柱前衍生化HPLC分析白花蛇舌草多糖中单糖组成

合集下载

柱前衍生化-高效液相色谱法分析木糖结晶母液的单糖组成

柱前衍生化-高效液相色谱法分析木糖结晶母液的单糖组成孟海波;高绍丰;张海燕;孟汉卿【摘要】The reversed - phase high performance liquid chromatographic ( HPLC) method of pre-column - derivatization with l-phenyl-3-methyl-5-pyrazolone (PMP) was developed to separate the traditional eight monosaccharides and detect the monosac-charide composition of crystallization solution of xylose. The results showed that crystallization solution of xylose consisted of mannose, rharanose, cellobiose, glucose, galactose, xylose, arabinose, fucose, and the dominant component monosaccharides were glucose, ga-lactose, xylose and arabinose. Peak height was used to quantify. The concentration of eight kinds of monosaccharide was liner with correspond peak area with correlation coefficients (r2) of 0.9897 -0.9994. The detection limit was 0.002 1 -0.003 1 mg/mL. The recovery was 98.4% - 101.0% , and relative standard deviation of detection results was 0.66% -0.21 % (n = 6). The HPLC method is simple, rapid, sensitive, convenient and can be applied to the quality control of crytallization solution of xylose.%采用1-苯基-甲基-吡唑啉酮(PMP)柱前衍生化-反相高效液相色谱(HPLC)法建立了8种常见单糖的分离模式,并用于木糖结晶母液单糖组成的定量分析.结果表明:木糖结晶母液至少由甘露糖、鼠李糖、纤维二糖、葡萄糖、半乳糖、木糖、阿拉伯糖及岩藻糖8种单糖组成,其中以葡萄糖、半乳糖、木糖和阿拉伯糖为主.以峰高定量,8种单糖的浓度与相应的峰高呈良好的线性关系,相关系数r2在0.9897 -0.9994范围内,方法检出限为0.0021-0.0031 mg/mL,回收率为98.4% -101.0%,测定结果的相对标准偏差为0.66%-1.21%(n=6).该方法简单、快速、灵敏,可用于木糖结晶母液的质量控制.【期刊名称】《化学分析计量》【年(卷),期】2011(020)005【总页数】3页(P47-49)【关键词】木糖结晶母液;单糖组成;衍生化;高效液相色谱【作者】孟海波;高绍丰;张海燕;孟汉卿【作者单位】济南圣泉唐和唐生物科技有限公司,济南,250204;济南圣泉唐和唐生物科技有限公司,济南,250204;济南圣泉唐和唐生物科技有限公司,济南,250204;济南圣泉唐和唐生物科技有限公司,济南,250204【正文语种】中文木糖、阿拉伯糖作为一种良好的食品添加剂已被广泛应用于食品生产中。

柱前衍生化高效液相色谱法分析当归多糖的单糖组成

图 3 当归多糖经 TFA 水解的时间对各组成单糖的测定影响
F ig. 3 The e ffects of com ponent m onosacchar ides o f A ngelica polysaccha rides fo r different trifluoacetic ac id ( T FA ) hydro lysis tim e 1. 葡萄糖醛酸 ( glu cu ron ic acid) ; 2. 甘露糖 ( m annose) ; 3. 鼠李糖 ( rhamn ose); 4. 半乳糖醛酸 ( ga laduron ic acid ) ; 5. 半乳糖 ( galactose); 6. 葡萄糖 ( g lucose) ; 7. 阿拉伯糖 ( arabonose) 。
3 结果与讨论
3. 1 单糖对照品 PM P衍生物的 HPLC 分离为实现当归多糖各组成单糖的高效分离, 本实验对当归多糖可能包含的 G lc、A ra、M an、G al、Rha、
Xyl、G lcUA、GalUA 及内标 Fuc等 9种标准单糖 PMP 衍生物的高效液相色谱分离条件进行了优化。结果表明, 磷酸缓冲液 ( KH2 PO4-N aOH ) 的 pH 6. 9, 时间梯度为 0→ 10→ 30 m in 和相应浓度梯度为 0→ 8% → 20% 溶剂 B的梯度洗脱模式是分离此 9种单糖衍生物的较理想色谱分离条件。
1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮 ( PM P) 柱前衍生化 H PLC 测定单糖含量的方法经过了不断地发展和完善 [ 3~ 7] , 并成功地用于毛细管电泳分析。 PMP 是还原性糖的最好衍生化试剂之一, 如 PM P 衍生物不易裂解, 分析时不产生异构峰, 且在 250 nm 处有强烈的紫外吸收。本研究采用 PMP 衍生化方法, 用常规的紫外检测器和 C18烷基键合柱, 建立适于当归多糖单糖组成测定的 HPLC 新方法, 达到灵敏、快速、准确、方便和可在线大批量分析的目标。

植物多糖研究现状

植物多糖是普遍存在于自然植物界中的由许多相同或不同的单糖以α-或β-糖苷键所组成的化合物，由1O个以上的单糖分子通过聚合而成，其分子量较大，是一类大分子化合物。

多糖还是一类重要的信息分子，结合了蛋白质和脂类的多糖，在有机体中参与多种生命活动。

人们对多糖生物活性的研究可追溯到1936年Shear对多糖抗肿瘤作用的发现。

以后陆续发现一些真菌多糖和高等植物多糖具有明显的抑菌抗肿瘤等活性。

至今已有300多种多糖从自然界中得到分离与鉴定J。

研究发现多糖及糖复合物参与和介导了细胞各种生命现象的调节，具有抗肿瘤、免疫调节、降血糖、抗病毒、降血脂、抗凝血等生物活性 J。

因其来源广泛，没有毒副作用，而且药物质量通过化学手段容易控制等优点，成为当今新药及功能保健品和绿色食品添加剂发展的新方向。

本文主要对植物多糖的提取分离技术、分析检测方法及生物学活性等研究发展进行综述。

1.植物多糖的提取分离在植物多糖的研究中，如何建立最佳的提取工艺是多糖研究的基础．目前植物多糖提取方法甚多，每种方法都各有利弊，选择合适的植物多糖提取方法可满足不同的需要J，常用方法主要有水提取法、酸提法、碱提法、酶解法、超声法、微波法等。

近些年多采用混合或辅助手段提高提取效率，降低溶剂用量。

J1.1 水提醇沉法水提醇沉法是提取多糖最常用的方法。

多糖是极性大分子化合物，根据相似相容原理，应使用水、醇等极性较强的溶剂，利用多糖溶于水而不溶于醇的性质，可以采用热水浸煮或冷水浸提渗滤提取多糖，用乙醇将多糖从提取液中沉淀出来，即为水提醇沉法。

一般来说，醇含量在50％一60％可以去除淀粉，在75％时可除去蛋白质，在80％时基本可以除去全部蛋白质、多糖和无机盐。

影响水提醇沉法提取率的因素有：水的用量、提取温度、料液比、提取时间及提取次数。

传统采用正交试验法确定上述几个因素的最佳比例，如孙莹等J用水提醇沉法对大黄多糖的工艺优化进行研究，发现在料液比1：10，提取温度95oC 二，提取1h的情况下，大黄多糖得到最佳浓度为80％，得到影响提取率的主次因素依次为料液比、提取温度和提取时间。

