高效液相色谱分析PPT课件
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2、避免流动相与固定相发生作用而使柱效下降或 损坏柱子。如使固定液溶解流失；酸性溶剂破坏 氧化铝固定相等。
16
3、试样在流动相中应有适宜的溶解度，防止 产生沉淀并在柱中沉积。
4、流动相同时还应满足检测器的要求。当使用 紫外检测器时，流动相不应有紫外吸收。
17
（四）检测器
（一）、紫外检测器—应用最广泛的检测器
（三）、荧光检测器—专用型检测器
基本原理：在一定的条件下，荧光强度与流动相中 的组分的浓度成之比。
对多环芳烃，维生素B、黄曲霉素、卟啉类化合物、 农药、药物、氨基酸、甾类化合物等有响应。
22
特点：
高灵敏度； 高选择性； 可用于梯度洗脱。
23
定性与定量
（一）样品预处理 1.固体样品 固体样品首先要进行均质化，然后再采用如蒸馏、超临 界萃取或超声波萃取等技术进行样品制备。 2.液体样品
4
（二）柱效能
色谱柱在色谱分离中由动力学因素所决定的柱效能，通常 用塔板高度或塔板数表示。
塔板数：
n
5.54
tR Y1
2
2
16 tR W
2
涡流扩散相
分子扩散相
塔板高度：
H A B Cu u
流动相线速度
传质阻力相
5
（三）分离度R 分离度的表达式：
R 2(tR(2) tR(1) ) Wb(2) Wb(1)
8
（二） 高压输液系统（高压泵）
高压输液泵是核心部件，要求：密封性好，输出流量恒定， 压力平稳，可调范围宽，便于迅速更换溶剂及耐腐蚀等。
高压泵主要有恒流泵（往复泵）和恒压泵（气动泵）两种。
➢ 恒流泵特点 输出流量保持恒定而与色谱柱引起阻力变化无 关。分为机械注射泵和机械往复泵(常用)两种。
➢ 恒压泵特点 能保持输出压力恒定，但其流量则随色谱系统 阻力而变化，故保留时间的重视性差。
高效液相色谱分析
基本概念与特点
◆ 概念：高效液相色谱法(HPLC)是在20世纪60年代末，以经 典液相色谱为基础，引入了气相色谱的理论，在技术上采 用了高效固定相、高压输液系统和高灵敏度的在线检测器， 从而发展起来的一种新型分离分析技术。随着科学和技术 的不断改进与发展，目前已成为应用极为重要、广泛的分 离分析手段.
可以选择非极性或亚极性固定相。 ➢ 若样品溶于极性温和溶剂中，如醇类，则可选择极性固
定相，也可以选择非极性固定相。
13
4.流动相
液相色谱的流动相又称为淋洗液，洗脱剂。 流动相组成、极性改变，可显著改变组分分离状况， 改变流动相的组成和极性（组成比例）是提高分离 度的有效手段。
常用溶剂： 环己烷、己烷、四氯化碳、甲苯、乙酸 乙酯、甲醇 、乙腈、水等。
◆ 特点：分离效率高、分析速度快、应用范围广、操作自动 化。
2
液相色谱流程与原理
◆ 基本原理：混合组分的样品在色谱柱中，各组分由于在流 动相和固定相之间溶解、吸附、渗透或离子交换等作用力 的不同，随流动相在色谱柱中运行时，在两相间进行反复 多次分配过程，使得原来分配系数具有微小区别的各组分 ，产生了保留能力明显差异的效果，进而各组分在柱中的 移动速度不同，经过一定长度的色谱柱，彼此分离开来， 最后按一定顺序流出。
基本原理：试样组分对特定波长的紫外光具有选择 性的吸收，吸光百度文库与试样组分浓度之间的定量关系 符合郎伯-比耳定律。
优点：
灵敏度高，线形范围宽； 缺点：
死体积小；
无紫外-可见吸收组分不响应；
波长可选；
流动相选择受一定限制。
对流速和温度变化不 敏感；
可用于梯度洗脱。
18
(a) 可变波长紫外检测器 (b) 二极管阵列检测器
11
2.色谱柱
柱体为直型不锈钢管，标准内经为4.6或3.9 mm，柱长15～30 cm，填料 颗粒粒度5－10μm。发展趋势是减小填料粒度(3－5μm)和柱经以提高 柱效。
为保护色谱柱， 通常在柱前加一支填料与色谱柱相同的保护柱。
12
3.固定相
选择固定相的一般标准还是以“相似相容”原理为基础。 ➢ 如果溶质溶于烃类溶剂，表明是低极性化合物，这样就
19
（二）、示差折光检测器—通用型检测器 每种物质具有不同的折光指数。
基本原理：连续检测参比池和样品池中流动相之间 的折光系数差值，该值与试样池流动相中的组分浓 度成正比。
生命科学中各类糖类化合物，没有紫外吸收， 一般要用示差折光检测器。
20
缺点：
灵敏度低； 对温度敏感； 不能用于梯度洗脱。
21
14
固定相极性>流动相极性
