氨基酸的薄层层析实验_课件
《氨基酸的薄层层析》课件
薄层板的制备
薄层板选择
选择适合氨基酸分离的薄层板，如硅胶板、氧化铝板等。
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ薄层板的活化
对薄层板进行活化处理，使其表面具有较好的吸附性能。
点样
点样工具选择
选择适当的点样工具，如微量注射器或点样模板。
点样位置和量
在薄层板上标记点样位置，并控制点样量，以便于后续的展开和分离。
展开
展开溶剂选择
选择适合氨基酸分离的展开溶剂，确保 能够将氨基酸充分展开。
氨基酸的鉴定
斑点颜色
不同氨基酸在薄层层析后呈现不同的颜色，可初 步判断氨基酸的种类。
斑点Rf值
不同氨基酸在薄层层析后的迁移率不同，得到的 Rf值也不同，可用来鉴定氨基酸的种类。
斑点质谱分析
对薄层层析后的斑点进行质谱分析，可确定氨基 酸的分子量和结构，进一步确定氨基酸的种类。
定量分析
斑点面积法
通过测量薄层层析后斑点的面积，计算斑点中氨基酸的含量。该方法简单易行，但误差 较大。
在生物科学研究中的应用
氨基酸薄层层析在生物科学研究中常 用于分离和鉴定蛋白质和多肽，是研 究蛋白质组学和生物大分子相互作用 的重要手段之一。
通过氨基酸薄层层析技术，可以分离 出不同蛋白质组分，进一步进行质谱 分析和功能研究，有助于深入了解生 物体内蛋白质的种类、结构和功能。
在医学和临床诊断中的应用
分离效果的评价
分离度
层析后各氨基酸斑点的清晰度和 分离度，可用分离度数值表示。 分离度数值越大，分离效果越好
。
分辨率
层析后各氨基酸斑点间的距离和清 晰度，分辨率越高，分离效果越好 。
重复性
层析实验的重复性，包括多次层析 结果的重复性和同一份样品多次层 析结果的重复性。重复性越好，分 离效果越稳定。
氨基酸的薄层层析
氨基酸的薄层层析一、实验目的1．掌握薄层层析法的一般原理。
2．掌握氨基酸薄层层析法的基本操作技术。
3.掌握如何根据移动速率（Rf值）来鉴定被分离的物质（即氨基酸混合液）。
二、实验原理1．薄层层析法是色谱分析技术的一种一般是将固体吸附剂涂布在平板上形成薄层作为固定相。
当液相（展开溶剂）在固定相上流动时，由于吸附剂对不同氨基酸的吸附力不一样，不同氨基酸在展开溶剂中的溶解度不一样，点在薄板上的混合氨基酸样品随着展开剂的移动速率也不同，因而可以彼此分开。
（即通过吸附-解吸-再吸附-再解吸的反复进行，而将样品各组分分离开来）硅胶吸附薄层层析吸附薄层中常用的吸附剂为氧化铝和硅胶硅胶：表达式为SiO2-XH2O。
层析用硅胶是一种多孔性物质，它的硅氧环交链结构表面上密布极性硅醇基（一Si —OH）,这种极性的硅醇基能和许多化合物形成氢键而产生吸附。
硅胶吸附薄层层析的特点：①硅胶的吸附能力比氧化铝稍弱，其吸附活性也与含水量呈负性相关。
②硅醇基显较弱的酸性，因而，硅胶只能用于中性、或酸性成分的分离，碱性成分不能用它分离。
③硅胶的活化温度通常为105℃ —110℃,不能过高。
但是实际操作时为70℃,活化1h 2．氨基酸与茚三酮的显色反应茚三酮水化后生成水化茚三酮，它与氨基酸的羧基反应生成还原茚三酮、氨及醛，与此同时，还原茚三酮又与氨及茚三酮缩合生成紫红化合物而使氨基酸斑点显色。
3.记录结果，计算Rf值混合氨基酸被分离后，在薄层层析图谱上的位置用相对迁移率一Rf值（rate of flow）来表示。
层析中，物质沿溶剂运动方向迁移的距离与溶液前沿的距离之比为Rf值。
由于物质在一定溶剂中的分配系数是一定的，故移动速率（Rf值）也是恒定的，因此可以根据 Rf值来鉴定被分离的物质。
三、材料与方法：材料：（一）分析样品：氨基酸混合液（二）试剂：吸附剂：硅胶粘合剂： 0.5%的羧甲基纤维素钠、氨基酸的异丙醇溶液、丙氨酸、精氨酸、甘氨酸。
氨基酸的薄层层析
氨基酸的薄层层析[原理]氨基酸薄层层析属于吸附层析，主要根据各种氨基酸在吸附剂表面的吸附能力不同进行分离或提纯的一种方法。