柱前衍生化高效液相色谱法分析9种多糖中的单糖组成

柱前衍生化高效液相色谱法分析9种多糖中的单糖组成王媛媛;张晖;杨俊松;宗智慧【摘要】Objective To establish a precolumnderivatization procedure with 1-phenyl-3-methyl-5-pyrazolone ( PMP )-high performance liquid chromatography ( HPLC ) method for the determination of the monosaccharide composition of nine polysaccharides.Methods The nine polysaccharides were hydrolyzed, derivatized by PMP and analyzed by HPLC with the Inertsil ODS-SP C18 column(260mm ×4.6mm,5μm).The mobile phase was the 20%triethylamine-buffer solution withKH2PO4(pH=6.9),and the flow rate was 1.0 ml/min.The UV absorbance was detected at a wavelength of 254 nm,and the injection volume was 10μl with the column temperature 30℃.Results The method was successful in the separation of the mixture monosac-charide standards.The calibration line of each monosaccharide had a good relationship.And the precision, stability and reproducibility were also good.The nine polysaccharides were composed of different monosac-charide and the contents had some difference.Conclusion The method was accurate and stable for the deter-mination of the monosaccharide composition and content of nine polysaccharides.%目的：建立1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮（ PMP）柱前衍生化-高效液相色谱法（ HPLC）对甘草多糖等9种多糖的单糖组成成分进行分析。

白花蛇舌草多糖的分离纯化及PMP柱前衍生高效液相分析

［摘
要］经热水提取、醇沉、大孑树脂分离、三氯乙酸脱蛋白、Ｈ０脱色、透析、ＤＡＬ：：ＥＥ一２纤维素和５
ＳｐａｅＧ一０ｅｈｄｘ２０凝胶柱层析，建立了白花蛇舌草多糖的分离纯化方法。制备的Ｏ经紫外扫描及ＨＧＣ测试，ＤＩＰＰ
主要仪器ＤＯＥ６０高效液相色谱仪（ＩＮＸＰ８美国戴安公司），Ｕ一２０Ｖ１０紫外可见分光光度计（尼柯（海）仪器有限公司）Ｓ —ＧＬ尤上，ＴＫＥＧ５０Ｗ多糖专用凝胶柱（日本ＴＳＨ公司）２０ＰＯＯ，Ｗａｅｓｔｎｉｄ１ｔｌｔＣ８柱（国沃特世公司）ＥＥｒＡａｓ美，ＤＡ
柱前衍生高效液相色谱法分析了白花蛇舌草所含一种纯多糖的单糖组成。
１仪器与试剂
至１０Ｌ０ｍ，石油醚萃取至醚层无色。挥干有机试剂后加入等体积２％三氯乙酸（Ｃ０ＴＡ）溶液，静置
４，离心，上清液以氨水调ｐ值至８ｈＨ，滴加３％０
糖、Ｄ一阿拉伯糖（国药集团化学试剂有限公司），Ｄ一葡萄糖、Ｄ一木糖（ｉｍＳｇａ公司），三氟乙酸
（Ｆ）（ＴＡ上海医药集团），１一苯基一３甲基一５一
吡唑啉酮（ＭＰ（京化学试剂厂）乙腈为色Ｐ）北。
取白花蛇舌草１Ｏ０，分别加入１０ｇ０倍水提取

柱前衍生化高效液相色谱法测定当归酸性多糖单糖组成的新方法

柱前衍生化高效液相色谱法测定当归酸性多糖单糖组成的新方法李卫燕;李萍;曹蔚【摘要】首次建立柱前衍生化高效液相色谱法分析当归酸性多糖中糖醛酸、氨基糖和中性糖的方法.D-甘露糖、D-葡萄糖胺、L-鼠李糖、D-半乳糖胺、D-葡萄糖醛酸、D-半乳糖醛酸、D-葡萄糖、D-半乳糖、L-阿拉伯糖和D-岩藻糖等10种单糖经柱前衍生化法处理后作为标准品.色谱条件:Hypersil BDS C18色谱柱(4.6 mm i.d.×250 mm,5μm),流动相由乙酸铵水溶液(100 nmol/L,pH =5.0)、乙腈和四氢呋喃以81:17:2的体积比组成,流动相流速1.0 mL/min,检测波长250 nm,柱温25℃.实验结果表明,当归酸性总多糖是由D-甘露糖、D-葡萄糖胺、L-鼠李糖、D-半乳糖胺、D-葡萄糖醛酸、D-半乳糖醛酸和D-葡萄糖以1.5:14.1:1.7:1.6:2.0:2.3:1.0的摩尔比例组成.【期刊名称】《科学技术与工程》【年(卷),期】2015(015)010【总页数】4页(P151-154)【关键词】当归;多糖;高效液相色谱;柱前衍生化;单糖【作者】李卫燕;李萍;曹蔚【作者单位】第四军医大学药学系天然药物学教研室,西安710032;第四军医大学药学系天然药物学教研室,西安710032;第四军医大学药学系天然药物学教研室,西安710032【正文语种】中文【中图分类】R284.2中药当归是伞形科植物当归Angelicasinensis(Oliv.) Diels的干燥根，主产于甘肃岷县，为常用中药，具有补血活血、调经止痛、润肠通便的功效。

近十几年来，经过国内外学者的研究，发现多糖是当归的主要成分之一[1]。

药理学研究表明，当归多糖具有抗血栓及改善血液流变、保护心血管系统、抑菌、抗肿瘤、保护肺部组织细胞、利胆保肝、补血等生物活性[2]。

多糖的单糖组成分析是控制多糖质量和分析多糖结构的重要环节。

白花蛇舌草化学成分

白花蛇舌草化学成分
白花蛇舌草（学名：Hedyotis diffusa）是一种常见的中草药，被广泛应用于中医药领域。

它的主要化学成分包括：
蒽醌类化合物：白花蛇舌草中含有多种蒽醌类化合物，如赤芍酮、赤芍酮酸、丹参酮等。

这些成分具有抗氧化、抗炎、抗肿瘤等多种药理活性。

黄酮类化合物：包括芍药苷、芦丁、异黄酮等。

黄酮类化合物具有抗氧化、抗炎、抗肿瘤、抗血栓等活性，对心血管健康和免疫调节具有重要作用。

多糖类化合物：白花蛇舌草中富含多种多糖类化合物，如阿拉伯糖、甘露糖、葡萄糖等。

这些多糖类化合物具有抗氧化、免疫调节和抗肿瘤等功效。

挥发油：白花蛇舌草中含有一些挥发油成分，如柠檬烯、萜烯等。

这些挥发油成分具有抗菌、抗炎和镇静作用。

此外，白花蛇舌草还含有其他成分，如氨基酸、生物碱、酚酸类化合物等，这些成分对其药理活性和药效发挥起重要作用。

需要注意的是，草药中的化学成分复杂多样，不同产地和生长环境下的白花蛇舌草成分可能会有所差异。

因此，在使用白花蛇舌草或其提取物时，应遵循医生或草药专家的指导，避免不当使用或滥用。

柱前衍生高效液相色谱法分析纸张中的单糖

７０ｏＣ．Ｔｈｅｍｅｔｈｏｄｗａｓｓｉｍｐｌｅ，ｓｅｎｓｉｉｔｖｉｔｙａｎｄａｃｃｕｒａｃｙ，ａｎｄｐｏｖｒｉｄｅｄａｐｒａｃｔｉｃａｌｍｅｔｈｏｄｆｏｒｔｅｓｔｉｎｇｍｏｎｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓｉｎ
第４３卷第１７期
２０１５年９月
广
州
化
工
Ｖｏ１．４３Ｎｏ．１７
Ｓｅｐ．２０１５
ＧｕａｎｇｚｈｏｕＣｈｅｍｉｃａｌＩｎｄｕｓｔｒｙ
柱前衍生高效液相色谱法分析纸张中的单糖木
ｅｔｈｙｈｃａｒｂａｚｏｌｅ，ｓｅｐａｒａｔｅｄｂｙｒｅｖｅｒｓｅＴｈｅｒｍｏＣ１８ｃｏｌｕｍｎ，ｕｓｉｎｇａｃｅｔｏｎｉｔｒｉｌｅａｎｄａｍｍｏｎｉｕｍａｃｅｔａｔｅａｑｕｅｏｕｓｓｏｌｕｔｉｏｎａｓ
Ａｂｓｔｒａｃｔ：ＡｎｅｗｍｅｔｈｏｄｏｆａｎａｌｙｓｉｓｏｆｍｏｎｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓｉｎｐａｐｅｒｗａｓｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄｂｙＨＰＬＣｗｉｔｈｐｒｅ—ｃｏｌｕｍｎｄｅｒｉｖａｔｉｚａｔｉｏｎｕｓｉｎｇ３— －ａｍｉｎｏ— －９— －ｅｔｈｙｌｃａｒｂａｚｏｌｅ．Ｍｏｎｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓｉｎｐａｐｅｒｗｅｒｅｄｅｒｉｖａ Байду номын сангаас ｉｚｅｄｕｓｉｎｇ３— — ａｍｉｎｏ— －９— －