正相液相色谱 （正相柱）
组分极性越大，保留 时间越长；使用极性 化合物的分离。
固定相极性<流动相极性
反相液相色谱 （反相柱）
组分极性越小，保留 时间越长；适用非极 性化合物的分离。
15
选择流动相时应注意的问题
1、尽量使用高纯度试剂作流动相，防止微量杂质 长期累积损坏色谱柱和使检测器噪声增加。
9
柱
球 形 单 向 阀
电动机 偏心轮 柱塞
溶
剂
图10-7 柱塞往复泵示意图
10
（三）色谱柱
色谱柱是高效液相色谱分离过程的核心。一支稳定、高效的 色谱柱对建立适用性强、重现性好的分析方法是必不可少的。 1.担体 高效液相色谱的柱填料有离子交换树脂、凝胶，较多的使用 硅胶微粒作为担体。以下为几种常用的微粒类型： (1) 全多孔型担体：属于颗粒均匀的多孔球体，很好的兼顾 了效能、样品荷载量、耐久性等理想的性质，所以最为常用。 (2) 表层多孔型担体（薄壳型微珠担体）： 它是直径为 30 ～ 40 μm 的实心核 ( 玻璃微珠 ) ，优点 是：孔穴浅（固定相仅为表面的一薄层），传质速度快，易 于填充均匀，柱效高。这种担体目前应用较为普遍。
2(tR(2) tR(1) )
1.699(Y1/ 2(2) Y1/ 2(1) )
tR(2), tR(1): 组分2和组分1的保留时间
Wb(2), Wb(1): 组分2和组分1的峰底宽度
6
R=1.5 完全分离
7
高效液相色谱系统
（一） 高效液相色谱仪结构流程
进样器
高压泵
色谱柱
储液瓶 废液
检测器
高压输液泵、高效分离柱、高灵敏度检测器
3
色谱图及相关名词
（一）色谱流出曲线—色谱图
色谱图是色谱柱流出物通过检测器所产生的响应信号对时间 或液体流出体积的曲线 。 色谱流出曲线是色谱基本参数的源流，而色谱基本参数又是 用来观察色谱行为和研究色谱理论的重要指标。另外，还可 以直接利用色谱图峰位置点（特征保留值）进行定性，根据 曲线上测得的峰高或峰面积进行定量。
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3、试样在流动相中应有适宜的溶解度，防止 产生沉淀并在柱中沉积。
4、流动相同时还应满足检测器的要求。当使用 紫外检测器时，流动相不应有紫外吸收。
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（四）检测器
（一）、紫外检测器—应用最广泛的检测器
（三）、荧光检测器—专用型检测器
基本原理：在一定的条件下，荧光强度与流动相中 的组分的浓度成之比。
对多环芳烃，维生素B、黄曲霉素、卟啉类化合物、 农药、药物、氨基酸、甾类化合物等有响应。
22
特点：
高灵敏度； 高选择性； 可用于梯度洗脱。
23
定性与定量
（一）样品预处理 1.固体样品 固体样品首先要进行均质化，然后再采用如蒸馏、超临 界萃取或超声波萃取等技术进行样品制备。 2.液体样品
4
（二）柱效能
色谱柱在色谱分离中由动力学因素所决定的柱效能，通常 用塔板高度或塔板数表示。
塔板数：
n
5.54
tR Y1
2
2
16 tR W
2
涡流扩散相
分子扩散相
塔板高度：
H A B Cu u
流动相线速度
传质阻力相
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（三）分离度R 分离度的表达式：
R 2(tR(2) tR(1) ) Wb(2) Wb(1)
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（二） 高压输液系统（高压泵）
高压输液泵是核心部件，要求：密封性好，输出流量恒定， 压力平稳，可调范围宽，便于迅速更换溶剂及耐腐蚀等。
高压泵主要有恒流泵（往复泵）和恒压泵（气动泵）两种。
➢ 恒流泵特点 输出流量保持恒定而与色谱柱引起阻力变化无 关。分为机械注射泵和机械往复泵(常用)两种。
➢ 恒压泵特点 能保持输出压力恒定，但其流量则随色谱系统 阻力而变化，故保留时间的重视性差。
高效液相色谱分析
基本概念与特点
◆ 概念：高效液相色谱法(HPLC)是在20世纪60年代末，以经 典液相色谱为基础，引入了气相色谱的理论，在技术上采 用了高效固定相、高压输液系统和高灵敏度的在线检测器， 从而发展起来的一种新型分离分析技术。随着科学和技术 的不断改进与发展，目前已成为应用极为重要、广泛的分 离分析手段.
