外源目的基因表达与调控(1)
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检测RNA（主要是mRNA）的方法 与Southern杂交的区别
– 靶核酸：RNA – RNA电泳: 在变性条件下进行,以去除RNA中的
二级结构,保证RNA完全按分子大小分离。 变性电泳主要有3种:乙二醛变性电泳、甲醛变 性电泳和羟甲基汞变性电泳。 – 转膜：不需变性
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2
2.ELISA
1971年瑞典学者 Engvall 和Perlmann， 荷兰学者Van Weeman和 Schuurs分别报道 将免疫技术发展为检测体液中微量物质的固 相免疫测定方法，称为酶联免疫吸附实验 （Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay, ELISA）。
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3
ELISA原理
• 使抗原或抗体结合到某种固相载体表面，并保持 其免疫活性
• 使抗原或抗体与某种酶连接成酶标抗原或抗体， 这种酶标抗原或抗体既保留其免疫活性，又保留 酶的活性
• 结合在固相载体上的酶量与标本中受检物质的量 成一定的比例。加入酶反应的底物后，底物被酶 催化变为有色产物，产物的量与标本中受检物质
1-D gels
2-D gels
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Transfer(Wet tank transfer system and Semi-dry transfer system)
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Blocking and Detection
reacts with the substrate.
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15
Western Blot操作的过程
• 蛋白样品的制 备
• SDS聚丙烯酰胺 凝胶电泳
转膜 封闭 一抗杂交 二抗杂交 底物显色
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16
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17
Gel electrophoresis
Tips: Separate proteins by gel electrophoresis
间接法：
是将酶标记在二抗上，当抗体（一抗）和包被在酶标板的抗原结 合形成复合物后，再以酶标二抗和复合物结合，通过测定酶反应产 物的颜色可以（间接）反应一抗和抗原的结合情况，进而计算出抗 原或抗体的量。见图b
夹心法：
是先将未标记的抗体包被在酶标板上，用于捕获抗原，再用酶标 的抗体与抗原反应形成抗体-抗原-酶标抗体复合物；也可以象间接 法一样应用酶标二抗和抗体-抗原-抗体复合物结合，形成抗体-抗原抗体-酶标二抗复合物，见图C。前者称为直接夹心法，后者称为间 接夹心法。
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Western Blot 基本原理
• 经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例 如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸 附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学 活性不变。
• 以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗 体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反 应，经过底物显色或放射自显影以检测特定蛋白质的 表达情况。
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6
பைடு நூலகம்
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7
ELISA基本的实验过程
• 包被：将已知抗原或抗体通过物理吸附到固相载 体表面，使抗原或抗体固相化
• 抗原抗体反应：先后加入被检标本和酶结合物， 使之与固相抗原或抗体发生免疫反应而被结合固 定
• 酶促反应：在反应体系中加入酶作用的底物，使 发生酶促反应而显色
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8
ELISA基本的实验过程
特点：凝胶浓度越大，交联度越大，凝胶孔径越小。
故根据分离蛋白质的大小选择不同浓度的凝胶。
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聚丙烯酰胺凝胶的特点
优点：聚丙烯酰胺凝胶电泳具有机械强度好、弹性大、
透明、化学稳定性高、无电渗作用、设备简单、 用样量少(1～100μg)和分辨率高等优点。
用途：蛋白质，核酸等物质的分离、定性和定量分析。
第四节 目的基因表达产物检测 与分离纯化
一、外源目的基因表达产物的检测
外源目的基因的表达包括转录和翻译两个阶 段。外源基因表达产物的检测过程就是对特异 性mRNA或蛋白质的检测。
特异性mRNA的检测: Northern杂交 特异性蛋白质的检测: ELISA, Western杂交
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1.Northern 印迹杂交(Northern blot)
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聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）的原理
聚丙烯酰胺凝胶的组成及特点
组成：主要由丙烯酰胺(Acr)和交联剂N,N’-甲叉(亚甲基)
双丙烯酰胺(Bis)聚合而成。
聚合：单独或混合时稳定，出现自由基团时会聚合。
化学法的引发剂：过硫酸铵（APS or AP)， 催化剂：四甲基乙二胺（TEMED)
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3. Western Blot
要检测一个基因的表达产物是否正确，或者比 较表达产物量的相对变化，首选方法是Western Blot。
Western blot 是生物学、生物化学、分子生物 学和免疫遗传学中常用的一种实验方法。
Western blot整个过程主要包括：PAGE电泳、 转膜及蛋白检测3个阶段。
1B. In the indirect detection method, unlabeled primary antibody binds to the
antigen. Then, a labeled secondary antibody binds to the primary antibody and
的量直接相关
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4
ELISA原理图
②酶标记的抗原或抗体（标记物）
③酶作用的底物（显色剂）
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①固相的抗原或抗体（免疫吸附剂）
5
ELISA可以分为直接法、间接法和夹心法等几种。
直接法：
直接法是指酶标抗原或抗体直接与包被在酶标板上的抗体或抗原 结合形成酶标抗原—抗体复合物，加入酶反应底物，测定产物的吸 光值，计算出包被在酶标上的抗体或抗原的量。见图a
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Western blot基本原理
A. Direct Detection
B. Indirect Detection
Figure 1A. In the direct detection method, labeled primary antibody binds to
antigen on the membrane and reacts with substrate, creating a detectable signal.