PMP柱前衍生化-HPLC法分析不同生长年限黄芪中6种单糖的含量

PMP柱前衍生化-HPLC法分析不同生长年限黄芪中6种单糖的含量作者：余亦婷皮文霞谢辉曹丽娟李西文李霞陆兔林严国俊来源：《中国药房》2021年第12期摘要目的：分析并比较不同生长年限黄芪中6种单糖的含量。

方法：取来自3个产地的2～4年生黄芪药材，经水提醇沉、Sevage除蛋白后制得黄芪多糖;将上述多糖经三氟乙酸水解和1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮衍生化后，采用高效液相色谱法测定其中甘露糖、鼠李糖、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖等6种单糖的含量。

以Symmetry C18为色谱柱，以磷酸盐缓冲液（pH 6.8）-乙腈（84 ∶ 16，V/V）为流动相，流速为1.0 mL/min，检测波长为245nm，柱温为35 ℃，进样量为20 µL。

结果：黄芪多糖中甘露糖、鼠李糖、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖的含量分别为0.50～0.94、0.76～1.60、3.35～7.86、87.33～275.77、1.95～8.96、2.35～14.04 mg/g，2、3、4年生黄芪中上述单糖的总含量分别为98.26～139.92、173.81～295.71、122.37～182.41 mg/g。

3年生黄芪中葡萄糖的含量与2、4年生黄芪有显著差异（162.71～275.77 mg/g vs. 87.33～107.70、111.54～167.26 mg/g，P关键词黄芪;多糖;单糖;柱前衍生化;高效液相色谱法ABSTRACT OBJECTIVE： To analyze and compare the contents of 6 kinds of monosaccharide in Astragalus membranaceus from different growth years. METHODS： 2-4 years old A. membranaceus from three areas were extracted with water extraction and alcohol precipitation，Sevage deproteinization to obtain A. membranaceus polysaccharide. The samples were firstly hydrolyzed with trifluoroacetic acid （TFA） and then derivatized by 1-phenyl-3-methyl-5-pyrazolone（PMP）. HPLC analysis was adopted to determine the contents of 6 kinds of monosaccharide as mannose， rhamnose， galacturonic acid， glucose， galactose， arabinose. The determination was performed on Symmetry C18 column with phosphate buffer solution （pH 6.8）-acetonitrile （84 ∶ 16， V/V） as mobile phase at the flow rate of 1.0 mL/min. The detection wavelength was 245 nm， and column temperature was 35 ℃. The sample size was 20 µL. RESULTS： The contents of mannose， rhamnose， galacturonic acid， glucose， galactose and arabinose were 0.50-0.94， 0.76-1.60， 3.35-7.86， 87.33-275.77， 1.95-8.96， 2.35-14.04 mg/g，respectively. Total contents of monosaccharide from 2， 3， 4 years old A. membranaceus were 98.26-139.92， 173.81-295.71， 122.37-182.41 mg/g， respectively. There was significant difference in the contents of glucose between 3 old years A. membranaceus and 2， 4 old years A. membranaceus （162.71-275.77 mg/g vs. 87.33-107.70， 111.54-167.26 mg/g， PKEYWORDS Astragalus membranaceus;Polysaccharides;Monosaccharides;Pre-column derivatization;HPLC黃芪为豆科植物蒙古黄芪Astragalus membranaceus（Fisch.）Bge. var. mongholicus（Bge.）Hsiao或膜荚黄芪Astragalus membranaceus（Fisch.）Bge.的干燥根[1]，主产于我国山西、内蒙古等地[2]。

201011298银耳多糖单糖组成分析的三种色谱方法比较

银耳多糖单糖组成分析的三种色谱方法比较韩威1，姜瑞芝2，陈英红2，高阳3，高其品3*（1．延边大学，吉林延吉133002；2．吉林省中医药科学院，吉林长春130012；3．长春中医药大学，吉林长春130117）摘要：为选择一种准确快捷的方法测定银耳多糖的单糖组成，对薄层色谱法（TLC）、气相色谱法（GC）、高效液相色谱法（HPLC）三种色谱方法进行比较。

结果表明，前两种方法的测定结果均不理想，而HPLC法，操作简便，灵敏度高，分离效果好，信息完整。

测定结果为由葡萄糖、甘露糖、葡萄糖醛酸、木糖、岩藻糖组成，其摩尔比为0.24：1.00：0.06：0.29：0.25。

HPLC法对酸性杂多糖组成糖分析是一种比较理想的选择。

关键词：银耳多糖；单糖组成；TCL；GC；HPLCComparison of three kinds of chromatographic methods for monosaccharide composition analysis of Tremella polysaccharideHan Wei1, Jiang Rui-zhi2, Chen Ying-hong2, Gao Yang3, G ao Qi-pin3*(1. Yanbian University, Yanji 133002, China; 2. Academy of Traditional Chinese Medicine and Material Medical of Jilin Province, Changchun 130012, China; 3. Changchun University of Chinese Medicine, Changchun 130117, China)Abstract：To find an accurate and fast method to determine the monosaccharide composition of Tremella polysaccharide, thin layer chromatography (TLC), gas chromatography (GC) and high performance liquid chromatography (HPLC) was compared. The results of TLC and GC were not significant. However, HPLC was a simple method, showed high sensitivity, good resolution and integrity information. The result of HPLC analysis showed that the monosaccharide composition were Glc, Man, GlcA, Xyl and Fuc, with the mole percentage of 0.24:1.00:0.06:0.29:0.25. Consequently, HPLC is the most suitable method for monosaccharide composition analysis.Key words：Tremella polysaccharide; monosaccharide composition; TLC; GC; HPLC 银耳（Tremella fuciformis Berk）是真菌类银耳科银耳属植物，也叫白木耳，基金项目：十一五国家科技重大专项（No. 2009ZX09103-333）；国家自然科学基金（No. 30873370）*通讯作者Tel：（0431）86172070；E-Mail：gaoqipin@在我国有悠久的药食兼用历史，具有增强人体免疫力的作用。

柱前衍生化高效液相色谱法测定普瑞巴林中的光学异构体-概述说明以及解释

柱前衍生化高效液相色谱法测定普瑞巴林中的光学异构体-概述说明以及解释1.引言1.1 概述本文旨在探讨柱前衍生化高效液相色谱法在普瑞巴林中光学异构体的测定中的应用。

