消减杂交技术

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抑制性消减杂交(SSH)技术及其应用

抑制性消减杂交技术
（ｕｐｅｓｏＳｐｒｓｉｎ
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一
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同，内侧序列与第二次ＰＲ引物序列相同。外，而Ｃ此在
［摘
要］制性消减杂交技术（Ｓ）抑ＳＨ是一种高效检测差异表达基因的方法。详细论述了抑制性消减杂交的基本原理及过程，
并简要介绍了其在工业生产菌种改良中的应用。［关键词］抑制性消减中８［文献标识码］Ａ［章编号］１０ — ０５２０）７０３－３文０３５９（０８０－０１０
５端接上去磷酸化的接头１接头２（ｄｐｏ，和ａａｔｒ１
等于１９依据消减杂交和抑制ＰＲ发展起来的９６年Ｃ
一
种分离差异表达基因的新方法［３该技术具有假，２
ａａｔｒ２。ｄｐｏ）两接头分别是具有一段反向末端重复序列的寡核苷酸序列，由一长链（４约０余个核苷酸）和
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抑制性消减杂交_SSH_技术及其应用

抑制性消减杂交技术（ＳｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎＳｕｂｔｒａｃｔｉｖｅＨｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ，ＳＳＨ）是Ｄｉａｔｃｈｅｎｋｏ等于１９９６年依据消减杂交和抑制ＰＣＲ发展起来的一种分离差异表达基因的新方法［１，２］，该技术具有假阳性率低、筛选效率高、操作简单等优点，特别适用于克隆分析造成某种特殊表型的目的基因及其功能。

而消减文库是使用两种遗传背景相同或大致相同但在个别功能或特性上不同的材料（如同类菌种的高产、低产品系），提取ｍＲＮＡ经反转录合成ｃＤＮＡ，在一定条件下用大大过量的不含目的基因的一方作为驱动子（Ｄｒｉｖｅｒ），与含有目的基因的试验方（Ｔｅｓｔｅｒ）进行杂交，选择性的去除两部分共同基因杂交形成的复合物，最后将含有相关目的基因的未杂交部分收集后，连接到载体形成文库。

高等真核生物的所有生命现象，例如细胞生长、器官形成、恶性转化、特定代谢产物分泌等都是基因选择性表达的结果，要弄清这些生命现象的分子调节机制，就要对选择性表达的基因进行分离、克隆、序列分析，然后研究其氨基酸组成，表达产物的结构功能。

抑制性消减杂交技术为寻找表达基因和研究已知基因的新生物学功能提供了一个有利工具。

１ＳＳＨ的基本原理与过程［３，４］１．１提取样本ｍＲＮＡ，利用随机引物反转录为双链ｃＤＮＡ，将不含目的基因的一方作为驱动子（Ｄｒｉｖｅｒ），含有目的基因的样品称为试验方（Ｔｅｓｔｅｒ）。

１．２用识别四碱基的限制性内切酶ＲｓａＩ（或ＨａｅⅢ）酶切。

双链ｃＤＮＡ经酶切后，每个片段一般小于６００ｂｐ，可防止长链ｃＤＮＡ片段所形成的复杂结构干扰消减杂交。

１．３将ｔｅｓｔｅｒｃＤＮＡ分成两组（１和２），分别于其５′端接上去磷酸化的接头１和接头２（ａｄａｐｔｏｒ１，ａｄａｐｔｏｒ２）。

两接头分别是具有一段反向末端重复序列的寡核苷酸序列，由一长链（约４０余个核苷酸）和一短链（约１０余个核苷酸）组成的双链ＤＮＡ片段，长链外侧２０余个核苷酸序列与第一次ＰＣＲ引物序列相同，而内侧序列与第二次ＰＣＲ引物序列相同。

抑制消减杂交(SSH)技术的研究与应用

维普资讯
ＨｉｎｊｎｎｍｌｃｎｅｅｏｇｉｇＡｉａＳｉｃｌａｅ
ａｄＶｅｅｉａｙＭｅｉｉｅｎｔｒｒｄｃｎｎ № ２２００８
近。由于ＶＰ在立体结构上与天然病毒相同或类Ｌｓ似，因此ＶＰＬｓ能激发体液免疫、细胞免疫和黏膜免疫，具有安全、高效的特点，是很有发展前景的候选疫苗。但是，目前ＶＰ主要通过基因工程手段从酵母Ｌｓ或感染重组杆状病毒的昆虫细胞中制备，这对操作者有较高的要求和较复杂的试验操作条件。３利用反向遗传操作技术制备的疫苗
随着人类基因组计划的完成及后基因组计划的启动，异基因表达就成了一项热门的技术。由于分差
工程疫苗及反向遗传疫苗并存应用的局面。
参考文献：
［］丁壮，１金宁一，王兴龙，鸡新城疫病毒Ｈ等．Ｎ基因亚单位疫苗
诱导免疫保护的试验研究［］Ｊ．动物医学进展，０２２（）２０，３１：
４ —５．９１
清学方法无法区别是疫苗株还是野毒株感染所致。因此通过改变免疫原蛋白的某些中和表位，构建一个能用合适的血清学方法鉴别的疫苗是十分必要的。ＰｅｅｅｔｓＢＰ等人通过反向遗传操作构建了ＮＶ感染ｒＤ
３１卵内免疫疫苗．
其表达外源基因，诱发对载体和表达基因的免疫。来葛金英等人利用反向遗传操作技术以ＮＶ的ＬＳｔＤａｏａ疫苗株为载体，入ＨＡＶ的ＨＮ插ＰＩ５１株ＨＡ基因．研

抑制性消减杂交技术的应用[1]

