酶的固定化技术及其应用

酶工程课程论文

题目：酶的固定化技术及其应用

学院：食品学院

专业：食品科学与工程

班级：食品101（35）

2012-11-21

酶的固定化技术及其应用

摘要：酶的固定化技术是酶工程研究领域的一项重点和热点技术之一，酶的固定化技术可以显著提高酶的利用率，降低酶生产的成本。本文主要研究酶的固定化技术，酶固定化的优缺点，以及在食品，医药，环境中的应用。并对其研究的前景进行了简洁的预测。

关键字：酶固定化技术应用

酶作为一种生物催化剂，因其催化作用具有高度专一性、催化条件温和、无污染等特点，广泛应用于食品加工、医药和精细化工等行业。但在使用过程中，人们也注意到酶的一些不足之处，如酶稳定性差、不能重复使用，并且反应后混入产品，纯化困难，使其难以在工业中更为广泛的应用。因此为适应工业化生产的需要，人们模仿人体酶的作用方式，通过固定化技术对酶加以固定改造，来克服游离酶在使用过程中的一些缺陷。

固定化酶，是指在一定的空间范围内起催化作用，并能反复和连续使用的酶。与传统的酶相比，固定化酶具有游离酶所不可比拟的优点.同一批固定化酶能在工艺流程中重复多次地使用；固定化后，和反应物分开，有利于控制生产过程，同时也省去了热处理使酶失活的步骤；稳定性显著提高；可长期使用，并可预测衰变的速度；提供了研究酶动力学的良好模型等一系列的优点。

用于固定化的酶，起初都是采用经提取和分离纯化后的酶，随着固定化技术的发展，也可采用含酶细胞或

细胞碎片进行固定化，直接应用细胞或细胞碎片中的酶或酶系进行催化反应．由于微生物细胞可直接作为酶源，所以逐渐产生了固定化细胞技术．

固定化细胞的优点是：

(1)省去了酶分离纯化的时间和费用；

(2)可进行多酶反应；

(3)保持了酶的原始状态，从而增加了酶的稳定性．

但固定化细胞与固定化酶相比，也存在一些不足

之处：

(1)因为产生副反应和所需生化产物的进一步代

谢，使固定化完整细胞生产的产物纯度可能比固定化酶低；

(2)细胞使用相当长的时间后，常常会发生自溶，尤

其是在细胞有可能进行增殖时，细胞的漏出就特别

明显：

(3)单位体积反应器内固定化细胞的活性总是比相

应的固定化酶活性低．

酶的固定化方法主要可分为四类：吸附法、包埋法、共价键结合法和交联法等。吸附法和共价键结合法又可统称为载体结合法。

1．包埋法

包埋固定化法是把酶定位于聚合物材料的格子结构或微胶囊结构中．这样可以防止酶蛋白释放，但是底物仍能渗入格子内与酶相接触．此法较为简便，酶分子仅仅是被包埋起来，生物活性破坏少，但此法对大分子底物不适用．

(1)凝胶包埋．凝胶包埋法是将酶包埋在交联的水不溶性凝胶的空隙中的方法．交联聚丙烯酰胺凝胶包埋法是首先被采用的包埋技术．Bernfeld和Wan(1963)用此法固定了胰蛋白酶、木瓜蛋白酶．用此方法后来又固定了过氧化氢酶、胰凝乳蛋白酶,葡萄糖苷酶,近年，又有人使用天然材料如藻酸盐和卡拉胶进行包埋．

(2)微胶囊包埋．将酶包埋于半透性聚合体膜内，形成直径为1～100um的微囊．这种固定化酶是以物理方法包埋在膜内的，只要底物和产物分子大小能够通过半透膜，底物和产物分子就能够以自由扩散的方式通过膜．

2．吸附法

吸附固定是最简单的方法，酶与载体之间的亲和力是范德华力、离子键和氢键．此方法又可分为物理吸附法和离子吸附法．

(1)物理吸附法．使用对蛋白质具有高度吸附能力的非水溶性载体，如活性碳质,多孔玻璃等作为吸附剂，将酶吸附到表面上使酶固定化．这种方法操作简单反应条件温和，载体可反复使用，但结合不牢固，酶易脱落．

