外源目的基因表达与调控(1)
真核细胞常见的表达载体及真核细胞表达外源基因的调控(精)
真核细胞常见表达载体1. pCMVp-NEO-BAN载体特点: 该真核细胞表达载体分子量为6600碱基对，主要由CMVp启动子、兔β-球蛋白基因内含子、聚腺嘌呤、氨青霉素抗性基因和抗neo基因以及pBR322骨架构成，在大多数真核细胞内都能高水平稳定地表达外源目的基因。
更重要的是，由于该真核细胞表达载体中抗neo基因存在，转染细胞后，用G418筛选，可建立稳定的、高表达目的基因的细胞株。
插入外源基因的克隆位点包括Sal1、BamH1和EcoR1位点。
注意在此载体中有二个EcoR1位点存在。
2. pEGFP, 增强型绦色荧光蛋白表达载体(Enhanced Fluorecent Protein Vector特点: pEGFP表达载体中含有绿色荧光蛋白，在PCMV启动子驱动下，在真核细胞中高水平表达。
载体骨架中的SV40 origin使该载体在任何表达SV40 T 抗原的真核细胞内进行复制。
Neo抗性盒由SV40早期启动子、Tn5的neomycin/kanamycin抗性基因以及HSV-TK基因的聚腺嘌呤信号组成，能应用G418筛选稳定转染的真核细胞株。
此外，载体中的pUC origin 能保证该载体在大肠杆菌中的复制，而位于此表达盒上游的细菌启动子能驱动kanamycin抗性基因在大肠杆菌中的表达。
用途: 该表达载体EGFP上游有Nde1、Eco47111和Age1克隆位点，将外源基因扦入这些位点，将合成外源基因和EGFP的融合基因。
借此可确定外源基因在细胞内的表达和/或组织中的定位。
亦可用于检测克隆的启动子活性(取代CMV启动子,Acet1-Nhe1。
Excitation maximum = 488 nm; Emission maximum = 507图示为启动子分泌信号肽和多克隆位点区域：Ase1.pCMV…ccg cta gcg cta ccg gtc gcc acc atg- .EGFP…BamH1…SV40 poly A+Nhe1 Age13. pEGFT-Actin, 增强型绿色荧光蛋白/人肌动蛋白表达载体特点: pEGFP-Actin表达载体中含有绿色荧光蛋白和人胞浆β-肌动蛋白基因，在PCMV启动子驱动下，在真核细胞中高水平表达。
基因表达调控(分组)
RNA聚合酶相互作用的蛋白质因子。其编码基因与作用的靶 DNA序列不在同一DNA分子上
（基因调节蛋白）
RNA聚合酶和 通用转录因子
（基因调节蛋白）
（二）反式作用因子 1. 转录调节因子分类（按功能特性）
* 通用转录因子(general transcription factors)
•
（《自然》（Nature））
发展历史
• 起于上世纪40-50年代,法国巴斯德研究院的Andre Lwoff等人 • 1950年 Monod等发现,在培养基中加入乳糖可启动E.coli的β-半乳 糖苷酶的从头合成,极大提高该酶活性 • 1961年, F.Jacob和J.monod 首先提出原核生物基因表达的操纵子 学说 • 1966年,Walter Gilbert和Benno Muller-Hill证明了阻遏蛋白的存在 • 1970年,Mark Ptashne和Gilbert详尽的阐述了基因阻遏机制 • 1975年，Roy Britten和Eric Davison在操纵子学说的基础上提出 了真核生物基因的表达调控模式 • 1981年，Charles Yanofsky等发现色氨酸操纵子的转录衰减与基 因特异性序列有关 • 很多原核、真核基因的顺式作用元件陆续被鉴定 • DNA-蛋白质相互作用分析成为基因表达调控的热门课题
Structure of the enhancer of SV40
增强子（enhancer)：是使启动子的基因转录效率显着提高(增强转录
活性)的一类顺式作用元件，其本身不具有启动子活性，是由多个独
立的、具有特征性的核苷酸序列所组成。
RNA剪接信号 :内含子序列
28548基因工程课程考试说明
28548 基因工程课程考试说明一、课程使用教材、大纲基因工程课程使用的教材为《基因工程》，龙敏南等编著，科学出版社，2010年版。
二、本课程的试卷题型结构及试题难易度1.试卷题型结构表2．试卷按识记、领会、简单应用、综合应用四个认知层次命制试题，四个认知层次在试卷中所占的比例大致分别为：识记占20％、领会占25%、简单应用占35％、综合应用占20％。