・技术与方法・生物技术通报B I O TECHNOLOGY BULL ET I N2009年第5期抑制性消减杂交技术的应用李小庆　景志忠(中国农业科学院兰州兽医研究所家畜疫病病原生物学国家重点实验室农业部兽医公共卫生重点实验室甘肃省动物寄生虫病重点实验室,兰州730046) 摘　要:　基因的差异表达是调控各种生命活动的核心分子机制,而分离、克隆并进一步研究差异表达基因已成为现代分子生物学研究的热点,也是功能基因组学研究的重要内容。

在研究差异表达基因的诸多项技术中,抑制性消减杂交(SSH )技术具有特异性强、假阳性率低、灵敏度高和快速简便等优点,被广泛地应用于生命科学和医学领域的基因差异表达的研究中。

近年来,抑制性消减杂交(SSH )技术得到了相应的改进和完善,而在许多研究领域,该技术在广度和深度上都有了一些新进展。

主要就抑制性消减杂交技术的产生背景、原理、技术流程、特点及其最新应用研究进展等方面作简要综述。

关键词:　抑制性消减杂交　差异表达　功能基因　DS N 均一化技术　c DNA 微阵列Suppressi on Subtracti ve Hybr i di zati on Techn i que andProgress i n the Appli cati onL i Xiaoqing Jing Zhizhong(Lanzhou Veterinary R esearch Institute CAAS,Key Laboratory of Ani m al Parasitology of Gansu P rovince,Key Laboratory of Veterinary PublicHealth of M inistry of Agriculture,S tate Key Laboratory of Veterinary E tiological B iology,Lanzhou 730046) Ab s trac t:　D ifferential exp ressi on of genes is the centralmolecular mechanis m of regulating all kinds of life acti ons 1Among all thetechnol ogies of identifying differential exp ressed genes,supp ressi on subtractive hybridizati on (SSH )is considered t o be with high s peci 2ficity,l ow backgr ound,high sensitivity,convenient mani pulati on,and had been widely app lied in life science and medicine research fields 1I n this paper,the p rinci p le,method,characteristics and the research p r ogress of SSH technique were intr oduced 1Key wo rd s:　Supp ressi on subtractive hybridizati on D ifferential exp ressi on Functi onal genes DS N (dup lex 2s pecific nuclease )2nor malizati on method c DNA m icr oarray收稿日期:2008211211基金项目:国家自然科学基金项目(30871884),国家高新技术“863”项目(2006AA10A203),甘肃省支撑计划项目(0804NKCA076)作者简介:李小庆(19832),男,硕士,专业方向:畜禽疫病的分子生物学与免疫学通讯作者:景志忠,博士,研究员,主要从事病原与宿主的分子生物学与免疫学研究;E 2mail:zhizhongj@yahoo 1com 1cn 上世纪90年代以来,随着分子生物学技术的快速发展以及多物种包括人类的基因组全序列测定计划的陆续完成,分子生物学的研究热点已经从结构基因组研究转向基因功能和表达调控的功能基因组研究,于是多种用于差异表达分析的基因克隆技术相继问世。

利用抑制消减杂交(SSH)技术筛选乙烯利诱导黄瓜茎尖雌性表达相关基因

利用抑制消减杂交（SSH）技术筛选乙烯利诱导黄瓜茎尖雌性表达相关基因黄瓜(Cucumis sativus L.)属葫芦科(Cucurbitaceae)中幼果带刺的栽培品种,以幼嫩的果实供食用,结果能力强,产量高。

应振士等(1990)认为黄瓜是研究植物性别决定和性别分化的好材料。

黄瓜为雌雄同株植物,性器官的败育发生在形态发生晚期,单性花的性别决定取决于植物个体的基因型与环境条件的相互作用。

影响黄瓜性别的基因中起主要作用的是m、F和A基因。

但不论作用多强,其表达也要受到其他基因和环境的影响。

黄瓜的性别决定对植物生长调节剂处理非常敏感,适宜的植物生长调节剂处理可使黄瓜的性别向不同的方向转化。

乙烯利(或乙烯)可使植株雌性化,乙烯的作用看来是明确而且关键性的,其作用位点是茎尖。

并且许多因素可以影响植物生长调节剂对性别的作用,如处理时的发育时期,植物生长调节剂处理的浓度和处理次数,环境因素(特别是温度和光周期)等。

虽然利用遗传分析已对黄瓜的性别决定遗传有一些了解,但有关性别基因作用的机理、细胞遗传以及植物激素(尤其是乙烯)是怎样参与调控性别决定过程等方面的研究尚少报道。

因此,要用分子生物学的方法分离出有关的基因,仍需大量的工作。

本研究以黄瓜雄性系品种D06103为试材,利用150 mg/L的乙烯利处理黄瓜两叶一心时期的茎尖,以处理组茎尖为Tester,对照组茎尖为Driver,利用抑制消减杂交(SSH)技术构建性别决定时期乙烯利处理的黄瓜茎尖cDNA文库,筛选乙烯利诱导黄瓜雌性表达相关基因,并对文库筛选出的11个基因进行了表达分析。

在此基础上利用电子克隆技术克隆出3个黄瓜雌性表达相关基因的cDNA全长,并分别对其组织特异性表达进行了研究。

试验结果如下：1.确立了外源激素乙烯利对黄瓜两叶一心时期的诱雌效果最佳的浓度为150 mg/L,并且不同浓度的乙烯利对黄瓜第一雌花节位影响不显著,但是对植株上雌花占总花数的百分比影响差异显著。