(2)离子吸附法．利用酶蛋白在解离状态下可用电荷引力而固着于带有与酶蛋白电荷相异的离子交换剂(水不溶性载体)上的固定化方法．此法操作简单，固定较为牢固，在工业上用途颇广．常用的载体有阴离子交换剂(如：DEAE(二乙氨基乙基)一纤维素,TEAE(四乙氨基乙

基)一纤维素，DEAE一葡聚糖凝，和阳离子交换剂(如：羧甲基纤维素(CMC)．

3．共价法

酶蛋白分子上的官能团和固相支持物表面上的反应基团之间形成共价键连接的方法．其优点是酶与载体之间的连接很牢固，稳定性好，但反应条件激烈，操作复杂，控制条件苛刻．目前，已建立的方法包括：

(1)重氮法．这是共价键法中使用最多的一种，将具有氨基的不溶性载体，以稀盐酸和亚硝酸钠处理，成为重氮化物，再与酶分子偶联．酶蛋白中的游离氨基，组氨酸中的咪唑基，酪氨酸中的酚基，可与其结合．

(2)肽键法．此法是将有功能基团的载体与酶蛋白中赖氨酸的e一氨基或N末端的a一氨基作用形成肽键，成为固定化酶．

(3)烷基化法和芳基化法．以卤素为功能基团的载体与酶蛋白的氨基或巯基发生烷基化或芳基化反应，形成固定化酶．

4．交联法

使酶与带两个以上的多官能团试剂进行交联反应，生成不溶于水的二维交联聚集体，交联形成的固定化酶称为交联酶．与共价结合法一样，都是靠化学结合的方法使酶固定化．其区在于交联法使用了交联剂．常用的交联剂有戊二醛，鞣酸啪．单用戊二醛交联得到固

定化酶的方法很少单独使用．将此法与吸附法或包埋法联合使用可以达到良好的加固果．例如：先用几丁质吸附，再用戊二醛交联等．

5．其他方法

(1)物理方法．将酶限制在半透膜或超滤膜中，使酶仍以天然状态(可溶的)长期连续使用．用此方法固定的酶有蔗糖酶，酰胺酶等．

(2)利用可溶性一不溶性载体．1989年，Masayuki等报道了肠溶衣聚合物(Enteric coating polmer)Eudragitl.当pH<4．0时，呈不可溶性(有利于酶的回收)，当pH>5．0时，呈可溶性(有利于酶接近不容性底物)．作者用此法固定了纤维素酶．

6.4.2固定化酶的性质

酶在水溶液中以自由的游离状态存在，但是固定后酶分子便从游离的状态变为牢固地结合于载体的状态，其结果往往引起酶的性质的改变。为此，在固定化酶的应用过程中，必须了解固定化酶的性质与游离酶之间的差别，并对操作条件加以适当调整，酶固定化后所引起的酶性质的改变，一般认为其原因可能有两种：一是使酶本身变化；二是受固定化载体的物理或化学性质的影响．所谓酶本身的变化，主要是由于活性中心的氨基酸残基、高级结构和电荷状态等发生了变化；载体影响，则主要体现在固定化酶的周围，形成了能对底物产生影响的扩散层，以及静电的相互作用等引起的．

(1)温度．酶被固定化以后，其最适温度比天然酶高一些，一般因酶而异，大致提高5～15。C范围．

(2)稳定性．酶经固定后，稳定性都有所增加，稳定性的提高包括对各种试剂的稳定性、对蛋白酶的稳定性、热稳定性的贮存及操作稳定性等．

(3)pH值。酶和细胞经固定化后，其最适pH及pH活性曲线有时发生变化，有时则不发生变化．据报道，最适pH的变化是由载体的静电荷决定的，用聚合阳离子作载体，其最适pH比固定化前向酸性一侧偏移1个pH单位．这可解释为：当酶被结合到聚合阳离子载体上时，酶蛋白的阳离子数增多，从而造成固定化酶反应区域pH值比外部溶液偏碱．这样，实际上酶的反应是在反应液的pH偏碱的一侧进行的，从而使最适pH值转移到了酸性一侧，若用聚合阴离子作载体，则与上述情况相反，最适pH值移向碱性一侧在膜的一侧或固定膜上，酶反应可连续进行，提高了酶的利用效率，反应产物通过半透膜透去，消除了产物对酶反应的抑制，使酶反应不断朝着生成产物的方向进行[驯．中空纤维反应器也是一种应用较