3．试卷难易程度大致可分为“容易、中等偏易、中等偏难、难”。
根据课程的特点，每份试卷中，不同难易程度试题所占的分数比例大致依次为易占30分、中等偏易30分、中等偏难20分、难占20分。
三、各章内容分数的大致分布四、各章内容的重、难点五、各题型试题范例及解题要求1.单项选择题（每小题1分，共20分）解题要求：在下列每小题的四个备选答案中，选出一个正确答案，并将其字母标号填入题干的括号内。
范例：转化大肠杆菌的方法中，转化效率最高的是（）A.Ca2＋诱导大肠杆菌转化法B.电穿孔转化法C.三亲本杂交接合转化大肠杆菌D.转化效率相同解答：B2.填空题（每小题1分，共10分）解题要求：在下列每小题的空格中填入正确答案。
范例：DNA序列测定的方法主要有Sanger发明的DNA双脱氧链终止测序法和Maxam、Gilbert发明的两种。
解答：化学降解测序法3.名词解释（每小题3分，共15分）解题要求：直接写出相关术语的涵义，不要展开说明。
范例：亚克隆解答：将克隆片段进一步片段化后再次进行的克隆，（1分）一般将重组DNA分别用几种限制性核酸内切酶切割后，将所得各片段分别重组到载体上，再转化宿主细胞，通过对转化细胞的表型鉴定或其他方法来确定基因所在的位置。
（2分）4.简答题（每小题5分，共35分）解题要求：简要回答相关问题要点，不用阐述。
范例：简述噬菌体表面展示技术。
解答：将外源DNA片段插入丝状噬菌体基因组的一个外被蛋白基因中，如果两者读码框结构保持一致，这个外源DNA片段所编码的，并显示在噬菌体的表面。
第七章-外源基因的表达
2021/4/9
1
第一节 外源基因在原核细胞中的表达
1.原核生物基因表达的特点
与真核细胞相比，原核细胞的基因表达有以下特点： （1）原核生物只有一种RNA聚合酶（真核细胞有三种）识别 原核细胞的启动子，催化所有RNA的合成。 （2）原核生物的基因表达是以操纵子为单位的。 （3）由于原核生物无核膜，所以转录与翻译是偶联的，也是 连续进行的。 （4）原核基因一般不含有内含子，在原核细胞中缺乏真核细 胞的转录后加工系统。 2（0215/4）/9 原核生物基因的控制主要在转录水平，这种控制要比对 2
202菌中的表达部位
（1）不同表达部位
克隆在大肠杆菌中的外源基因，它们的编码产物蛋白质，有 的是在细胞质中表达，有的是在细胞周质中表达，还有的则是 以分泌到细胞外的方式表达。
■细胞质中表达
大肠杆菌细胞质中表达的外源蛋白，大多是以包含体的形式 存在的。包含体是存在于细胞质中的一种由不溶性蛋白质聚集 折叠而成的晶体结构。
（1）非融合型表达蛋白载体pKK223-3
➢具有一个强的tac（trp-lac）启动子，这个启动子是由trp启 动子的-35区、lac UV5启动子的-10区、操纵基因及S-D序列 组成。
➢紧接着tac启动子的是一个取自pUC8的多位点接头，使之很
2容021易/4/9把目的基因定位在启动子和S-D序列之后。
的基因，而不能用基因组DNA。 （3）必须利用原核细胞的强启动子和S-D序列等调控元件控 制外源基的表达。 （4）外源基因与表达载体连接后，必须形成正确的开放阅读 框架。 （5）利用宿主菌的调控系统，调节外源基因的表达，防止外 源基因的表达产物对宿主菌的伤害。
3.原核生物基因表达的调控序列
外源基因的表达
•Ⅱ型启动子
Ⅱ型启动子所属基因绝大多数编码蛋白质。
转录起始位点
TATA框（Hogness框）：富含AT的保守序列区，它 启动子 与DNA双链的解链有关，并决定转录起始点的选择。 基本区 其中心点位于转录起始点上游－20～－30bp的位置。 CAAT框：位于转录起始位点上游－75bp处，与RNA 聚合酶的结合有关。 GC框：位于转录起始位点上游－100～－300bp处， 与转录因子的结合有关。
s factor:
6.2.1.4 启动子的分离
随机克隆法 聚合酶保护法 过滤膜结合法 PCR扩增法
6.2.2 增强子
增强子（enhancer）：是能够增强启动子转录活性的DNA 顺式作用序列，又称强化子。 增强子的特性：
双向性。
重复序列。 增强子行使功能与所处的位置无关。
特异性。
增强子不仅与同源基因相连时有调控功能，与异 源基因相连时也有功能。
序列特异性
*启动子的特征 方向性 位置特性 种属特异性
6.2.1.1 原核生物的启动子