运用消减杂交技术构建IgA肾病肾阳虚证的相关基因文库

行纯化，化后产物用紫外分光光度计检测ｃＮ纯ＤＡ
纯度与浓度。１３２抑制性消减杂交．．参照Ｄａｈｎｏ方法建ｉｃｅｋｔ立抑制性消减杂交。按实验要求，同时进行正向及反向消减杂交。ＩＡ肾病肾阳虚组ｃＮｇＤＡ及对照组ｃＮＤＡ各被分为２份。正向消减：验方（ｅｔ实Ｔｓ —
证的相关基因。１资料与方法
ｇｎ公司。淋巴细胞分离液购于威佳公司。琼脂糖为ｅ西班牙出品，ｓＩ内切酶、４ＤＡ连接酶购自ＮＢＲａＴＮＥ
１１临床资料．
选择２００９年１０月～２１００年１月
公司。逆转录酶、ＯｌｓＲａｅｉｈｂｔ、ｉａｏＫＤｐｕ、ｎｓｎｉｉｒＬｇｔｎｏｉｈｇｉｈ购自ＴＹＢ公司。Ａｖｎａｅａｉ、ｄＯＯＯｄａｔ２ＴｑＭｘＡ－ｇ
Ｃｒｍｐｎ１０ｈｏａｓｉ一００纯化柱购自Ｃｏｔｈ公司。Ｈｔｌｅｎｃｏ．
ｍａｔｘ２５×）自Ｅｐｎｏ公司。ＨｔａｔａｓｒｅＭｉ（．购ｐｅｄｆｏｔｑｓｒＴ
基金项目：东省自然基金博士启动项目（４１５５１０７８）广９５０１Ｏ０２８。通讯作者， — ｉ：ｊ＠ｆｕＣＢＥｍａＫｚｉｌｍｍ．Ｏ
１ＣＲｕｆｒ２．ｌ１０ＸＰｂｆｅ５、０ｍｍｏｄＮＴＰｓ０．￣Ｉ５、０５

抑制消减杂交技术筛选肺炎链球菌多耐药相关DNA片段

消减混合物，ｐＡＳ－克隆载体连接并转化到ＴＰ０与ＥＹＴ３１感受态细胞中，构建多耐药肺炎链球菌差异ＤＮＡ消减文库。结果结论耐药株与敏感株问差异片段大量富集，到大小２００ｐ弥散状Ｄ得。～１５０ｂＮＡ条带；这些差异Ｄ将ＮＡ片
ｍｅｔｆＬｂｒｔｒｄｃｎ，ｓｈｎｓｉｌｙｌｔｏＳｃｕｎＵｉｅｓｔＣｅｇｕＳｃｕｎ６０４，ｉｏｒａｏａｏｙＭｅｉｉｅＷｅｔｉａＨｏｐｔｃａＡＪｉａｅｔｉａｎｖｒｉｉｄｈｙ，ｈｎｄ，ｉｈａ１０１
ｓｐｒｓｉｎｓｂｒｃｉｅｈｂｉｉｔｎ（ＳｕｐｅｓｕｔｔｙｒｚｉＳＨ）ａｄｗｅｅｌａｅｔＥＹＴｅｔｒｎａｓｒｄｔｏｅｅｔｏａｖｄａｏｎｒｇｔｗｉｐＡＳ－３ｖｃｏｄｔｎｆｍｅＯｃｍｐｔｎｉｄｈａｒｏ
ｉｔｈｌｃｌｒｍｅｈｎｓｏｌ — ｒｇｒｓｓａｔｓｒｐｏｏｃｓｐｅｍｏｉ．ＭｅｈｄＴｈｅｏｉＤＮＡｓｗｅｅｎｏｔｅｍｏｅｕａｃａｉｍｆｍｕｔｄｕｅｉｔｎｔｅｔｃｃｕｎｕｎａｉｔｏｓｅｇｎｍｃｒ
ｐｒｆｄｆｏＭＤＲ９６４７ａｄＡＴＣ４６９Ｔｈｉｔｒｆｓｂｒｃｅｕｉｅｒｍｉ００２０ｎＣ９１．ｅｍｘｕｅｏｕｔａｔｄＤＮＡｒｇｎｓｗｅｅｏｔｉｅｓｎｆａｍｅｔｒｂａｎｄｕｉｇ

抑制性消减杂交技术(SSH)及其在烟草生物学研究中的应用

科学研究表明，因的选择性差异表达决定植基物的生长、发育、衰老、死亡、对逆境的适应等生理过程。分离差异表达基因对于了解和揭示植物体的生长、发育规律，进而有针对性地对生物性状进行改良具有重要意义。近年来随着ＰＲ技术的兴Ｃ起，出现了许多基于ＰＲ的分离差别表达基因的新Ｃ
由于速度快、假阳性率低、灵敏度高等优点，现已广泛应用于植物学研究的各个领域【６】。烟草是我国
重要的经济作物之一，面积和总产量都居世界第
一
。
与此同时，它作为模式植物，在植物学的研究
领域具有重要的科研意义，尤其是在遗传、繁育、
生理、生化和转基因等研究领域。笔者就ＳＨ技术Ｓ
Ｒｅｅｃｓａｒｈ
ＬＩＬｉｎ．ｑｉＬＵｍｉＬｉｎｇ
（ｒｎｍｙＣｌｇｆｉｈａｒｕｔｒｌｎｖｒｔ，ａａ，ｉｕ２０４ＣｉａＡｇｏｏｏｌｅｃｕｎｉｌａＵｉｅｓｙＹ ’ Ｓｃａ６５１，ｈｎ）ｅｏＳＡｇｃｕｉｎｈｎＡｂｔａｔＡｎｗｍｅｏ，ｅｍｅｐｒｓｉｎｓｂｒｃｉｅｙｒｉｔｎ（Ｓ，ａｅｎｄｖｌｐｄｂｓｄｐｍａｌｎｔｅｅｈｉｕｓｒｃ：ｅｔｄｔｒｄｓｐｅｓｔｔｂｄｚｉＳＨ）ｈｓｅｅｅｏｅａｅｒｒｙｏｃｎｑｅｈｕｏｕａｖｈｉａｏｂｉｉｈｔ
ＤＩ０９９．ｓ．０—１９０１３１Ｏ：１．６￣ｉｎ０７５１．１．．９３ｓ１２００