将硅胶（吸附剂—作为固定相的支持剂）均匀地铺在玻璃片上，并将氨基酸样品点于吸附剂上。
在密闭容器中，由于吸附剂的毛细管作用使展开剂上行将样品展开。
被分离的氨基酸因结构不同，在吸附剂上的吸附亲和力也不同。
吸附力大的就容易被吸附剂吸附，而较难被溶剂所冲洗（即解吸）；吸附力小的就容易被溶剂携带至较远的距离。
氨基酸在吸附剂和展开剂之间反复多次的进行吸附和解吸附，从而使不同的氨基酸达到分离的目的。
[试剂]（一）硅胶G（二）0.2%羧甲基纤维素钠称取羧甲基纤维素钠1g溶于蒸馏水100 ml中，在沸水浴中煮沸至无气泡，冷却，置冰箱储存，临用前稀释至0.2%。
（二）氨基酸溶液制备下列各氨基酸的异丙醇（90%）溶液各10ml。
1．0.01mol/L精氨酸精氨酸15.9mg溶于90%异丙醇10ml中。
2．0.01mol/L甘氨酸甘氨酸7.5mg溶于90%异丙醇10ml中。
3．0.01mol/L酪氨酸酪氨酸18.1mg溶于90%异丙醇10ml中。
将上述溶液各取出1ml，混合均匀作为氨基酸混合溶液。
（三）展开剂按4：1：1体积比例混合正丁醇，冰乙酸及水。
临用时配置。
（四）0.5%茚三酮丙酮溶液茚三酮0.5g溶于无水丙酮100ml中。
[主要器材]（一）玻璃板（4×10cm）（二）层析缸。
（三）喷雾器。
（四）长颈漏斗。
（五）玻璃毛细管。
（六）恒温干燥箱。
[操作步骤]（一）薄板的制备1．称取硅胶G 0.5g放入研钵中，加1.5ml0.2%羧甲基纤维素钠，研磨成均匀的稀糊状。
2．将上述糊状物倾倒在4×10cm的玻璃片（图11）上，使之均匀地布满于玻片，将玻片轻轻地晃动，使硅胶G均匀分布，表面平坦，光滑，无水层及气泡，然后水平放置在空气中使其自然干燥。
1．薄板上硅胶干后，放入105℃的恒温干燥箱内活化，半小时后取出，晾凉备用。
氨基酸的薄层层析
氨基酸的薄层层析实验2 氨基酸的薄层层析一、目的熟悉层析技术的一般原理，分类及应用范围。
重点掌握薄层层析法的原理及操作技术，用以分离混合氨基酸中各游离氨基酸组分。
了解层析技术来分离不同物质的基本原理，以及层析技术的优点。
二、原理层析法又称色谱法、色层法或层离法，是广泛应用的一种生物化学技术。
根据流动相不同分为液相层析和气相层析。
按照层析过程的机理不同，层析法分为以下几种类型：1、吸附层析：利用吸附剂表面对不同物质吸附性能的差异进行分离。
例如活性炭，硅胶等。
2、分配层析：利用不同组分在流动相和固定相之间的分配系数不同，使之分离。
3、离子交换层析：利用不同组分对离子交换剂亲和力的不同。
对于蛋白质、核酸、氨基酸及核苷酸的分离分析有极好的分辨力。
4、凝胶层析：利用某些凝胶对于不同分子大小的组分阻滞作用的不同。
例如聚丙烯酰胺凝胶、琼脂糖凝胶。
5、亲和层析：利用某些蛋白质能与配体分子特异而非共价地结合进行分离。
例如酶和抑制剂，抗原和抗体，激素和受体等按操作形式不同，层析法分为以下几种类型：1、柱层析：将固定相装于柱内，使样品沿一个方向移动而达到分离。
2、纸层析：用滤纸做液体的载体，点样后，用流动相展开，以达到分离鉴定的目的。
3、薄层层析：薄层层析是一种微量而快速的层离方法，与纸层析方法类似。
这种层析方法是把吸附剂如氧化铝或硅胶涂布于薄板上（玻璃或金属等）形成薄层，把要分析的样品溶液滴加到薄层的一端，然后在此薄层上用适当的溶剂进行展开即为薄层层析。
本实验中用到薄层层析是一种微量而快速的层离方法。
这种层析方法是把吸附剂如氧化铝或硅藻土涂布于薄板上（玻璃或金属等）形成薄层，把要分析的样品溶液滴加到薄层的一端，然后在此薄层上用适当的溶剂进行展开即为薄层层析。
本实验中硅胶作为一种固相支持物，它与水有较强的亲和力而与有机溶剂亲和力较弱。
层析时吸着在硅胶上的水是固定相，而展层溶剂是流动相。