普瑞巴林是一种常用的药物成分，广泛用于疼痛和炎症等疾病的治疗。

然而，普瑞巴林存在光学异构体的问题，这意味着药物中可能存在两种或多种形式的分子结构。

由于光学异构体的生物活性和药效可能存在差异，因此准确快速地测定普瑞巴林中的光学异构体是非常重要的。

传统的光学异构体的分离方法如手性高效液相色谱法（Chiral-HPLC）对于普瑞巴林的测定具有一定的局限性，如分离时间长、操作复杂等。

因此，本文引入基于柱前衍生化的高效液相色谱法，在普瑞巴林的光学异构体分析中具有很大的潜力。

柱前衍生化是一种将分析物与特定试剂在分离柱之前进行反应，形成稳定的荧光衍生物的方法。

该方法能够提高色谱分离的选择性和灵敏度，并且具有操作简单、分析速度快的优点。

本文将详细介绍柱前衍生化高效液相色谱法的原理和操作步骤。

通过对普瑞巴林样品的预处理和柱前衍生化反应，成功实现了对普瑞巴林中光学异构体的分离和测定。

同时，本文还将对柱前衍生化高效液相色谱法在普瑞巴林中的应用前景进行探讨，总结其在药物分析领域的重要性和潜在的发展方向。

通过本文的研究，我们希望能够为普瑞巴林的质量控制提供一种新的分析方法，并为相关药物的研究和开发提供有力的支持。

同时，本文的研究结果也有望为其他药物中光学异构体的测定提供借鉴和参考。

最终，我们希望通过本文的发表，能够为相关领域的研究者提供有益的信息和启发，推动科学研究的进一步发展。

1.2 文章结构本文分为三个主要部分：引言、正文和结论。

在引言部分，将会对本文的主题进行概述，介绍普瑞巴林及其在医药领域的应用，以及目前存在的问题和挑战。

接下来，将详细阐述本文的研究目的，即通过柱前衍生化高效液相色谱法测定普瑞巴林中的光学异构体。

正文部分将分为两个主要部分。

首先，将介绍柱前衍生化高效液相色谱法的基本原理、操作步骤和优势。

糖类物质的衍生化分离分析方法研究

ofthese two methods，therefore，to help researchers to choose appropriate separation mode
The use of PMP method in reducing disaccharides gave good results．The present method，
which combined PMP derivatization—HPLC with ESI—MS，could be used as a research
method to study the structural units—specific monosaccharides of polysaccharides．
品常规分析的要求。结合建立的衍生化方法与高效液相色谱HPLC，优化分离条件，
并选择紫外(UV)和电喷雾一离子阱质谱(ESI—MS)两种检测模式对实际样品中所
含的单糖进行分离分析，建立了5种单糖的常规定性定量方法。也采用毛细管胶束电
动力学色谱(MEKC)分离单糖衍生物，与HPLC分离的结果加以比较，说明了MEKC
简单寡糖，再通过对降解产物的定性、定量测定，来确定其结构[12,13]。水解是比较常是色谱技术用来确定多糖、寡糖
中各种单糖组分构成的前提。使用无机、有机酸在适当的条件下能使多糖、寡糖达到
完全水解，定量转变成相应的单糖。酸水解可以使用盐酸、硫酸或者醋酸、三氟乙酸
II
堡主丝塞塑耋塑堕竺塑皇些坌查坌堑查鎏竺窒——
Further，the PMP method was also well-suited for micellar electrokinetic chromatograph3,

PMP柱前衍生化HPLC法测定地参多糖的单糖组成

PMP柱前衍生化HPLC法测定地参多糖的单糖组成一、本文概述Overview of this article本文旨在介绍一种采用PMP（1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮）柱前衍生化结合高效液相色谱法（HPLC）测定地参多糖中单糖组成的方法。

地参作为一种具有丰富营养价值和药用价值的植物，其多糖成分具有显著的生物活性，如抗氧化、抗炎、抗肿瘤等作用。

因此，对地参多糖中单糖组成的准确分析对于揭示其生物活性机制、优化提取工艺以及质量控制具有重要意义。

This article aims to introduce a method for determining the monosaccharide composition in ginseng polysaccharides using PMP (1-phenyl-3-methyl-5-pyrazolone) pre column derivatization combined with high-performance liquid chromatography (HPLC). As a plant with rich nutritional and medicinal value, the polysaccharide components of ground ginseng have significant biological activities, such as antioxidant, anti-inflammatory, and anti-tumor effects. Therefore, accurate analysis of monosaccharide composition inginseng polysaccharides is of great significance for revealing their biological activity mechanisms, optimizing extraction processes, and quality control.PMP柱前衍生化是一种常用的单糖衍生化方法，通过与单糖上的羟基反应，将单糖转化为具有紫外吸收特性的衍生物，从而便于HPLC 检测。

基于氨基苯甲酸衍生化HPLC-FLD分析中药多糖单糖组成

１仪器与试药
多糖的单糖组成测定是控制多糖质量标准和提供多糖基本信息的最重要环节］。由于单糖的紫外吸
收很弱，故单糖的衍生化是获得高灵敏度紫外检测的
Ｗａｔｅｒｓ２６９５—２９９６型高效液相色谱仪（Ｗａｔｅｒｓ
缓冲液（ｐＨ２．５４），含２０ｍｍｏｌ／Ｌ四丁基硫酸氢铵；流动相Ｂ为流动相Ａ和甲醇按１：１的体积比混合所得；梯度洗脱，０～１２ｍｉｎ，２％一５％Ｂ；１２～５０ｍｉｎ，５％～８％Ｂ；５０～５５ｍｉｎ，８％～２０％Ｂ，激发波长：３１３
２０１６年１２月第４４卷第６期
Ｖｏ１．４４，Ｎｏ．６，Ｄｅｃ．２０１６
中
医
药
学
报
ＡｃｔａＣｈｉｎｅｓｅＭｅｄｉｃｉｎｅａｎｄＰｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ
基于氨基苯甲酸衍生化ＨＰＬＣ—ＦＬＤ分析中药多糖单糖组成
酸浆为茄科酸浆属植物酸浆ＰｈｙｓａｌｈａｌｋｅｋｅｎｇｉＬ．的干燥宿萼或带果实的宿萼。味苦、酸，性寒。具有清热解毒、利咽、化痰及利尿作用－１］。现代医学认为酸浆具有调节血糖、抗氧化、降血脂、抗菌等作用Ｊ。酸
为分析纯。酸浆采自黑龙江省尚志市帽儿山，经黑龙江中医药大学药学院王振月教授鉴定为茄科酸浆属植物酸浆ＰｈｙｓａｌｈａｌｋｅｋｅｎｇｉＬ．的宿萼或带果实的宿萼，酸浆多糖样品为课题组前期制备。

PMP柱前衍生高效液相色谱法-终版

糖组成分析（PMP-HPLC）混合单糖标准品的准备：称取各单糖标准品（L-Fuc；L-Rha；L-Ara；L-Xyl；D-Man；D-Gal；D-Glc；D-GalA；D-GlcA）溶于去离子水中，配成1mg/ml以待分析。

多糖的水解称取2-4mg多糖样品于鸡心瓶（10ml）中，加入1ml H2O预溶，再加入1ml 4M的TFA，橡皮膏封闭瓶口，置110℃烘箱中水解（中性多糖水解2h，酸性多糖水解4h）；冷却至室温后，加甲醇多次（4次）除去多余的TFA至无酸味；水解的多糖样品复溶于200μLH2O。

单糖的PMP衍生化取50μL多糖水解液或50μL混合单糖标准品溶液于2ml EP管中，分别与50μL的0.6mol/L 的NaOH溶液充分混合，加入100μL 0.5mol/L的PMP（0.2613g/3ml）甲醇溶液，塞紧塞子封紧后，漩涡振荡仪混匀；在70℃水浴中反应100min，取出冷却至室温。