应用抑制性消减杂交技术克隆大鼠肝再生过程中特异表达基因

中图分类号：５ｑ９３文献标识码：Ａ文章编号：２３９７（０２００５００５ — ７２２０）２１２３
ＣｌｎｎｇＤｉｆｒｎｔａｌｐｅｓｄＧｅｅｙＳｐｐｅｓｏｏｉｆｅｅｉｌｙＥｘｒｓｅｎｓｂｕｒｓｉｎＳｂｒｃｉｅＨｙｒｄｚｔ０ｎＲａｖｒＲｅｅｅａｉｎｕｔａｔｖｂｉｉａｉｎｉｔＬｉｅｇｎｒｔｏ
ｓｑｕｎｅＧｅｅｅｃｓ（ｎＢａｋａｃｓｉｍｂ：４４４９ｎｃｅｓｏｎｎｕｅｒＢＧ７０￣４４４）７９６
Ｋｅｏｄ：ｕｐｅｓｏｕｔａｔｅｈｂｉｉａｏｓｂｒｃｅｉｒｒｐｒｉｌｅａｅｔｍｙｌｅｅｅｅａｉｎ；ｏｌｙｗｒｓｓｐｒｓｉｎｓｂｒｃｉｙｒｄｚｔｎ；ｕｌａｌｄｌａｙ；ａｔｐｔｃｏｖｉｂａｈ￣ｉｒｇｎｒｔｏｈｍｏｏｖｒ
３．Ｈｅ￣ｎＫｅｌａｏｙ＊ｙＬａｍｒｔｒｒＴｕｒＰａｈｌｇ．ｅｇｚｍ５０２．ｉａｍｏｔｏｏｙＺｈｎｈｔ４０５（ｎ）
Ａｂｔａｔ：ｓｒｃＦｈｅｅＤＮＡｒｍａｅｎｒｔｎｇｌｖｒｔｓｕｆｏｒｔｒｇｅｅａｉｉｅｉｓｅｗａｓｕｓｄａｈｅｌｓｅｎｈｒｍｒａｉｅ；ｓｕｓｄａｅｓｔｅｌｒａｄｔａｔｆｏｎｏｍｌｌｖｒｖａｅｓｔｉｒｈｅｄｒｖｅＡｈｉｈｌｅｆｃｅｔｕｒｃｉｅＤＮＡｌａｙ … ｇｙｆｉｉｎｓｂｔａｔｖｅｉｒｂｒｃｓｔｕｅｂｙｕｐｐｅｓｏｎｕｂｔａｔｖｈｙｈｉｚｆｏｏｎｒｃｔｄｓｒｓｉｓｒｃｉｅｒｄｉａｎｉ

消减杂交基因克隆技术研究进展

#综述#消减杂交基因克隆技术研究进展邵勇综述姚珍薇审校=摘要>基因克隆技术是研究生命过程分子机制的基础,消减杂交基因克隆技术的应用,使一些多基因遗传病相关致病基因的筛查和定位有所突破。

本文综述近年消减杂交2基因克隆技术研究进展,包括差示反转录PCR、差异消减杂交、代表性差异分析、S1富集法、抑制性消减杂交、基因组错配扫描、比较基因组杂交及DNA微阵列杂交系统等。

=关键词>基因克隆;消减杂交;遗传病Resear ch about subtr action hybridiza tion gene clone S H AO Y ong,YAO Zhen2wei.The F i rst Af f ilia2ted H ospita l,Chongqing Univer sity of Med ica l Sciences,Chonqqing400016,ChinaAbstr act:The technique of gene clone is ver y useful to explor e the molecular mechanism of life.Byusing technique of subt raction hybr idizat ion gene clone,gr eat pr ogress in scr eening and orientating forsome multigenic disease realated gene was made.This article investigate the progr ess of subt raction hy2br idization gene clone,include differ entia l display r everse tr anscreptia l P CR,differ ent ial subtractiondispla y,r epr esentational differ ence ana lysis,S1enr ichment,suppr ession SH,genom ic mismat ch scan2ning,comparative genome hybr idizat ion,and DNA micr oar rays.Key words:Gene clone;Subtr action hybr idization;Inherit disease人类基因组计划拟将人类数万个基因定位并克隆,是一项庞大而艰巨的任务。

抑制性消减杂交技术介绍

10
A B C
D
•
实验流程
由RNA合成 cDNA A B C D 第一次消减杂交
Rsa I 酶切
cDNA 末端接头连接
E E
第二次消减杂交加入共用PCR引物末端补齐 A, D: 不能被扩增第一次PCR扩增第二次PCR扩增富集差异表达基因
•
C: 线性扩增 B: 扩增受到抑制
EE
5’ 3’
3’ 5’
•
Tester杂交液（Adaptor 2R） A B C D
Driver cDNA （加热变性）
Rsa I 酶切
cDNA 末端接头连接
E
实验流程
由RNA合成 cDNA
Rsa I 酶切
A, B, C, D cDNA 末端接头连接
E
末端补齐第一次消减杂交第二次消减杂交末端补齐第一次PCR扩增第二次PCR扩增 E E 富集差异表达基因
Driver cDNA （过量）
Tester cDNA with Adaptor 2R
A B C D
A
B
C D
•
实验流程
由RNA合成 cDNA Tester杂交液（Adaptor 1） A B C 第一次消减杂交 D 第二次消减杂交末端补齐第一次PCR扩增第二次PCR扩增富集差异表达基因 A, B, C, D
抑制性消减杂交
主要内容
1 2 3 抑制性差减杂交技术概述
抑制性差减杂交原理抑制性差减杂交流程
•
抑制差减杂交技术SSH
抑制差减杂交（SSH）SSH是一种基于抑制PCR和差减杂交技术建立的,在转录水平上研究基因表达的技术。
•
抑制性消减杂交—原理