当欲被分离的各种物质在固定相和流动相中的分配系数不同时，它们就能被分离开。
生物化学实验7.氨基酸薄层层析
②按操作形式不同：柱层析、薄层层析和纸层析。
③按层析的原理不同：吸附层析、分配层析、凝胶过滤
层析、离子交换层析和亲和层析等。
2、吸附薄层层析的原理
1）概念：将吸附剂等材料均匀的铺在玻璃板或其他薄板上，
形成薄层，然后在此薄层上进行层析的方法。
2）组成
煅石膏 ①固定相
增加薄层板的机械强度 具极强的吸水性，且吸水后失活；
2.5cm 两次点样点样点要重合。
Arg Gly Mix 轻触疾起
（三） 展层、显色
将薄层板点样端浸入展 开剂，展开剂液面应低于点 样点。盖好层析缸盖，上行 展层。当展开剂到达薄层板 全长约3/4 处时（约40min）， 取出薄层板，并记下展开剂 前沿位置，然后105℃烘干 5min。
用装有茚三酮—丙酮溶液的 喷雾器将溶液均匀地喷洒在薄 层板表面(下半部，3-4次），
贴壁、3-4min
2、涂布 取洁净的干燥玻璃板用玻璃棒沿中线或 之字形引流均匀涂层（3点）。
3、干燥 将玻璃板水平放置，室温下自然凉干 （表面不反光）。
4、活化 105℃烘干20min。切断电源，待玻璃 板面温度下降至不烫手时取出。
（二）点样
1 、 位 置 ： 距 底 边 2.5cm 两 条 直 线交点处点样。 2、取样：用毛细管分别吸取氨 基酸溶液，取样量为毛细管柱 高约1cm（调高度）。 3、点样：垂直于薄板分两次点 样，第一次干后再点第二次，
硅胶（主要） 硅醇基
被结合的物质极性越强结合力越大； 硅胶越干燥吸附力越强。
②流动相：有机溶剂和水，能够溶解氨基酸；
③样品：甘氨酸、精氨酸和混合氨基酸； 3）原理
将硅胶溶液涂布在玻璃板上铺成薄层作为固定相。当流 动相在薄层板上流动时，由于硅胶对不同氨基酸的吸附力 不一样，不同氨基酸在展开溶剂中的溶解度不一样，点在 薄板上的混合氨基酸样品随着展开剂的移动速率也不同， 因而可以彼此分开。（吸附-解吸-再吸附-再解吸的反复进 行，极性大的移动的慢，极性小的移动的快。）
【正式版】纸层析法分离鉴定氨基酸PPT
由于氨基酸无色，可利用茚三酮反应使氨基酸层析斑点显色，从而作定性分析。 点样：用毛细管依次将Lys(赖) 、 Gly(甘) 、 Pro(脯)、Val (缬)、 Leu (亮)和混合样品分别点在这6个位置上，点样点干后再点一次。 待溶剂上升15～20 cm时，取出滤纸，用铅笔描出溶剂前沿界线，电吹风吹干。 纸层析法分离鉴定氨基酸 所谓Rf，是指在纸层析中，从原点至氨基酸停留点（又称为层析点）中心的距离（X）与原点至溶剂前沿的距离（Y）的比值。 由于氨基酸无色，可利用茚三酮反应使氨基酸层析斑点显色，从而作定性分析。 注意事项：手不能直接接触滤纸； (3) 显色剂：％ (m/V)水合茚三酮正丁醇溶液 。 在一定条件下（如温度、展层剂的组成、层析纸质量等不变），某种物质的Rf 值是常数，因此可作为定性依据。 在层析缸中装入展层剂，其高度约～2cm。 所谓Rf，是指在纸层析中，从原点至氨基酸停留点（又称为层析点）中心的距离（X）与原点至溶剂前沿的距离（Y）的比值。 纸层析法分离鉴定氨基酸
纸层析法分离鉴定氨基酸
将样品点在距滤纸一端约2～3cm的某一处， 该点称为原点；然后在密闭容器中层析溶剂 沿滤纸的一个方向进行展层，这样混合氨基 酸在两相中不断分配。由于分配系数（Kd） 不同，结果它们分布在滤纸的不同位置上。 物质被分离后在纸层析图谱上的位置，可用 比移值（Rf）来表示。 所谓Rf，是指在纸层析中，从原点至氨基酸 停留点（又称为层析点）中心的距离（X）与 原点至溶剂前沿的距离（Y）的比值。如图
笔描出溶剂前沿界线，电吹风吹干。 在所一谓定 Rf条，件是下指（在如纸温层度析、中展，层从剂原的点组至成氨、基层酸析停纸留质点量（等又不称变为）层，析某点种）物中质心的距Rf离值（是X常）数与，原因点此至可溶作剂为前定沿性的依距据离。（Y）的比值。