加入100μL 0.3 mol/L 的HCl中和，再加700μl去离子水以及1ml氯仿萃取，漩涡振荡，静置1-2h。

吸取上层水相900μl，再加入900μl的氯仿萃取一次，静置1h，再去上层水相800μl，再加入800μl 的氯仿萃取一次，或用低速离心代替静置处理。

用带有0.22μm微孔滤膜的注射器过滤后，装入液相瓶中待HPLC进样分析。

HPLC分析糖组成Agilent 1260高效液相色谱系统色谱柱：ZORBAX Eclipse XDB-C18，250mm×4.6mm, 5μm；流动相：Buffer A: 15%乙腈+85%磷酸盐缓冲液Buffer B: 40%乙腈+60%磷酸盐缓冲液磷酸盐缓冲液：0.05M 磷酸二氢钾缓冲液（pH 6.7）KH2PO4 13.6g及NaOH 1.8g溶液2L水中；乙腈（HPLC级）；时间（min）Buffer A Buffer B0 100 010 90 1030 80 2035 80 2045 80 2045.01 100 055 100 0柱温：20℃；紫外检测波长：254nm；流速：1ml/min；进样体积：20μl。

柱前衍生化一高效液相色谱法分析木糖结晶母液的单糖组成

为６９时间梯度为０ｌ— ２ — ３ｉ相应浓度．，一０００ｍｎ和梯度为０８ — ％一ｌ％一１％时溶剂Ｂ的梯度洗脱５５模式是分离此８种单糖衍生物的较理想色谱分离条件，单糖标准品的色谱分离图和木糖结晶母液的色谱分离图分别如图１所示。
可以看出，８个组分的平均回收率为９．％～８４
５０．ｌ００
．
１．５０
２．００
２５０
１．０１０％
表３８种单糖组分的回收率（５ｎ＝）
ｔａｉ／ｒｎ
孟海波，：等柱前衍生化一高效液相色谱法分析木糖结晶母液的单糖组成
４７
柱前衍生化一高效液相色谱法分析木糖结晶母液的单糖组成
孟海波高绍丰张海燕孟汉卿
（济南圣泉唐和唐生物科技有限公司，济南２００５２４）
摘要
采用１苯基．．一３甲基－一５吡唑啉酮（ＭＰ柱前衍生化一反相高效液相色谱（Ｌ法建立了８种常见单糖Ｐ）ＨＰＣ）
稀释，匀，混然后用０４ｍ水性滤膜过滤，０Ｌ．５１
进样。
１４色谱条件．
色谱柱：ｙｍｅｙＣ８（．ｍ ×１０ｍ５Ｓｍｔ１柱４６ｍｒ５ｍ，
ｍ）美国Ｗａｒ公司；ｉｎｘＵｔＭａ００色谱，ｔｓｅＤｏｅｌｔ３０ｉｅ
量，单糖的浓度与相应的峰高呈良好的线性关系，关系数ｒ在０９９０９９范围内，法检出限为００２ｌ８种相．８７～．９４方．０

高效液相色谱法测定不同产地白花蛇舌草中去乙酰车叶草酸甲酯的含量

食品与药品Food and Drug2021年第23卷第1期55高效液相色谱法测定不同产地白花蛇舌草中去乙酰车叶草酸甲酯的含量丁建兰，黄宁，赵超，袁丽，王毅梅(鹰潭市综合检验检测中心，江西鹰潭335000)摘要：目的建立高效液相色谱法(HPLC)测定不同产地白花蛇舌草中去乙酰车叶草酸甲酯的含量，为改善白花陀舌草的质量控制提供参考。

方法采用Waters SymmetryShield RP C18(4.6mmx250mm,5“m)色谱柱；流动相：乙睛-水(4:96)；检测波长：236nm；柱温：25°C；流速：1.0ml/min；进样量：10“1。

结果去乙酰车叶草酸甲酯在13.4-335.0“嗣范围内线性关系良好；平均回收率为99.37%,RSD为0.3%。

结论本方法简便、重复性好、准确度高，可用于白花蛇舌草的质量控制。

关键词：高效液相色谱法；白花蛇舌草；去乙酰车叶草酸甲酯；含量测定中图分类号：R284.1文献标识码：A文章编号：1672-979X(2021)01-0055-03DOI：10.3969/j.issn.l672-979X.2021.01.012Determination of Deacetyl Asperulosidic Acid Methyl Ester in Hedyotis Diffusa Willd fromDifferent Regions by HPLCDING Jian-lan,HUANG Ning,ZHAO Chao,YUAN Li,WANG Yi-mei(Yingtan Comprehensive Inspection and Testing Center,Yingtan335000,China)收稿日期：2020-05-25作者简介：丁建兰，主管中药师，从事食品药品检验检测工作E-mail:***************ADP induced blood platelets activation and aggregation in whole blood[J].Int J Biol Macromol,2017,95(1):682-688.[3]Yanachkov I B,Chang H,Yanachkova M I,et al.New highlyactive antiplatelet agents with dual specificity for platelet P2Y1 and P2Y12adenosine diphosphate receptors[J].Eur J Med Chem, 2015,107(1):204-218.[4]Fan H Fu F H,Yang M Y,et al.Antiplatelet and antithromboticactivities of s alvianolic acidA[J].Thromb Res,2010,126(1):17-22.[5]Sugidachi A,Ohno K,Ogawa T,et al.A comparsion of thepharmacological profiles of prasugrel and ticagrelor assessed by platelet aggregation,thrombus formation and haemostasis in rats[J].Brit J Pharmacol,2013,169(1):82-89.[6]Jacobson KA,Boeynaems J M.P2Y nucleotide receptors:promiseof therapeutic applications[J].Drug Discov Today,2010,15⑵：570-578.[7]Yang Y,Yan F,Gai J.Differential proteomics for studying actionmechanisms of traditional Chinese medicines[J].Chin Med,2019, 14(1):1-15.[8]Zhang Y,Xie Y,Liao X,et al.A Chinese patent medicine Salviamiltiorrhiza depside salts for infusion combined with conventionaltreatment for patients with angina pectoris:A systematic review and meta-analysis of randomized controlled trials[J], Phytomedicine,2017,25(6):100-117.[9]Zetterberg F,Svensson P.State of affairs:Design and structureactivity relationships of reversible P2Y12receptor antagonists[J].Bioorg Med Chern Let,2017,10(2):9-15.[10]Laine M,Paganelli F,Bonello L.P2Y12-ADP recq)tor antagonists:Days of future and past[J].World J Cardiol,2017,1(2):3-12. [11]Panovanoeva M,Marchetti M,Russo L,et al.ADP-inducedplatelet aggregation and thrombin generation are increased in Essential Thrombocythemia and Polycythemia Vera[J].Thromb Res,2018,12(2):88-93.[12]Tartari C J,Leuzzi A,Finazzi G,et al.The effects of bioactivecomponents from the rhizome of Salvia miltiorrhiza(Danshen) on the characteristics of A lzheimer's disease[J].Chin Medic,2019, 1(2):80-92.[13]Toesca R,Berbis J,Frere C,et al.Platelet reactivity evalxiatedwith the VA.SP assay following ticagrelor loading dose in acute coronary syndrome patients undergoing percutaneous coronary intervention[J].Thromb Res,2013,132(2):15-18.56食品与药品Food and Drug2021年第23卷第1期Abstract:Objective To establish an HPLC method for the determination of deacetyl asperulosidic acid methyl ester in Hedyotis difusa Willd&om di琏r^t regions弧d to pnrvide a reference for quality control of Hedyotis diffusa、Methods A Waters SymmetryShield RP C18column(4.6mmx250mm,5ym)was adopted.The mobile phase was acetonitrile-water(4:96)with detection wavelength set at236nm,the column temperature was25°C and the flow rate was1.0ml/min.Results The linear range of deacetyl asperulosidic acid methyl ester was13.4-335.0yg/ml.The average recovery of oleanolic acid was99.37%,with RSD of0.3%.Conclusion The method is simple,reproducible and accurate,and can be applied to the quality control of H edyotis diffusa.Key Words:HPLC;Hedyotis diffusa;deacetyl asperulosidic acid methyl ester;determination白花蛇舌草为茜草科耳草属植物白花蛇舌草的干燥全草，具有清热解毒、消痈散结、利水消肿等作用，广泛应用于毒蛇咬伤，咽喉肿痛，肺热喘咳，湿热黄疸，热淋涩痛，疮肿热痈等的治疗。