抑制性消减杂交技术及其应用研究进展

ｉｎｔｆｉｎｘｐｅｓｏｎｄｆｅｅｃ．ｄｅｉｙｎｇｇｅｅｅｒｓｉｉｆｒｎｅＴｈｅｐｒｎｉｌｎｄｕｅｏｉｃｐｅａｓｆＳＳＨｔｃｅｈｎｉｕｎｔｓｃｓｏｑｅｉｈｅａｐｅｔｆ
ｍｅｈｎｉｍｆｄｖｌｐｍｅｔｒｌｔｄｇｅｅｕｌｔｏｍｏｅｕｅｍｅｈａｉｍｉｅｓｍｅｈｎｉｍｆｃａｓｏｅｅｏｎ — ｅａｅｎｅｒｇａｉｎ，ｌｃｌｃｎｓｏｆｄｓａｅ，ｃａｓｏ
ｆｒｎｔａｅｘｐｅｓｏｎｔｏｄｆｅｅｔａｏｄｉｉｎｓ，ａｉｎｉｐｏｔｎｔｒｌｎｃｏｎｎｅｅｉｌｇｎｅｅｒｓｉｎｉｗｉｆｒｎｉｌｃｎｔｏｐｌｙｎｇａｍｒａｏｅｉｌｎｉｇａｄ
ｄｒｇａｔｏｓｌｃｉｎｏｉｒｅｎｎｉｏｎｅａｐｌｕｔｎｔｂｏｇｒｄｔｏｒｎａｙｅｎｕｃｉｎ，ｅｅｔｏｆｆｎｅｂｅｄａｄｅｖｒｍｎｔｌｏｌａｉｄｅａａｉｎｗｅｅａｌｚｄｉ
ｔｓｒｖｉｗ．ｈｉｅｅ
Ｋｅｙｗｏｒｓｉａｉｎ（ｐｐｅｓｏｕｂｒｃｉｅｈｂｒｄｚｔｏＳＳＨ）；ＳｕｐｒｓｉｐｅｓｏｎＰＣＲ；Ｍｏｅｕａｏｏｌｃｌｒｂｉｌｇｙ
ｔｏｉｆｒｎｉｌｅｐｒｓｅｎｅｔｔａｃｉｔｏａｅｅ，ｉｈｉｓｄｏｈｅｕｓｕｒｃｉｅｉｎｄｆｅｅｔａｘｅｓｄｇｅｓａｒｎｓｒｐｉｎｌｌｖｌｗｈｃｓｂａｅｎｔｅｏｆｓｂｔａｔｖｈｙｉｉａｉｎｃｍｂｉａｉｎｗｉｈｓｐｒｓｉｎＰＣＲ．Ｂｅａｓｆｉｓｃｒｔｒｓｉｓｏｇｐｅｉｉｂｒｄｚｔｏｎｉｏｎｔｏｔｕｐｅｓｏｃｕｅｏｔｈａａｃｅｉｔｃｆｈｉｈｓｃｆ— ｃｔｌｗａｓｏｓｔｖｅｒｔ，ｉｐｅｏｐｒｔｏｎｄｈｉｈｅｆｃｅｃＳＳＨｓｗｉｌｅｏｓｕｄｉ— ｉｙ，ｏｆｌｅｐｉｉａｅｓｍｌｅａｉｎａｇｆｉｉｎｙ，ｉｄｅｙｕｓｄｔｔｙｄｆ

抑制消减杂交技术(SSH)及其在植物基因克隆上的应用

述：
关键词：ＳＳＨ技术；差异表达；ＰＲＣ中图分类号：７５Ｑ８文献标识码：Ｂ
分子生物学研究表明，物的生长、育、老和死生发衰亡，织和细胞间的分化，组凋亡及变异都是与基因的选择性差异表达有关，基因在时间和空间上的有序表达贯即穿和调控了个体的整个生命发育过程。因此，离并克分隆差异表达基因不仅有助于阐明生命的奥秘，且还为而生物的改良、因诊断与治疗提供重要的理论依据。近基年来，ＰＲ技术的基础上，继提出了多种分离克隆在Ｃ相差异表达基因的技术，９２年Ｈａｇ和Ｐｒｅ１９ｎａｄｅ等 … 首次提出的差异显示技术（ＲｉｅｅｔｉｌｅｅｓｍＮＡｄｆｒｎｉｄｓａｒｖｒｆｌａｐｙｅｔｎｃｉｔｎＰＲ）１９年ＨｌｒｒｓｒｉＣ；９４ａｐｏＬａｋ等Ｌ提出的ＩＤｂ２』（ｅｅｅｔｔｎｄｆｒｎｅａａｓｒｐｓｎａｉａｏｌｉｅｃｎｌｉｅｙｓ）技术；１９年９６Ｄａｃｅｋｌ等Ｌｉａｈｎｏｔ３提出的ＳＨ（ｕｐｅｓｎｕｔｅｖＳｓｐｒｓｉｓｂｒｔｅｏａｉｈｂｉｚｔｎｖｒａｉ）技术及１９年Ｊｓ等』提出的ＤＤｄｏ９８ｏｈＳ（ｉｃｅｆｌｕｔｃｉｉｌ）术等，中ｍＮ差异显ｄｆｒｎａｓｂｒｔｎｄｓａ技ｉａｏｐｙ其ＲＡ示技术已在筛选差异表达基因方面得到了广泛使用，后三者应用还不多，别是ＳＨ技术的应用主要集中在肿特Ｓ瘤基因的克隆方面，植物研究领域较少。郭新红【等在５Ｊ利用ｓＨ技术对渗透胁迫诱导的梭梭幼茁差异表达基Ｓ因片段进行了分离和克隆，取得了成功。本文就ＳＨ并Ｓ技术及其应用作一介绍。１ＳＨ技术的主要原理和基本过程ＳＳＨ技术主要原理是以抑制ＰＲ为基础的ｅＮＳＣＤＡ消减杂交。所谓抑制ＰＲ是利用非目标序列片段两端的Ｃ长方向重复序列在退火时产生类似发卡的互补结构，无法作为模板与引物配对，择性地抑制了非目的基因片选段的扩增。在经济消减杂交后，据复性动力学原理，根浓度高的单链ｅＮＤＡ分子迅速复性，度低的单链ｅＮ浓ＤＡ分子仍以单链形式存在，得杂交后不仅目的基因间的丰使度差异基本消除，且富集了差异表达基因。而其基本过程是：提两种不同细胞（ｅｔ和ｄｖｒ抽Ｔｓｒｅｉｒｅ）的总ｍＲＡ逆转录转成ｃＮ用Ｒａ或ＨｅⅢ 限制酶切ＮＤＡ，ｓｌａ割为小片段。将ｔｔｒＤＡ分为两份，别连接不同的ｅｅＮｓｅ分