可以选择非极性或亚极性固定相。 ➢ 若样品溶于极性温和溶剂中，如醇类，则可选择极性固
定相，也可以选择非极性固定相。
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4.流动相
液相色谱的流动相又称为淋洗液，洗脱剂。 流动相组成、极性改变，可显著改变组分分离状况， 改变流动相的组成和极性（组成比例）是提高分离 度的有效手段。
常用溶剂： 环己烷、己烷、四氯化碳、甲苯、乙酸 乙酯、甲醇 、乙腈、水等。
◆ 特点：分离效率高、分析速度快、应用范围广、操作自动 化。
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液相色谱流程与原理
◆ 基本原理：混合组分的样品在色谱柱中，各组分由于在流 动相和固定相之间溶解、吸附、渗透或离子交换等作用力 的不同，随流动相在色谱柱中运行时，在两相间进行反复 多次分配过程，使得原来分配系数具有微小区别的各组分 ，产生了保留能力明显差异的效果，进而各组分在柱中的 移动速度不同，经过一定长度的色谱柱，彼此分离开来， 最后按一定顺序流出。
基本原理：试样组分对特定波长的紫外光具有选择 性的吸收，吸光百度文库与试样组分浓度之间的定量关系 符合郎伯-比耳定律。
优点：
灵敏度高，线形范围宽； 缺点：
死体积小；
无紫外-可见吸收组分不响应；
波长可选；
流动相选择受一定限制。
对流速和温度变化不 敏感；
可用于梯度洗脱。
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(a) 可变波长紫外检测器 (b) 二极管阵列检测器
11
2.色谱柱
柱体为直型不锈钢管，标准内经为4.6或3.9 mm，柱长15～30 cm，填料 颗粒粒度5－10μm。发展趋势是减小填料粒度(3－5μm)和柱经以提高 柱效。
为保护色谱柱， 通常在柱前加一支填料与色谱柱相同的保护柱。
12
3.固定相
选择固定相的一般标准还是以“相似相容”原理为基础。 ➢ 如果溶质溶于烃类溶剂，表明是低极性化合物，这样就
19
（二）、示差折光检测器—通用型检测器 每种物质具有不同的折光指数。
基本原理：连续检测参比池和样品池中流动相之间 的折光系数差值，该值与试样池流动相中的组分浓 度成正比。
生命科学中各类糖类化合物，没有紫外吸收， 一般要用示差折光检测器。
20
缺点：
灵敏度低； 对温度敏感； 不能用于梯度洗脱。
21
14
固定相极性>流动相极性
正相液相色谱 （正相柱）
组分极性越大，保留 时间越长；使用极性 化合物的分离。
固定相极性<流动相极性
反相液相色谱 （反相柱）
组分极性越小，保留 时间越长；适用非极 性化合物的分离。
15
选择流动相时应注意的问题
1、尽量使用高纯度试剂作流动相，防止微量杂质 长期累积损坏色谱柱和使检测器噪声增加。
9
柱
球 形 单 向 阀
电动机 偏心轮 柱塞
溶
剂
图10-7 柱塞往复泵示意图
10
（三）色谱柱
色谱柱是高效液相色谱分离过程的核心。一支稳定、高效的 色谱柱对建立适用性强、重现性好的分析方法是必不可少的。 1.担体 高效液相色谱的柱填料有离子交换树脂、凝胶，较多的使用 硅胶微粒作为担体。以下为几种常用的微粒类型： (1) 全多孔型担体：属于颗粒均匀的多孔球体，很好的兼顾 了效能、样品荷载量、耐久性等理想的性质，所以最为常用。 (2) 表层多孔型担体（薄壳型微珠担体）： 它是直径为 30 ～ 40 μm 的实心核 ( 玻璃微珠 ) ，优点 是：孔穴浅（固定相仅为表面的一薄层），传质速度快，易 于填充均匀，柱效高。这种担体目前应用较为普遍。
2(tR(2) tR(1) )
1.699(Y1/ 2(2) Y1/ 2(1) )
tR(2), tR(1): 组分2和组分1的保留时间
Wb(2), Wb(1): 组分2和组分1的峰底宽度
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R=1.5 完全分离
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高效液相色谱系统
（一） 高效液相色谱仪结构流程
进样器
高压泵
色谱柱
储液瓶 废液
检测器
高压输液泵、高效分离柱、高灵敏度检测器
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色谱图及相关名词
（一）色谱流出曲线—色谱图
色谱图是色谱柱流出物通过检测器所产生的响应信号对时间 或液体流出体积的曲线 。 色谱流出曲线是色谱基本参数的源流，而色谱基本参数又是 用来观察色谱行为和研究色谱理论的重要指标。另外，还可 以直接利用色谱图峰位置点（特征保留值）进行定性，根据 曲线上测得的峰高或峰面积进行定量。