•转录起始位点：大多数细菌启动子转录起始区的序列为 CAT，转录从第二个碱基开始，该碱基为嘌呤碱基 （A/G）。 •Pribnow框： －10bp处的TATA区，又称－10序列区。 •Sextama框： －35bp处的TTGACA区，又称－35区。 •间隔区：内部无明显的保守性，其序列的碱基组成对启 动子的功能不十分重要，但其长度却是影响启动子功能的 重要因素。
6.1.3 外源基因mRNA的有效翻译
外源基因mRNA有效翻译必须考虑的基本原则：
AUG(ATG)是首选的起始密码子。
SD序列为与核糖体16S rRNA互补结合的位点，该序 列至少含有AGGAGG序列中的4个碱基。
6.目的基因的表达
IPTG
mRNA
Tac 表达系统
tac 启动子是由 trp 的 –35 序列和 lacUV5 的 –10 序列 拼接而成的杂合启动子。 拼接而成的杂合启动子。
启动子 P lac P trp P tac -35 区序列 TTTACA TTGACA TTGACA -10 区序列 TATAAT T TAA C T TATAAT
成一个操纵子 – 操纵子—原核生物转录单位
– 启动序列决定转录活性大小 – 操纵序列是阻遏蛋白的结合位点 • 负性调节 为主 • 正性调节 • 真核生物： 真核生物： • 顺式作用元件（cis-acting element）-顺式作用元件（ ） 指可影响自身基因表达活性的DNA序列。 自身基因表达活性的 序列。 指可影响自身基因表达活性的 序列 – 非编码序列 – 启动子 – 调控元件 位于远端调控区的顺式作用元 调控元件: 增强子,沉默子 件(增强子 沉默子 增强子 沉默子)
发热量低、需氧低、 发热量低、需氧低、适当的发酵温 度和细胞形态； 度和细胞形态； 容易进行代谢调控； 容易进行代谢调控； 容易进行DNA重组技术操作； 容易进行DNA重组技术操作； DNA重组技术操作 产物的产量、产率高， 产物的产量、产率高， 产物容易提取纯化。 产物容易提取纯化。
宿主细胞分为两大类： 宿主细胞分为两大类： 第一类为原核细胞： 第一类为原核细胞：常用有大肠杆 菌、枯草芽胞杆菌、链霉菌等； 枯草芽胞杆菌、链霉菌等； 第二类为真核细胞：常用有酵母、 第二类为真核细胞：常用有酵母、 丝状真菌、哺乳动物细胞等。 丝状真菌、哺乳动物细胞等。
Lac 表达系统 负调节因子 lac I 表达系统:
在无诱导物情形下， lacI 基因产物形成四聚体阻遏蛋白， 与启动子下游的操纵基因紧密结合，阻止转录的起始。
解释基因表达的调控机制。
解释基因表达的调控机制。
> 原题：解释基因表达的调控机制基因表达调控是指在细胞中控制基因转录和翻译的过程。
通过调控基因表达，细胞可以根据内外环境的需求来合成所需的蛋白质。
基因表达调控涉及多个环节和分子机制。
一、转录调控1. 转录因子：转录因子是一类可以与DNA结合的蛋白质，它们能够促进或抑制特定基因的转录。
转录因子的结合位点通常位于基因的启动子区域，它们可以通过调控转录复合物的形成来影响RNA聚合酶的结合和启动转录的过程。
2. 染色质修饰：染色质修饰是指对DNA及其相关的蛋白质进行化学修饰，从而改变染色质结构和可访问性。
例如，DNA甲基化可以抑制某些基因的转录，而组蛋白乙酰化则可以促进基因的转录。
二、转录后调控1. RNA剪接：RNA剪接是一种将RNA前体分子中的内含子去除，将外显子连结起来的过程。
通过不同的剪接方式，可以产生不同的mRNA亚型，从而影响蛋白质的翻译。
2. mRNA降解：mRNA降解是指将mRNA分解为较小的碎片，从而停止蛋白质的合成。
通过调控mRNA的稳定性，可以控制基因的表达水平。
三、翻译调控1. 转运调控：通过调控mRNA的转运过程，可以控制mRNA的定位和稳定性。
这种调控方式可以影响基因的表达水平。
2. 蛋白质修饰：蛋白质修饰是指在翻译后对蛋白质进行化学修饰的过程。
蛋白质修饰可以影响蛋白质的功能、稳定性和亚细胞定位。
综上所述，基因表达调控涉及转录调控、转录后调控和翻译调控等多个层面和分子机制。
这些调控机制相互作用，共同影响基因的表达水平和细胞的功能。
对这些调控机制的深入研究，有助于我们更好地理解生物体的发育、生长和适应环境的能力。
第七八章-外源基因的表达及其优化策略20201112
略 稳定性 翻 译 的
培养基 环境因素对 受体菌生长 的影响
终止
诱导时间和
密码子
诱导剂量
的选择
第三节 外源基因在真核细胞中的表达
一 、真核生物基因表达与调控的特点
一 、真核生物基因表达与调控的特点
二 、真核生物基因表达载体的组成特征