抑制消减杂交的原理及应用

人类染色体端粒DNA的荧光原位杂交
甘肃省肿瘤医院
抑制消减杂交的实验过程
1.探针的制备
探针是一段标记核酸序列，可与靶序列互补形成杂交双链，通过检测杂交链信号即可对靶序列DNA的存在及其分子大小加以鉴别.
探针可以是克隆的，也可以是合成的。用PCR扩增产物可制备探针。也可用提纯的质粒进行标记制备探针
PCR-TOPO 载体(T载体的一种)
甘肃省肿瘤医院
抑制消减杂交的实验过程
※ TA克隆构建原理：
TA克隆系统由Invitrogen公司发展而来的商业性试剂盒，它用于PCR产物的克隆和测序。其原理是利用Taq酶能够在PCR产物的3’末端加上一个非模板依赖的A，而T载体是一种带有3’T突出端的载体，在连接酶作用下，可以快速地、一步到位地把PCR产物直接插入到质粒载体的多克隆位点（MCS）中。
大肠杆菌
甘肃省肿瘤医院
抑制消减杂交的实验过程
蓝白斑筛选示意图
甘肃省肿瘤医院
抑制消减杂交的实验过程
分子杂交
定义：确定单链核酸碱基序列的技术。其基本原理是待测单链核酸与已知序列的单链核酸（叫做探针）间通过碱基配对形成可检出的双螺旋片段。这种技术可在DNA 与DNA，RNA与RNA，或 DNA与RNA之间进行，形成 DNA-DNA，RNA-RNA或 RNA-DNA等不同类型的杂交分子。
PCR反应:杂交产物中两端连有不同接头的片段就是所寻找的差异表
达基因。经补平末端后进行巢式PCR扩增以获得所需要的差异表达基因。
甘肃省肿瘤医院
抑制消减杂交的实验过程消减的克隆:经巢式PCR扩增得到所需要的差异表达基因后，利用TA克隆法将差异表达基因转化感受态大肠杆菌，根据蓝白斑筛选原理，筛选出转化成功的阳性菌落。最后根据插入片段的两端接头引物进行巢式PCR反应对插入片段进行特异性扩增。

抑制性消减杂交技术在肿瘤相关基因克隆中的应用及发展

接。链外侧序列（２ｔ与第一次ＰＲ引物序列相同，长约Ｏｎ）Ｃ而内侧序列与第二次ＰＲ引物序列相同。此外，头上含有Ｃ接Ｔ７启动子序列及内切酶识别位点，以后连接克隆载体和为
育过程中只有ｌ的基因得以表达，这大约４０５而５０个基因
１ＳＨ的原理和基本过程Ｓ
ＳＨ是以抑制性ＰＳＣＲ为基础，标准化检测体ｅ将ＤＮＡ
的表达是按时间和空间顺序有序地进行着，种表达方式即这为基因的差别表达。取差异表达的基因将有助于了解正常获生理变化和病理改变的分子机制，基因诊断、因治疗等为基
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壅医科大学学报
２００２年９月第３卷６
第３期
３３５
文章编号：０Ｏ２３（０２０一Ｏ３一ｏｌ０一２５２０）３３５３
抑制性消减杂交技术在肿瘤相关基因克隆中的应用及发展
提供新的视野。因此人们建立了一系列差异基因克隆技术。如消减杂交（ｕｔａｔｅｈｂｉｉｔｎ、ｓｂｒｃｉｙｒｚｉ）ｍＲＮＡ差异显示法ｖｄａｏ
单链步骤和消减杂交步骤相结合的一种更简单、快速的分更离差异基因的方法。抑制性ＰＲ是利用链内退火优于链间Ｃ退火的特点，非目的序列片段两端反向重复序列在退火时使产生类似发卡的互补结构．法作为模板与引物配对从而选无择性地抑制了非目的基因片段的扩增，标准化步骤均等了而检测体中的ｅＮＡ单链丰度．减杂交步骤去除了检测体和Ｄ消