纸层析法分离氨基酸30页PPT
61、奢侈是舒适的，否则就不是奢侈 。——CocoCha nel 62、少而好学，如日出之阳；壮而好学 ，如日 中之光 ；志而 好学， 如炳烛 之光。 ——刘 向 63、三军可夺帅也，匹夫不可夺志也。 ——孔 丘 64、人生就是学校。在那里，与其说好 的教师 是幸福 ，不如 说好的 教师是 不幸。 ——海 贝尔 65、接受挑战，就可以享受胜利的喜悦 。——杰纳勒 尔·乔治·S·巴顿
谢谢！
纸பைடு நூலகம்析法分离氨基酸
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6、黄金时代是在我们的前面，而不在 我们的 后面。
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7、心急吃不了热汤圆。
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8、你可以很有个性，但某些时候请收 敛。
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9、只为成功找方法，不为失败找借口 (蹩脚 的工人 总是说 工具不 好)。
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10、只要下定决心克服恐惧，便几乎 能克服 任何恐 惧。因 为，请 记住， 除了在 脑海中 ，恐惧 无处藏 身。-- 戴尔． 卡耐基 。
实验四 氨基酸纸层析、折光率的测定共28页PPT
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27、只有把抱怨环境的心情，化为上进的力量，才是成功的保证。——罗曼·罗兰
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28、知之者不如好之者，好之者不如乐之者。——孔子
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29、勇猛、大胆和坚定的决心能够抵得上武器的精良。——达·芬奇
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Hale Waihona Puke 30、意志是一个强壮的盲人，倚靠在明眼的跛子肩上。——叔本华
谢谢！
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实验四 氨基酸纸层析、折光率的测定
41、俯仰终宇宙，不乐复何如。 42、夏日长抱饥，寒夜无被眠。 43、不戚戚于贫贱，不汲汲于富贵。 44、欲言无予和，挥杯劝孤影。 45、盛年不重来，一日难再晨。及时 当勉励 ，岁月 不待人 。
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26、要使整个人生都过得舒适、愉快，这是不可能的，因为人类必须具备一种能应付逆境的态度。——卢梭
实验六 纸层析法分离氨基酸.20页PPT
21、要知道对好事的称颂过于夸大，也会招来人们的反感轻蔑和嫉妒。——培根 22、业精于勤，荒于嬉；行成于思，毁于随。——韩愈
23、一切节省，归根到底都归结为时间的节省。——马克思 24、意志命运往往背道而驰，决心到最后会全部推倒。——莎士比亚
25、学习是劳动，是充满思想的劳动。——乌申斯基
1、不要轻言放弃，否则对不起自己。
2、要冒一次险!整个生命就是一场冒险。走得最远的人，常是愿意 去做，并愿意去冒险的人。“稳妥”之船，从未能从岸边走远。-戴尔．卡耐基。
梦 境
3、人生就像一杯没有加糖的咖啡，喝起来是苦涩的，回味起来却有 久久不会退去的余香。