基因组DNA的存在形式可影响基因表达 原核DNA序列
转录与翻译不偶联
启动子
调控是多层次的 具有组织和细胞类型特异性
增强子 终止子 内含子 选择标记基因，
对信号分子反应不同
PloyA加尾信号
第三节 外源基因在真核细胞中的表达
二、真核生物基因表达载体的组成特征
第三节 外源基因在真核细胞中的表达
根据启动子的功能和作用方式不同，真核基因的表达载体 的启动子可以分为几种类型，每一种类型的优缺点是什么？ 三、真核表达的受体系统 按照宿主细胞的不同，常用外源基因的真核受体系统可大 致分为酵母、职务、昆虫和哺乳动物等受体系统。 每种受体的系统的特征如下表：
原核生物基因表达一般以操纵子为单位 启动子特征：作用要强；必须表现最低水平的基础转录活性；启动
子具有简便和廉价的可诱导性
原核生物只有一种RNA聚合酶，识别原 特征：SD序列与起始密码子的间距对翻译起始效率影响较大；
核生物的启动子，催化所有RNA的合成 mRNA-rRNA的互补区域越长，基因翻译的概率越大；SD序列与起始
第八章 外源基因表达产物的分离纯化
四 、合适分离纯化介质的选择 1 、分离纯化蛋白质的材料 理想的蛋白质分离纯化应具有以下几个方面的性质： 对目标蛋白具有较高的分离效率；在分离纯化过程中不 会造成目标蛋白的变性；化学性能和机械性能稳定，重 复性好；价格低廉，成本低。
实验 7 外源基因在大肠杆菌中的表达(或诱导表达)和检测 (1)
原核（大肠杆菌）表达系统
特点： 表达质粒独立运转表达 基因重组速度快，生产工艺简单， 成本低，表达量较高， 重组蛋白翻译后修饰较差。
1978年，人胰岛素insulin 基因首次表达 目前仍是一个重要的表达系统
应用：活性要求不高的蛋白质 如抗原制备
原核表达系统－E.coli:
transformation
The metal binding domain of the fusion peptide allows simple purification of recombinant proteins by Immobilized Metal Affinity Chromatography with Invitrogen’s ProBond. resin (available in bulk, see page v). The enterokinase cleavage recognition site in the fusion peptide located between the metal binding domain and the recombinant protein allows for subsequent removal of this N-terminal fusion peptide from thepurified recombinant protein.
OD600 = 0.4-0.6
37℃ overnight
IPTG
诱导表达4-6小时，time-course expression
SDS-PAGE分析
Invitrogen
T7 promoter: bases 20-39 Ribosome binding site: bases 84-90 6xHis tag: bases 112-129 T7 gene 10 leader: bases 133-162 Anti-XpressTM epitope: bases 169-192 Multiple cloning site: bases 202-248 pRSET reverse priming site: bases 295-314 T7 transcription terminator: bases 256-385 f1 origin: bases 456-911 bla promoter: bases 943-1047 Ampicillin (bla) resistance gene (ORF): bases 1042-1902 pUC origin: bases 916-2852 (C)
第十章外源基因表达和基因工程药物
（二）顺式作用原件（启动子、增强子和沉默子） 直接影响基因表达活性 （三）转录因子的调控 （四）真核生物在转录后仍可控制mRNA的结构和 功能，其在转录后层次不同于原核生物
目标蛋白性质
是否需要糖基化
三维结构复杂程度
是
否
简单结构
真核表达 系统
原核表达 系统
复杂的三维结构