抑制性消减杂交技术在动物疫病防控中的应用

动物医学进展。００３（）１４１７２１，１５：１ —１
ＰｒｇｒｓｎＶｅｅｉｒｅｃｎｏｅｓｉｔｒｎａｙＭｄｉｉｅ
抑制性消减杂交技术在动物疫病防控中的应用
马清霞，相华，守媛，周刘赵娟，玉乾何
时期的基因表达按照时间和空间顺序有序地进行，
收稿日期：０９０－１２０ — ９２
直接或间接关系到疾病的发生和易感性。筛选和鉴
作者简介：青霞（９８）女，南淇县人，医师，要从事动物疫病的快速诊断和综合防控工作。马１７一，河兽主
４０ — ４１．４７４４
ｔａａｉｒｔＳ，ＣｈｅｍａｏｅｓｎＳ，ＣａｔｒＲ．Ｌｎａｅｇｏｐｓ — ｒｅｉｋｇｒｕｅ［３Ｐａｔｒｄｌｋａ１］
ｌｃｉｎ：ｔｗａｄｄｎｉｉｇｇｎｅｏｔｏｌｇｓｒｉｓｅｉｉｅｔｏｏｒｓｉｅｔｆｎｅｓｃｎｒｌｎｔａｎｐｃｆｙｉｃ
中图分类号：８１３￥５．文献标识码：Ｂ文章编号：０７５３（０００ — １４０１０ — ０８２１）５０１ —４
在高等生物个体发育中，同组织细胞在不同不
称之为基因的差异表达；些异常表达的基因可能那
用于寻找差异基因的研究。为筛选与病原体致病相关基因，了解病原体与感染细胞之间的分子响应机制，从

消减实验步骤

抑制性削减杂交PCR削减杂交是一强有力的使研究人员能够比较两种mRNA群和获得仅在一mRNA群表达而在另一mRNA群没有表达克隆的强有力的技术。

虽然有几种不同的方法，但削减杂交背后的基本理论却非常简单。

首先，两组mRNA均转化为cDNA：我们将含有特异(差异表达的)转录物称为“tester”,对照cDNA称为“driver”。

Tester和Driver cDNA进行杂交，接着去除杂交序列。

结果，保留的未杂交的cDNA就代表了那些仅在tester组表达，而在driver组不表达的mRNA。

虽然传统的减法杂交方法在某些研究中已成功运用，但要求几轮的杂交且也不适合鉴定稀有信息。

CLONTECH PCR-Select™ cDNA削减杂交是唯一克服了传统减法杂交的这些缺点的方法。

图1表示PCR-Select过程的简短回顾。

本方法的几个特点使其具有高效和可重复性。

方法仅要求0.5--2μg polyA+ RNA，花3—4天时间，也不用分离ss和ds分子。

而且，抑制性PCR预防了不需要的扩增而使目标分子得到富集。

图2详细地描述了发生在PCR-Select cDNA消减杂交分子事件。

首先，cDNA从0.5--2μg 的polyA+ RNA合成。

Tester和driver cDNA以RsaⅠ酶切，该酶为一四碱基限制性内切酶，产生平末端。

Tester cDNA接着分成两部分，每一部分连一不同的cDNA adaptor。

Adaptor 的末端无磷酸基团，因此仅有adaptor的一链与cDNA 5’末端相连。

两adaptor具有不同的序列，这样当残留末端被补平后就能够同两个不同的PCR引物退火(Appendix B)。

接着进行两轮杂交。

首先，过量的driver cDNA 加入到每一tester样品，然后热变性和退火，在每一样品产生a、b、c和d分子(图2)。

由于杂交二级动力学的原因，高丰度分子退火快，因此高和低丰度序列在a型分子中的浓度趋于均衡。

抑制消减杂交技术在植物病害研究中的应用

ＳＨ技术操作分５个步骤见图１（）离Ｓ。１分两组相关样品的ｍＲＮＡ（别作为Ｔｓｅ分ｅｔｒ和Ｄｒｅ）反转录为ｃｉｒ，ｖＤＮＡ；２用限制性内切酶分（）别消化Ｔｅｔｒ和Ｄｉｅ，其形成长度小于ｓｅｒｒ使ｖ５０ｂ的ｃ０ｐＤＮＡ片段；３将ＴｅｔｒＤ（）ｓｅＮＡ分成２ｃ
黑龙江农业科学２１（１：３～ห้องสมุดไป่ตู้１８０１１）１６３
ＨｅｌｎｊｎｒｃｌｕａＳｉｎｅｉｇｉｇＡｇｉｕｔｒｌｃｅｃｓｏａ
抑制消减杂交技术在植物病害研究中的应用
王芳
（黑龙江省农业科学院齐齐哈尔分院，黑龙江齐齐哈尔１１０）６０６
处于起步阶段。目前，技术主要应用在植物生该长发育过程中组织器官的分化及特异性表达、病原物的诱导表达、环境胁迫（分胁迫、水温度胁迫、
盐胁迫）同一个体不同组织内的基因表达差异、、
点的突变或重复，都不能使用该技术【。Ｊ
退火的特点，两端接有同一接头的非目的序列使
片段在退火时产生类似于“ 柄 ” 锅一的结构，在后续的ＰＲ中无法与引物配对，Ｃ从而选择性地扩增目
２ＳＨ技术的基本步骤Ｓ
检测的问题；３效率高，期短：次Ｓｔ（）周一Ｓｔ反应在几天内便可同时分离几十甚至上百个差异表达

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消减杂交技术
通过对《干旱胁迫下黄檗幼苗c DNA消减文库的构建和分析》的试验的介绍，说明消减杂交技术的原理，以及技术流程。

试验摘要
以干旱胁迫下的黄檗幼苗cDNA 为tester, 正常生长的黄檗幼苗cDNA为driver, 利用抑制性消减杂交技术(suppression subtractive hybridization, SSH)构建了干旱胁迫下黄檗幼苗的消减文库并对其进行了EST序列分析。

从消减文库中随机挑取20个阳性克隆, 提取质粒进行酶切和PCR鉴定, 显示文库克隆的重组率大
于95%, 插入片段大小大部分集中在300~800bp之间。

随机挑取816个克隆进行测序, 得到265个基因。

将其进行同源性分析, 划分为16类。

获得了热激蛋白70、脱水响应蛋白(RD22)、通用胁迫蛋白、金属硫蛋白(MTII), 晚期胚胎丰富蛋白(LEA14)等44种与干旱胁迫相关的基因,它们涉及了植物的渗透调节、信号传递、转录调控、活性氧清除等方面。