实验六 纸层析法分离氨基酸. 4、守业的最好办法就是不断的发展。 5、当爱不能完美，我宁愿选择无悔，不管来生多么美丽，我不愿失 去今生对你的记忆，我不求天长地久的美景，我只要生生世世的轮 回
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显色
喷雾器均匀喷上茚三酮溶液，电吹风热风吹 干至看到AA彩色斑点。用铅笔将图谱上的 斑点圈出，测Rf相关值。
氨基酸的薄层层析
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五、注意事项
1. 为了防止滤纸被手上的汗液污染，应尽量在操 作时带手套。
2. 重复点样时可用吹风机的冷风吹干样品，喷 了茚三酮后的显色则要用热风吹干滤纸。
六、思考题
1、如何用纸层析法对氨基酸进行定性和定量的 测定？
四、操作步骤
如下页所示。
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氨基酸的薄层层析
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操作流程：
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点样
滤纸一边1.5厘米处划线，在线上等距离划6个点 毛细管吸样品（约2cm高）点样，直径小于0.5cm， 电吹风吹干，重复一次。干燥后将滤纸卷成圆形， 缝合滤纸，液放入培养皿中，将滤纸垂直放置在培 养皿中，盖紧缸盖。 层析纸2/3-3/4处取出滤纸， 电吹风吹干，划前沿线。
实验十二 氨基酸的薄层层析
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氨基酸的薄层层析
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一、实验目的
掌握氨基酸的薄层层析的方法和原理，学会分析未知样 品的氨基酸成分。
二、原理
滤纸层析是以滤纸为惰性支持物的分配层析，滤纸纤维上 的羟基具有亲水性，吸附一层水作为固定相，有机溶剂为流 动相。有机相流经固定相支持物时，与固定相之间连续抽提， 使物质在两相间不断分配而得到分离。溶质在滤纸上的移动 速度用Rf值表示：
原点到层析斑点中心的距离
Rf ＝ 原点到溶剂前沿的距离
物质结构、溶剂系统的物质组成等因素都会影响Rf值。
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氨基酸的薄层层析
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三、试剂和器材
1. 试剂 0.5%茚三酮溶液、标准氨基酸溶液 溶剂系统： 正丁醇－88％甲酸－水(15：3：2， V/V) 2. 器材 层析缸、毛细管、电吹风
2、纸层析和柱层析、薄层层析、高效液相层析
各有什么特点？
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氨基酸的薄层层析
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本文观看结束！！！
2020/8/14
氨基酸的薄层层析
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谢谢 欣 赏！
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氨基酸的薄层层析
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氨基酸的薄层层析
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