• 目的：针对难以或无法从自然界直接提取、 分离、纯化所获得的，或制造成本、产量 规模等受限制的，或利用化学方法无法合 成的多肽，蛋白质、酶这类生物分子药物， 利用细胞或组织或器官或生命体的复制、 转录、翻译及其调控系统以及翻译后加工、 修饰等体系，按人的意愿生物合成这些生 物分子，并从中将表达产物分离纯化至预 期程度，最终加工成药品。
测序；表达图谱 4. 法医—犯罪现场标本分析 5. 肿瘤—各种肿瘤检测 6. 其他……
二、目的基因与表达载体的重组
• 重组载体的构建：对目的基因和载体DNA 进行剪切、修饰，在连接酶的作用下连接 形成完整有复制能力的重组体。
（一）载体
• 对于外源基因的表达，第二个问题就是选 择合适的表达载体并将目的基因重组至表 达载体上。
第十章外源基因表达与基 因工程药物
第一节 概 述
• 外源基因的表达：利用细胞内相关酶系及其调控 系统，将外源基因转录成肽链或加工成活性蛋白 质的过程。
• 具体的说，利用分子生物学技术，在体外将编码 外源蛋白质的基因重组至适宜的表达载体上，通 过相关技术将其导入宿主细胞内，借助宿主细胞 的转录、翻译或翻译后修饰酶系及相应的调控系 统，在宿主细胞合成或分泌具有原有生物活性的 蛋白质。
• 目的基因和载体DNA分子的体外重组关键 在于：选择合适的重组位点、剪切位点； 以及剪切后适当的条件将目的基因和载体 DNA分子连接获得重组分子。
大学《基因工程学》教学大纲
《基因工程学》课程教学大纲（Genetic Engineering）一、课程说明课程编码：02200200课程总学时（理论总学时/实践总学时）：48（48/0）周学时（理论学时/实践学时）：4（4/0）学分：31．课程性质：专业必修课。
2．适用专业与学时分配：适用生物技术专业。
教学内容与学时分配3．课程教学目的与要求：本课程的授课对象是生物技术专业的本科生。
课程简介：《基因工程》是生物技术专业的专业必修课程。
其以分子遗传学理论为基础，以分子生物学和微生物学的现代方法为手段而建立起来的一门技术学科。
基因工程兴起于20世纪70年代初，它的问世带动了生物技术的兴起和发展，是现代生物技术的核心内容。
基因工程课程的主要内容包括基因的分离、基因的克隆、基因的表达、植物基因工程、动物基因工程、药物基因工程和基因治疗等。
它是生命科学学院生物技术专业本科生的主干专业课程之一，它是生物工程（包括基因工程、细胞工程、酶工程、发酵工程）中最重要的课程，其它三大工程是建立在基因工程基础之上的，同时也为生物技术制药等后继学科奠定了重要的理论基础。
课程目标：设置本课程是为了让生物技术专业的学生理解和掌握基因工程的技术原理，通过本课程学习，掌握基因操作的工具酶，基因克隆常用载体，目的基因的分离与合成，重组体的构建，重组体向宿主细胞的导入，重组体克隆的筛选与鉴定以及克隆基因的表达，同时了解基因工程在生物学领域中的应用与发展前景。
对学生达到毕业要求贡献如下：1）了解基因工程学的历史、发展和前沿知识。
2）掌握基因工程学的基础理论、基本知识和基本技能；教学要求：学完基因工程学后，学生将具备以下能力：1）具有良好的自学能力；2）综合运用所掌握的基因工程学理论知识和技能、从事生物科学及其相关领域科学研究的能力。
4．本门课程与其它课程关系：先修课程为生物化学、微生物学、分子生物学、细胞学等，具备基础理论知识及实验能力是基因工程学课程的基础。
教学课件第五章基因表达的调控Regulationandcontrolofgene
操纵子由结构基因B、A、D以及调控元件I1、 I2、O1、O2和启动子构成。araC基因编码调 节蛋白AraC。
23
AraC 对阿拉伯糖操纵子的调节图
不存在阿拉伯糖时，AraC二聚体与O1、O2及I1 结合，二聚体间相互作用使DNA弯曲成环结构。
由于I2不被占据，B、A、D基因不发生转录，但
例:色氨酸操纵子表达的调控有两种方式: a.通过阻遏蛋白的负调控 b.通过衰减子作用
31
（2）转录衰减的调控
调节区
trpR RNA聚P合酶O
RNA聚合酶
Trp 低时
Trp 高时 Trp
140个核苷酸
结构基因
mRNA 6700个核苷酸
色氨酸操纵子
32
调节区
trpR
PO
前导序列
前导mRNA
1
2
结构基因
(constitutive gene expression)
基因较少受环境因素影响，而是在个 体各个生长阶段的大多数或几乎全部组织 中持续表达，或变化很小。如管家基因。