HPLC法测定白花蛇舌草药材中2种环烯醚萜类成分含量

西北药学杂志
２１年１第２０１Ｏ月６卷
第５期
ห้องสมุดไป่ตู้
３７２
［］曹英莉，子明．园枇杷叶膏的质量标准研究Ｅ］浙８赵良Ｊ．江中西医结合杂志，０Ｏ２（）５７５８２１，０９：７ —７．Ｅ］国家药典委员会．国药典２１９中００年版Ｉ］一部．京：ｓ．北
ｍｍＸ４６ｍｍ，ｍ）流动相：醇一．５；甲乙腈一ｌＬ１醋酸（２：９）检测波长：３ｍ；速：．１ｍｏ・Ｉ冰３：５；２０ｎ流１０ｍＬ・ｎ。结果去乙ｍｉ～
酰基车叶草苷酸与鸡屎藤次苷质量浓度分别在１～２０ｇ・Ｌ１ｒ一０９９７和１．～２６ｇ・（一０９９８范围内２４ｍ＿（．９）Ｏ８１ｍＬｒ．９）
ｄｔｃｉｎｗａｅｔ２０ｎｅｅｔｏｓｓｔａ３ｍ．ＲｅｕｔｅｃｌｒｔｎｃｒｅｏｅｃｔｌｓｅｕｏｉｉａｉｎｃｎｏｉｅｗｅｅｌｅｒｉｈｏｃｎｓｌｓＴｈａｉａｉｕｖｆｄａｅｙａｐｒｌｓｄｃｃｄａｄｓａｄｓｄｒｉａｎｔｅｃｎｅ — ｂｏｎ
线性关系良好；均加样回收率分别为１１１和９．，Ｓ分别为２８和２３。结论该方法简便、平０．９８ＲＤ．．准确，复性好，重可

唐古特白刺多糖提取、修饰及免疫活性研究

唐古特白刺多糖提取、修饰及免疫活性研究唐古特白刺(Nitraria tangutorun Bobr.)是蒺薬科(Zygophyllceae)白刺属(Nitraria)植物,其果实药食同源。

唐古特白刺果实富含多糖,研究表明唐古特白刺果实多糖具有免疫调节和抗氧化等生物活性,具有巨大的开发利用价值。

本研究主要对唐古特白刺果实多糖提取工艺、脱色工艺、羧甲基化修饰、羧甲基化修饰前后白刺多糖的化学表征及其抗氧化和免疫活性等方面进行了研究,以期能够为开发利用唐古特白刺多糖提供实验依据。

主要实验结果如下:1.优化植物多糖提取工艺可以减少资源浪费,降低能耗。

本研究在单因素实验的基础上,采用响应面法分别优化了热水浸提唐古特白刺多糖和酶辅助提取唐古特白刺多糖的工艺。

热水浸提法的最佳提取条件为:提取温度79 ℃,提取时间1.5 h和料液比1:15,再此条件下提取两次,白刺多糖得率为39.67 ±0.02%。

酶辅助提取法较优的提取条件为:酶用量2.5%,pH = 3,提取时间58 min和提取温度40.0℃,提取一次,白刺多糖得率为39.57 ±0.11%。

酶辅助提取唐古特白刺多糖缩短了提取时间、降低了提取温度、减少了提取次数,大幅度降低了提取过程中的能耗。

2.从植物原材料中提取获得的植物粗多糖通常具有较深的颜色,严重限制了植物多糖在食品和药品中的应用。

为了有效解决这一问题,本研究采用大孔树脂吸附法对白刺粗多糖溶液进行脱色,并对脱色工艺进行了优化。

利用静态吸附实验,从10种大孔树脂中筛选出HPD-100A大孔吸附树脂作为脱色树脂,并考察了pH对大孔树脂脱色、多糖回收率和脱蛋白的影响;利用动态吸附实验考察了上样流速和上样浓度对大孔树脂脱色和脱蛋白的影响。

