的琼脂凝胶板平放于湿盒中，置37℃24h观察结果(图1-4)。
【结果判定】
1．精确测量各孔沉淀环直径。
2．绘制标准曲线：以各稀释度参考血清孔的沉淀环直径为横坐标，相应孔中IgG含量为纵坐标，在半对数纸上绘制出标准曲线。
以1:12.5~1:200稀释参考血清的沉淀环直径为9、8、7、6、5mm为例制作的标准曲线见图1-5。
3．根据待检血清标本的沉淀环直径，从标准曲线上查出相应的IgG含量，再
乘以血清稀释倍数，即为待检血清中的IgG含量。
【注意事项】
1．由于琼脂厚度和浓度、加样孔的大小对结果有较大影响，条件应予统一。
2．浇板时抗血清与琼脂要充分混匀，抗血清平衡时温度不要过高(通常为50～52℃，不要超过56℃)，时间不能过长(不要超过30min)，否则容易变性失去抗体活性。
3．稀释抗血清、测定标本、参考血清及加样均要准确，且每个样品加2个孔。
4．浇琼脂板及扩散时应保持水平，以免沉淀环变形，影响结果判定。
5．沉淀环测量务必准确，若有误差，当乘以稀释倍数后误差会成倍增长。
6．每次测定均需加参考血清，测定误差应在±10%以内。
7．如实验条件改变应重新制作标准曲线。
【方法评价】
1．方法较稳定，要求设备简单，参考血清及抗血清均易购得，易于掌握和开展工作。
2．观察结果需时间较长，敏感度较低，每次测定需同时作参考血清对照。
4567
891010
20
30
40
60
100200300
400
600
1000
沉淀环直径
(mm)(mg/L)抗
原
浓
度
图1-5 单相免疫扩散标准曲线
【临床意义】
单向琼脂扩散试验为定量测定法，常用于人血清中IgG 、IgM 、IgA 、C3、C4、前白蛋白、白蛋白、α1-抗胰蛋白酶、α2-巨球蛋白、结合珠蛋白、铁传递蛋白、C-反应蛋白等蛋白质含量的定量测定，以帮助临床诊断和分析疾病。
【思考题】
1．简述单相免疫扩散试验定量测定原理及实验操作注意事项。
2．标准曲线在什么情况下应重新制作? 为何每次试验都须同时测定参考血清，意义何在?。