本研究为抗逆基因克隆和系统研究干旱胁迫下黄檗基因的表达奠定了重要的理论基础。

黄檗
(黄檗Phellodendron amuranse Rupr.) 又名关黄柏、黄波罗, 为芸香科黄檗属, 是第三纪古热带区系的孑遗植物。

是东北重要的珍贵阔叶树种。

从生活史看, 黄檗经历了从第三纪炎热到寒冷等一系列的气候变迁, 对自然界的非生物胁迫(如高温、干旱、寒冷)有很强的适应力。

材料与方法
• 1.1 实验材料
•黄檗种子采于牡丹江市, 用70%乙醇对种子表面除菌后, 4℃低温层积2个月, 播种在珍珠岩中, 25~30℃光照培养箱培养。

大约生长60 d左右对黄檗幼苗进行胁迫处理, 减小加水量使其相对水含量达到65%~70%(约6~7
d), 未处理的作为对照。

处理后, 取幼苗叶片和茎干置于液氮中速冻, −
70℃保存。

1.2实验方法
• 1.2.1 总RNA提取和mRNA纯化
•以干旱处理的黄檗幼苗为实验组, 未处理的为对照组。

取叶片和茎干, 液氮研磨后, 以总RNA 提取试剂盒Trizol(Invitrogen)的方法提取总RNA, 以Qiagen公司的Oligotex mRNA kit分离纯化mRNA。

将提取得到的总RNA和mRNA溶于一定体积的无RNase的水中。

用GeneQuantII
(Pharmacia Biotech)检测RNA质量和浓度。

• 1.2.2 cDNA消减文库的构建
•分别以干旱处理的实验组cDNA为tester, 未处理的对照组的cDNA 为driver。

进行抑制性消减杂交, 具体操作依照Clontech PCR-Select
cDNA Sub-traction Kit User Manual进行。

将第二次PCR扩增后的正向消减产物用PCR Purification kit (Promega)纯化后, 与pGEM-T载体
(Promega)连接, 4℃过夜。

用化学转化法转化感受态细胞
TOP10(Tiangen), 根据蓝白斑检测文库克隆的重组率, 筛选出有插入片段的阳性克隆。

• 1.2.3 插入片段的PCR和酶切鉴定
•随机挑取20个阳性克隆, 接种于LB液体培养基中, 37℃培养过夜, 然后提
取质粒DNA, 用pGEM-T载体两端测序引物T7、SP6作为PCR引物, 对插入片段进行PCR扩增, 通过琼脂糖凝胶电泳检测其插入片段长度。

利用载体插入片段两端分别有Nco I和Pst I酶切位点, 用Nco I和Pst I对提取的质粒进行酶切, 可以验证阳性克隆和插入片段的大小。

• 1.2.4 文库的测序与分析
•随机挑选阳性克隆, 用碱裂解法提取质粒, 送北京华大生物公司测序, 测序结果在GenBank (http: ///blast) 进行同源
性比对,确认为新序列后,将序列通过Sequin软件提交给Genbank的
dbEST数据库。

•通过直系同源簇数据库(Clusters of Orthologous Groups of proteins, COGs), 把EST序列的编码蛋白质与所有COGs中的蛋白质进行比对, 以预测单个蛋白质的功能和整个新基因组中蛋白质的功能。

用Blastp
(Blastx)对测序结果进行分析并
归类(参数E-value: 1e-5)根据
系统进化关系把它们归入适当
的COG家族。

结果
• 2.1 PCR扩增产物结果分析
消减杂交后先用外侧共有引物进行第一次PCR扩增, 然后利用巢式引物进行第二次PCR扩增。

电泳结果(图1)显示, 第一次PCR扩增后的电泳带很弱, 第二次PCR扩增后出现明显电泳带, 片段大部分集中在0.2 kb~1 kb之间, 在600 bp
左右有明显条带, 这说明消减基因得到了富集, 黄檗干旱诱导基因得到了很好的均一化和差减。

主要包括干旱信号的感应, 信号转导, 进而引起转录因子以及功能性基因的表达。

植物主要通过气孔关闭、渗透性物质积累、活性氧清除以及对膜和蛋白结构的保护等一系列反应作为对干旱的耐受响应[10,11]。

本研究所得的265个EST序列涉及到黄檗对干旱胁迫响应机制的各个方面, 其中防卫机制相关的基因占到总数的16.6%, 表明黄檗在干旱的条件下通过表达相关的抗旱基因以响应外界的逆境信号。

其中有66个比对不出较为明确的结果为功能未知基因, 这些基因的表达是否是黄檗对干旱胁迫的反应还需要进一步研究。

迄今为止, 已在植物中发现了几百种胁迫诱导基因, 在功能已确定的基因之中, 除了防卫功能基因外, 很大部分可归类为代谢基因和调控基因, 如蛋白激酶和转录因子[12]。

转录因子可以通过调节下游干旱胁迫相关基因的表达, 目前为止, 已有很多利用转录激活因子或抑制因子来提高植物抗旱性的报道[13]。

文库中涉及到如锌脂蛋白(Zinc-finger pro-tein)、WRKY转录因子(WRKY DNA-binding protein)等, 这为用基因工程手段利用编码转录因子和信号因子研究植物抗旱提供了新的基因和研究思路。

•综上所述, 利用SSH技术构建黄檗幼苗在干旱胁迫下差异表达基因文库, 并通过EST技术研究干旱胁迫过程中所有干旱相关基因的表达情况, 从总
体上阐述植物抗旱机制已成为可行性的方法。

抗旱基因的研究不仅仅是干
旱信号的识别和抗旱基因的开启, 更涉及到抗旱过程中一系列基因的表
达和干旱信号的传导和级联反应, 这将在基因水平上有助于我们对抗旱
机制的深入理解，且有了深入的了解了消减杂交技术。