5
（二）诱导和阻遏表达
诱导表达(induction expression)
在特定环境信号刺激下，有些基 因的表达表现为开放或增强。
阻遏表达(repression expression)
在特定环境信号刺激下，有些基因 的表达表现为关闭或下降。
6
协调表达(coordinance expression)
在一定机制下，功能相关的一组 基因，协调一致，共同表达。
7
四、基因表达的调控的概念
机体各种细胞中含有的相同遗传 信息(相同的结构基因)，根据机体的 不同发育阶段、不同的组织细胞及不 同的功能状态，选择性、程序性地表 达特定数量的特定基因的过程。
基因工程原理-第章外源目的基因表达与调控
核心启动子（core promoter） （-45—+20位核苷酸）
（单独存在即可起始转录）
mRNA基因启动子（Ⅱ型）
没有广泛的同源性 多数含TATA序列,通常处于-30区 无TATA盒的启动子称无TATA盒启动子
tRNA基因启动子（Ⅲ型）
真核和原核的启动子有很多不同：
（1）有多种元件：TATA框，GC框，CATT框，OCT等； （2）结构不恒定。有的有多种框盒如组蛋白H2B；有的只有TATA框
诱导性增强子：这种增强子的活性通常要有特定的启动子参与。例如，金 属硫蛋白基因可以在多种组织细胞中转录，又可受类固醇激素、锌、镉和 生长因子等的诱导而提高转录水平。
三、沉默子(silencer)
是真核基因中的一种特殊的序列，与增强子有许多类似之处。沉默子能够 同反式因子结合从而阻断增强子及反式激活因子的作用，并最终抑制该基因的转录 活性。
四、绝缘子（insulator）
真核生物基因组的调控元件之一，是一种边界元件。绝缘子能够阻止邻近的增强 子或沉默子对其界定的基因的启动子发挥调控作用。
绝缘子的抑制作用具有“极性”的特点，即只抑制处于绝缘子所在边界另一侧的 增强子或沉默子，而对处于同一染色质结构域内的增强子或沉默子没有作用
转录因子的作用方式：
A U C G
翻译
蛋白质
氨基酸 折叠密码
。
一、外源基因的起始转录 启动子和调控序列——转录的关键 原核生物启动子：lac、trp、λPR、 λPl等
转录过程
二、外源基因mRNA的有效翻译
• 起始密码子：AUG是首选 • 核糖体结合位点SD序列AGGAGG：至少包含4个碱
基 • SD与AUG之间距离为3-9个碱基 • 翻译起始区不应形成二级结构
05第五章外源基因的克隆与表达
第五章外源基因的克隆与表达基因克隆技术即把来自不同生物的基因同有自主复制能力的克隆载体DNA在体外人工连接，构建成新的重组DNA，然后送入受体生物中去扩增表达，从而产生遗传物质和状态的转移和重新组合。
通过基因克隆技术，就可以得到大量的目的基因并保存。
如果需要对目的基因的表达产物进行研究，还可以将目的基因和表达载体进行连接重组，将携带有目的基因的表达载体DNA导入宿主细胞内，利用宿主细胞内的环境和各种调控元件合成目的基因的表达产物。
构建新的重组DNA是基因克隆技术的关键步骤，一般重组DNA实验通常遵循以下程序∶分、切、连、转、选。
"分"是指分离制备合格的待操作的DNA，包括具有携带连接外源DNA作用的载体DNA和欲克隆的目的DNA；"切"是指用序列特异的限制性内切酶切开载体DNA，或者切出目的基因；"连"是指用DNA连接酶将目的DNA同载体DNA连接起来，形成一种新的重组DNA分子；"转"是指通过特殊的方法将重组的DNA分子送入宿主细胞中进行复制和扩增；"选"则是从宿主群体中挑选出携带有重组DNA分子的个体。
第一节DNA片段的体外连接DNA片段的体外连接即构建重组DNA程序中的"连"，是DNA分子之间的连接过程，就是将目的基因通过重组到合适的载体上，导入适当的宿主细胞中实现增殖表达。
在连接的过程中需要DNA连接酶的作用，DNA连接酶能催化双链DNA片段紧靠在一起的3＇羟基末端与5＇磷酸基团末端之间形成磷酸二酯键，使两末端连接。
目前用于试管中连接DNA片段的DNA连接酶有E.coli DNA连接酶和T4噬菌体DNA连接酶（又称T4DNA连接酶）。
E.coli DNA连接酶只能催化双链DNA片段互补黏性末端之间的连接，不能催化双链DNA片段平末端之间的连接。
T4 DNA连接酶既可用于双链DNA片段互补黏性末端之间的连接，也能催化双链DNA片段平末端之间的连接，但平末端之间的连接效率比较低。
外源基因表达机制