最终优化的脱色条件为:采用HPD-100A大孔吸附树脂作为脱色树脂,白刺粗多糖溶液浓度为1.04mg/mL,pH =5,上样流速为1.5 BV/h。

在此条件下白刺粗多糖的脱色率为74.78%,脱蛋白率为70.96%,多糖的回收率为86.31%。

单糖柱前PMP衍生HPLC测定方法探讨

单糖柱前PMP衍生HPLC测定方法探讨朱照武;庄洋;向春林;赵娜;李珊;向玲芳;莫开菊【摘要】This article discussed the impact of PMP pre-column derivation on monosaccharide derivatives from extraction pH and extraction times.Moreover, the influence of mobile phase on the HPLC chromato-graphic peaks also have been studied from the ratio of mobile phase, the pH of buffer and the concentra-tion of buffer.The resultsindicated:Neutralized the derivation liquid with HCl to pH7.0 could avoid the loss of derivatives products to the utmost.Extracting three times by chloroform could remove almost PMP and avoid the loss of derivatives.Reducing the ratio of organic phase or the pH of buffer could improve the seperation of peaks;the asymmetry factor of peaks could be maintained in the optimum range by increas-ing the concentration of buffer.%从PMP萃取酸度、萃取次数探讨了柱前PMP衍生方法对单糖-PMP衍生物的影响,并从流动相比例、缓冲液pH值、缓冲盐浓度三个方面对单糖柱前衍生HPLC的分离效果进行了优化研究.结果表明:单糖进行PMP衍生后,用HCl中和至pH为7.0,能最大限度避免单糖-PMP衍生产物的损失;使用三氯甲烷萃取PMP 三次时,能在除去PMP的情况下避免单糖-PMP衍生产物的损失;降低流动相中有机相的比例或提高缓冲液的pH值,有利于色谱峰分离度的提高;提高缓冲盐浓度,有利于保持色谱峰的对称性.【期刊名称】《湖北民族学院学报（自然科学版）》【年(卷),期】2015(033)003【总页数】5页(P337-341)【关键词】单糖;PMP衍生物;高效液相色谱;分离度;不对称因子【作者】朱照武;庄洋;向春林;赵娜;李珊;向玲芳;莫开菊【作者单位】湖北民族学院生物科学与技术学院,湖北恩施445000;生物资源保护与利用湖北省重点实验室(湖北民族学院) ,湖北恩施445000;湖北民族学院生物科学与技术学院,湖北恩施445000;生物资源保护与利用湖北省重点实验室(湖北民族学院) ,湖北恩施445000;湖北民族学院生物科学与技术学院,湖北恩施445000;生物资源保护与利用湖北省重点实验室(湖北民族学院) ,湖北恩施445000;生物资源保护与利用湖北省重点实验室(湖北民族学院) ,湖北恩施445000;湖北民族学院生物科学与技术学院,湖北恩施445000;生物资源保护与利用湖北省重点实验室(湖北民族学院) ,湖北恩施445000;湖北民族学院生物科学与技术学院,湖北恩施445000;生物资源保护与利用湖北省重点实验室(湖北民族学院) ,湖北恩施445000;湖北民族学院生物科学与技术学院,湖北恩施445000;生物资源保护与利用湖北省重点实验室(湖北民族学院) ,湖北恩施445000【正文语种】中文【中图分类】O657.72多糖类物质广泛存在于自然界中，近年来，我国对植物多糖展开了广泛的研究，植物多糖的药理活性是研究的重点［1－4］.多糖是由单糖通过糖苷键连接而成的，多糖的单糖组成作为一级结构的主要内容，自然成为研究多糖生物活性的基础［5］.糖类物质因不具有发色基团不能直接使用紫外和荧光检测而限制了分析手段的应用，自1989年Honda等［6－8］首次在弱碱性条件下成功实现PMP糖类衍生，使糖类被标记上紫外吸收基团，具有强烈的紫外吸收，糖类的分析方法就得到快速发展.其中，PMP柱前衍生化HPLC分析成为糖类分析的重要方法.杨兴斌等［9］建立了当归多糖单糖组成的PMP柱前衍生化HPLC方法，Lv等［10］利用PMP柱前衍生化HPLC法分析出绿茶多糖由甘露糖、木糖、阿拉伯糖等9种单糖组成.尽管PMP在糖类检测方面具有优越性，但是糖类－PMP衍生方法仍存在一定不足.有报道指出，PMP衍生产物易丢失1分子PMP，且PMP试剂的疏水性偏低，多次萃取难以完全去除，萃取过程也会引起部分样品的损失［11］.Castells［12］也报道过PMP萃取过程会导致衍生产物的损失.此外，戴军［13］对三氯甲烷萃取时溶液的酸度进行研究，发现溶液偏碱性时衍生产物在三氯甲烷中有一定的溶解度，会造成损失，这与Strydom［14］的研究结果一致；若萃取时溶液偏酸性，衍生产物不稳定，也会造成结果偏低.单糖种类繁多，许多植物多糖的单糖组成复杂，经常需要调整液相色谱条件使各种单糖衍生物的色谱峰达到完全分离.在色谱柱固定的条件下，色谱峰的分离效果很大程度取决于流动相，因此，了解流动相对色谱峰分离效果及峰形的影响有利于在不同条件下获得良好的单糖衍生物色谱图.本文从单糖的PMP衍生方法及衍生产物的HPLC分离两个方面进行探讨，为单糖柱前PMP衍生HPLC方法的优化提供一定的理论依据.1.1 材料与试剂D－甘露糖、D－半乳糖、L－鼠李糖、L－阿拉伯糖德国Dr.Ehrenstorfer公司；D－葡萄糖、L－岩藻糖美国sigma公司；1－苯基－3－甲基－5－吡唑啉酮（PMP）、D－葡萄糖醛酸、D－半乳糖醛酸国药集团化学试剂有限公司；甲醇、乙腈色谱纯美国TEDIA天地试剂公司；磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、氢氧化钠、盐酸、三氯甲烷均为国产分析纯国药集团化学试剂有限公司.1.2 仪器与设备P680 ALPG高效液相色谱仪，包括DAD－100检测器、TCC－100柱温箱和Chromeleon色谱工作站（戴安中国有限公司）；MS1 Minishaker漩涡混合器（德国IKA公司）；GZX－9140 MBE数显鼓风干燥箱（上海博迅实业有限公司医疗设备厂）；KQ5200B型超声波清洗器（昆山市超声仪器公司）.1.3 方法1.3.1 单糖的衍生分别配制一定浓度的甘露糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖及岩藻糖的单糖标准溶液和混合标准溶液.各标准溶液分别取50 μL置于5 mL的具塞试管中，各加50 μL 0.6mol／L的NaOH溶液，漩涡混匀；再加100μL0.5mol／L的PMP甲醇溶液，漩涡混匀，在70℃的烘箱中避光反应100min，取出避光放置10min冷却至室温，加一定量的0.3 mol／L 的HCL，加水至2 mL，再加2 mL的三氯甲烷，漩涡混匀，静置，弃去三氯甲烷相，如此萃取几次.将水相用0.45μm微孔膜过滤后供HPLC进行分析.1.3.2 高效液相色谱分析色谱条件：Agilent ZORBAX Eclipse XDB－C18色谱柱（250mm×4.6mm，5μm）；流动相：A液：0.1mol／L的pH6.7磷酸钾盐缓冲液，B液：乙腈；柱温：30℃；检测波长：250 nm；流速：1 mL／min；进样体积：20μL.1.3.3 萃取酸度对PMP衍生产物的影响衍生反应结束后，待混合标准液冷却至室温，分别加入80、90、100、110、120μL 0.3mol／L的盐酸，加水至2mL，同1.3.1法萃取、过0.45μm微孔膜后进行HPLC分析.1.3.4 萃取过程对PMP残留及衍生产物的影响样品按1.3.1衍生中和后，加入三氯甲烷，漩涡混匀10s间隔5s，重复3次后，静置，弃去三氯甲烷层，如此分别萃取1、2、3、4、5次.样品过0.45μm微孔膜后进行HPLC分析.1.3.5 流动相比例对单糖衍生物的分离度影响混合标准单糖溶液进行PMP衍生后，分别在流动相比例为A液∶B液＝80∶20、81∶19、82∶18、83∶17的条件下进行HPLC分析，比较色谱峰的分离度R．1.3.6 流动相pH值对单糖衍生物的分离度影响分别配制pH为6.5和6.7的0.1 mol／L的磷酸钾盐缓冲液为A液，以最佳流动相比例对单糖衍生物进行HPLC分析，比较色谱峰的分离度R．1.3.7 磷酸缓冲盐浓度对色谱峰对称性的影响分别配制浓度为0.01、0.05、0.1mol／L pH6.7的磷酸钾盐缓冲液作为流动相A液，在最佳流动相比例下，对葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖、岩藻糖四种单糖衍生物进行HPLC分析，比较色谱峰的不对称因子As．2.1 萃取酸度对PMP衍生产物的影响PMP衍生结束后，加入HCl中和，在中性条件下，利用三氯甲烷萃取出多余的PMP，保留单糖－PMP衍生产物.