B）构建重组异源蛋白表达系统 将SD序列和启动子安装在外源基因的5’端 ATG碱基前的正确位置，使外源基因高效表达序 列正确的天然蛋白． C）构建分泌型异源蛋白表达系统 将分泌型蛋白的信号肽编码序列与外源基因 拼接，使异源蛋白表达后分泌到细胞周质中或直 接进入到培养基中． 优点：增大表达蛋白的稳定性大大简化后续 的分离纯化步骤．
原核生物启动子
转录起始位点。多数细菌启动子转录起始区序列为 CAT． Pribnow框。在距转录起始位点上游6bp处存在一个六联 体保守序列： TATAAT ，由于中间的碱基位于转录的起始 点上游的 10bp 处，又称为 -10 序列区。少数 Pribnow 框 中间碱基的位置在-9-18之间变化。 Sextama 框。在转录启动区的另一个六联体保守序列位 于距转录起 始位点上游 35bp 处，通常称为 -35 区，该 保守序列为TTGACA，它是 RNA聚合酶的识别位点。 间隔区。间隔序列内部无明显的保守性，其序列的碱基 组成对启动子的功能并不十分重要。但间隔序列的长 度却是影响启动子功能．
5 绝缘子
* 绝缘子（insulator）：在真核生物基因组中， 既是基因表达的调控元件，也是一种边界元 件．在果蝇和鸡的基因组中已发现多个绝缘子， 它能阻止临近的调控元件对其所界定基因的启 动子起增强或抑制作用．
* 果蝇中绝缘子SCS和SCS’分别位于果蝇多线染色 体87A7座位hsp70基因两侧的核酸酶高度敏感 区，它们是一种具有顺式调控作用的边界元件， 能使其界定的染色体结构域上的基因免受区域 外两端正调控和负调控信号的影响．
Ⅲ型启动子。 * 内启动子:转录起始位点的下游，如tRNA和5sRNA 的启动子。 * 外启动子:转录起始位点的上游，如脊椎动物U6 核小RNA和7SK RNA启动子，其结构类似于真核生 物Ⅱ型启动子。
外源基因的表达
6.2.2 增强子
增强子（enhancer）：是能够增强启动子转录活性的DNA 顺式作用序列，又称强化子。
❖增强子的特性： ➢双向性。 ➢重复序列。 ➢增强子行使功能与所处的位置无关。 ➢特异性。 ➢增强子不仅与同源基因相连时有调控功能，与异 源基因相连时也有功能。
•Ⅲ型启动子
内启动子：位于转录起始位点的下游，如tRNA和5SRNA 的启动子。
外启动子：位于转录起始位点的上游，缺乏相应的内部 序列，如脊椎动物U6核小RNA和7SKRNA启 动子，结构类似于真核生物Ⅱ型启动子。
6.2.1.3 启动子与转录启动
大肠杆菌RNA聚合酶的亚基成分
亚基 基因 氨基酸含量 数量 分子量（kD）
➢绝缘子对基因表达的调控是一个非常复杂的过程，它是通 过细胞内特定的蛋白质因子相互作用而产生调控效应的。
6.2.6 反义子
反义RNA（antisence RNA）：同某种天然mRNA反向互补的 RNA分子称为反义RNA，它是由双链DNA中的无意义链转录产 生的，可以用来阻止被其转化的细胞中存在的与之互补mRNA 的转译活性。现在编码反义RNA的基因已在基因工程中得到应 用，此项技术特称为反义技术学（antisence techology）。
在前导肽基因中有两个相邻的色氨酸密码子，所以前导肽的翻译对 tRNATrp的浓度很敏感。当培养基中trp浓度很低时，负载有trp的tRNATrp也 就少，这样翻译通过两个相邻trp密码子的速度就很慢，当4区被转录完成时， 核糖体才进行到1区（或停留在两个相邻的trp 密码子处），这时前导区结构 是2-3配对，不形成3-4配对的终止结构，所以转录可继续进行，直到trp操纵 子中的结构基因全部转录。而当trp浓度高时，核糖体可顺利通过两个相邻 的trp密码子，在4区被转录之前，核糖体就到达2区，这样使2-3不能配对， 3-4区可自由配对形成茎－环状终止子结构，终止转录。所以，弱化子对 RNA聚合酶的影响依赖于前导肽翻译中核糖体所处的位置。
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聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）的原理
聚丙烯酰胺凝胶的组成及特点
组成：主要由丙烯酰胺(Acr)和交联剂N,N’-甲叉(亚甲基)
双丙烯酰胺(Bis)聚合而成。
聚合：单独或混合时稳定，出现自由基团时会聚合。
化学法的引发剂：过硫酸铵（APS or AP)， 催化剂：四甲基乙二胺（TEMED)
reacts with the substrate.
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Western Blot操作的过程
• 蛋白样品的制 备
• SDS聚丙烯酰胺 凝胶电泳
转膜 封闭 一抗杂交 二抗杂交 底物显色
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Gel electrophoresis
Tips: Separate proteins by gel electrophoresis
第四节 目的基因表达产物检测 与分离纯化
一、外源目的基因表达产物的检测
外源目的基因的表达包括转录和翻译两个阶 段。外源基因表达产物的检测过程就是对特异 性mRNA或蛋白质的检测。
特异性mRNA的检测: Northern杂交 特异性蛋白质的检测: ELISA, Western杂交
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1.Northern 印迹杂交(Northern blot)
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Western blot基本原理
A. Direct Detection
B. Indirect Detection
Figure 1A. In the direct detection method, labeled primary antibody binds to
antigen on the membrane and reacts with substrate, creating a detectable signal.
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ELISA基本的实验过程
• 包被：将已知抗原或抗体通过物理吸附到固相载 体表面，使抗原或抗体固相化
• 抗原抗体反应：先后加入被检标本和酶结合物， 使之与固相抗原或抗体发生免疫反应而被结合固 定
• 酶促反应：在反应体系中加入酶作用的底物，使 发生酶促反应而显色
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ELISA基本的实验过程
的量直接相关
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ห้องสมุดไป่ตู้ ELISA原理图
②酶标记的抗原或抗体（标记物）
③酶作用的底物（显色剂）
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①固相的抗原或抗体（免疫吸附剂）
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ELISA可以分为直接法、间接法和夹心法等几种。
直接法：
直接法是指酶标抗原或抗体直接与包被在酶标板上的抗体或抗原 结合形成酶标抗原—抗体复合物，加入酶反应底物，测定产物的吸 光值，计算出包被在酶标上的抗体或抗原的量。见图a
检测RNA（主要是mRNA）的方法 与Southern杂交的区别
– 靶核酸：RNA – RNA电泳: 在变性条件下进行,以去除RNA中的
二级结构,保证RNA完全按分子大小分离。 变性电泳主要有3种:乙二醛变性电泳、甲醛变 性电泳和羟甲基汞变性电泳。 – 转膜：不需变性
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2.ELISA
1971年瑞典学者 Engvall 和Perlmann， 荷兰学者Van Weeman和 Schuurs分别报道 将免疫技术发展为检测体液中微量物质的固 相免疫测定方法，称为酶联免疫吸附实验 （Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay, ELISA）。
间接法：
是将酶标记在二抗上，当抗体（一抗）和包被在酶标板的抗原结 合形成复合物后，再以酶标二抗和复合物结合，通过测定酶反应产 物的颜色可以（间接）反应一抗和抗原的结合情况，进而计算出抗 原或抗体的量。见图b
夹心法：
是先将未标记的抗体包被在酶标板上，用于捕获抗原，再用酶标 的抗体与抗原反应形成抗体-抗原-酶标抗体复合物；也可以象间接 法一样应用酶标二抗和抗体-抗原-抗体复合物结合，形成抗体-抗原抗体-酶标二抗复合物，见图C。前者称为直接夹心法，后者称为间 接夹心法。
1B. In the indirect detection method, unlabeled primary antibody binds to the
antigen. Then, a labeled secondary antibody binds to the primary antibody and
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ELISA原理
• 使抗原或抗体结合到某种固相载体表面，并保持 其免疫活性
• 使抗原或抗体与某种酶连接成酶标抗原或抗体， 这种酶标抗原或抗体既保留其免疫活性，又保留 酶的活性
• 结合在固相载体上的酶量与标本中受检物质的量 成一定的比例。加入酶反应的底物后，底物被酶 催化变为有色产物，产物的量与标本中受检物质
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Western Blot 基本原理
• 经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例 如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸 附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学 活性不变。
• 以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗 体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反 应，经过底物显色或放射自显影以检测特定蛋白质的 表达情况。
特点：凝胶浓度越大，交联度越大，凝胶孔径越小。
故根据分离蛋白质的大小选择不同浓度的凝胶。
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聚丙烯酰胺凝胶的特点
优点：聚丙烯酰胺凝胶电泳具有机械强度好、弹性大、
透明、化学稳定性高、无电渗作用、设备简单、 用样量少(1～100μg)和分辨率高等优点。
用途：蛋白质，核酸等物质的分离、定性和定量分析。
1-D gels
2-D gels
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Transfer(Wet tank transfer system and Semi-dry transfer system)
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Blocking and Detection
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3. Western Blot
要检测一个基因的表达产物是否正确，或者比 较表达产物量的相对变化，首选方法是Western Blot。
Western blot 是生物学、生物化学、分子生物 学和免疫遗传学中常用的一种实验方法。
Western blot整个过程主要包括：PAGE电泳、 转膜及蛋白检测3个阶段。