萃取时溶液环境偏酸或偏碱均会对单糖－PMP 衍生产物造成影响，如表1，若溶液偏碱性，则单糖－PMP衍生物的峰面积低于完全中和时的测定结果，若中和过度，溶液偏酸性，单糖－PMP衍生物的峰面积也低于完全中和时的测定结果.总之，萃取时溶液偏酸或偏碱均会影响试验结果，这与戴军［13］的研究一致.试验结果表明，萃取酸度对不同单糖衍生物的影响不同，对葡萄糖醛酸和半乳糖醛酸的PMP衍生产物的影响最大，对甘露糖和鼠李糖的PMP衍生物的影响最小.溶液呈中性时，八种单糖－PMP衍生物峰面积的总和最大.2.2 萃取过程对PMP残留的影响萃取时，若PMP萃取不彻底，HPLC图谱中PMP峰明显，影响图谱效果；若PMP萃取过度，可能会造成单糖－PMP衍生产物的损失.分别对混合标准品的衍生液萃取1、2、3、4、5次后的结果如图1和表2.三氯甲烷萃取一次时，溶液中单糖－PMP衍生产物的峰面积最大，但PMP残留严重，峰面积大于单糖－PMP衍生产物，当萃取次数达到3次时，PMP残留量较低，不影响图谱效果，萃取4次时图谱上已无明显PMP峰.但随着萃取次数的增加，单糖－PMP衍生物的含量却逐步降低，萃取5次时，单糖－PMP衍生物的含量出现明显下降.因此，综合考虑单糖－PMP衍生物的保留、PMP的去除以及萃取工作量，选择萃取3次较合适.2.3 流动相比例对单糖衍生物分离度的影响在实验条件下，8种单糖衍生物的保留顺序依次为甘露糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖、岩藻糖.四种流动相比例条件下，8种单糖衍生物的色谱峰分离效果如图2.由图2看出，pH6.7的缓冲液∶乙腈＝80∶20时，鼠李糖和葡萄糖醛酸衍生物的色谱峰完全重叠，且与半乳糖醛酸衍生物不能完全分离；随着缓冲液比例的提高，鼠李糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸衍生物色谱峰的分离度逐渐提高，当缓冲液比例提高到82%时，8种单糖衍生物达到完全分离；继续提高缓冲液比例至83%时，分离效果进一步改善.4种流动相比例下，各单糖衍生物色谱峰的分离度R如表3，提高缓冲液比例降低有机相比例时，色谱峰的分离度R提高，但保留时间延长，流动相比例为83∶17时，样品运行时间长达50 min.因此，选择刚好能使八种单糖衍生物完全分离的流动相比例，即pH6.7磷酸缓冲液∶乙腈＝82∶18.2.4 缓冲液pH值对单糖衍生物分离度的影响色谱柱使用一段时间后，柱效降低，流动相比例为pH6.7的磷酸缓冲液∶乙腈＝82∶18时，鼠李糖与半乳糖醛酸的分离度R下降，不能完全分离.在保持流动相比例不变的条件下，降低缓冲液pH，八种单糖衍生物的分离效果如图3.在本试验条件下，将磷酸缓冲液的pH从6.7降低到6.5，能显著改善鼠李糖和葡萄糖醛酸衍生物的分离效果，达到完全分离，但同时样品分离时间延长.两种pH条件下，八种单糖衍生物的分离度R如表4，pH6.5条件下各色谱峰的分离度R几乎均大于pH6.7.因此，降低磷酸缓冲液的pH，有助于提高色谱峰的分离效果.2.5 缓冲盐浓度对色谱峰的影响分别使用盐浓度为0.01、0.05、0.10mol／L的pH6.7磷酸钾盐缓冲液作为流动相A液，对葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖、岩藻糖四种单糖衍生物进行HPLC分析，比较不同缓冲盐浓度对色谱峰不对称因As的影响．结果如图4和表5，在实验范围内，缓冲盐浓度越高，不对称因子As越小，峰形越好.当盐浓度为0.01 mol／L 时，色谱峰的不对称因子As均高于1．4，明显拖尾；当盐浓度为0.05mol／L时，色谱峰的不对称因子As有所降低，色谱峰对称性提高；当盐浓度为0.10mol／L 时，色谱峰的不对称因子As在1．05～1．2之间，对称性较好．本文研究了单糖衍生方法的中和、萃取过程对单糖－PMP衍生物的影响以及流动相对HPLC色谱峰的影响，结果表明：1）衍生结束后使用HCl完全中和，可以避免单糖－PMP衍生产物的损失.可能是由于单糖－PMP衍生物含有碱性基团，易在碱性条件下随三氯甲烷萃取损失，而在酸性的环境中不稳定，其原因需进一步研究确认.2）使用三氯甲烷萃取PMP时，萃取多次可以显著降低PMP的残留，但在中性条件下萃取，仍然会造成单糖－PMP衍生产物的损失.选择萃取3次，能较好平衡PMP去除和衍生产物保留的关系.3）降低流动相中有机相的比例或降低缓冲液的pH值，均能提高单糖衍生物色谱峰的分离效果；提高缓冲盐浓度，能改善色谱峰的峰形，防止拖尾.使用磷酸缓冲液作为无机相时，为保持峰形对称，需要较高的盐浓度，而高浓度的盐溶液对液相色谱系统和色谱柱均不利，有研究表明使用低浓度的乙酸铵盐溶液也能得到对称性好的色谱峰［15－17］，因此，应考虑使用乙酸铵盐或寻找其他的缓冲体系替代磷酸缓冲盐.实验中样品不同浓度会影响色谱图响应值.【相关文献】［1］柳志宇.玛咖多糖提取及其单糖组成的研究［D］.北京：北京林业大学，2012.［2］唐策.黄连多糖的提取方法、单糖组成及其抑制α－葡萄糖苷酶活性研究［D］.成都：成都中医药大学，2013.［3］美合日阿依·伊萨克，马虎，周文婷，等.维药榅桲多糖抗血栓作用及其机制研究［J］.中国药理学通报，2015，31（2）：295－296.［4］李慧文，韩春姬，洪喜道，等.红参多糖对免疫抑制小鼠免疫功能的影响［J］.延边大学农学学报，2012，34（4）：330－333＋343.［5］王蓉，吴剑波.多糖生物活性的研究进展［J］.国外医药抗生素分册，2001，22（3）：97－100.［6］陈克克.地瓜儿多糖的单糖组成实验中两种流动相的比较研究［J］.陕西农业科学，2009，5（5）：41－45＋49.［7］Honda S，Akao E，Su－uzki S，et al.High－performance liquid chromatography of reducing carbohydrates as strongly uitraviolet－absorbing and electro⁃chemically sensitive 1－phenyl－3－methyl－5－pyrazolone derivatives［J］.Analytical Biochemistry，1989，180：351－357.［8］Honda S，Togashi K，Taga A.Unusual separation of l－phenyl－3－mehtyl－5－pyrazolone derivatives of aldoses by capillary zone electrophoresis［J］.J ChormatogrA，1997，791：307－311.［9］Honda S，Suuzki S，Taga A.Analysis of carbohydrates as l－phenyl－3－methyl－5－pyrazolone derivatives by capillary／microchip electrophoresis and capillary electrochromatography［J］.J.Pharm.Biomed.Anal.2003，30：1689－1714.［10］杨兴斌，赵燕，周四元，等.柱前衍生化高效液相色谱法分析当归多糖的单糖组成［J］.分析化学，2005，33（9）：1287－1290.［11］Lv Y，Yang XB，Zhao Y，et al.Separation and quantification of component monosaccharides of the tea polysaccharides from Gynostemma pentaphyl⁃lum by HPLC with indirect UV detection［J］.Food Chemistry，2009，112（3）：742－746.［12］张萍.1，3取代吡唑啉酮类试剂的合成及其用于糖类物质的衍生化和分析研究［D］.西安：西北大学，2011.［13］C.B.Castells，V.C.Arias，R.C.Castells.Precolumn derivatization of reducing carbohydrates with 4－（3－methyl－5－oxo－2－pyrazolin－1－yl）benzoic acid.Study of reaction，high－performance liquid chromatographic separation and quantitative performance of method［J］.Chromatographia，2002，56（8）：153－160.［14］戴军，朱松，汤坚，等.PMP柱前衍生高效液相色谱法分析杜氏盐藻多糖的单糖组成［J］.分析测试学报，2007，26（2）：206－210.［15］STRYDOM D.J.Chromatographic separation of 1－phenyl－3－methyl－5－pyrazolone－derivatized neutra，l acidic and basic aldo－ses［J］.J Chroma⁃togr A，1994，678：17－23.［16］任浩娜，陈晓辉，毕开顺，等.柱前衍生化HPLC法分析沙参多糖中单糖组成［J］.沈阳药科大学学报，2009，26（3）：206－209.［17］林雪，贾敬芬，黄琳娟，等.RP－HPLC用于芦荟多糖的单糖组成研究［J］.食品科学，2006，27（4）：192－195.。