– 靶核酸：RNA – RNA电泳: 在变性条件下进行,以去除RNA中的
二级结构,保证RNA完全按分子大小分离。 变性电泳主要有3种:乙二醛变性电泳、甲醛变 性电泳和羟甲基汞变性电泳。 – 转膜：不需变性
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2.ELISA
1971年瑞典学者 Engvall 和Perlmann， 荷兰学者Van Weeman和 Schuurs分别报道 将免疫技术发展为检测体液中微量物质的固 相免疫测定方法，称为酶联免疫吸附实验 （Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay, ELISA）。
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ELISA原理
• 使抗原或抗体结合到某种固相载体表面，并保持 其免疫活性
• 使抗原或抗体与某种酶连接成酶标抗原或抗体， 这种酶标抗原或抗体既保留其免疫活性，又保留 酶的活性
• 结合在固相载体上的酶量与标本中受检物质的量 成一定的比例。加入酶反应的底物后，底物被酶 催化变为有色产物，产物的量与标本中受检物质
1-D gels
2-D gels
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Transfer(Wet tank transfer system and Semi-dry transfer system)
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19
Blocking and Detection
reacts with the substrate.
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Western Blot操作的过程
• 蛋白样品的制 备
• SDS聚丙烯酰胺 凝胶电泳
转膜 封闭 一抗杂交 二抗杂交 底物显色
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Gel electrophoresis
Tips: Separate proteins by gel electrophoresis
间接法：
是将酶标记在二抗上，当抗体（一抗）和包被在酶标板的抗原结 合形成复合物后，再以酶标二抗和复合物结合，通过测定酶反应产 物的颜色可以（间接）反应一抗和抗原的结合情况，进而计算出抗 原或抗体的量。见图b
夹心法：
是先将未标记的抗体包被在酶标板上，用于捕获抗原，再用酶标 的抗体与抗原反应形成抗体-抗原-酶标抗体复合物；也可以象间接 法一样应用酶标二抗和抗体-抗原-抗体复合物结合，形成抗体-抗原抗体-酶标二抗复合物，见图C。前者称为直接夹心法，后者称为间 接夹心法。
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Western Blot 基本原理
• 经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例 如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸 附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学 活性不变。
• 以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗 体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反 应，经过底物显色或放射自显影以检测特定蛋白质的 表达情况。
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ELISA基本的实验过程
• 包被：将已知抗原或抗体通过物理吸附到固相载 体表面，使抗原或抗体固相化
• 抗原抗体反应：先后加入被检标本和酶结合物， 使之与固相抗原或抗体发生免疫反应而被结合固 定
• 酶促反应：在反应体系中加入酶作用的底物，使 发生酶促反应而显色
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ELISA基本的实验过程
特点：凝胶浓度越大，交联度越大，凝胶孔径越小。
故根据分离蛋白质的大小选择不同浓度的凝胶。
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聚丙烯酰胺凝胶的特点
优点：聚丙烯酰胺凝胶电泳具有机械强度好、弹性大、
透明、化学稳定性高、无电渗作用、设备简单、 用样量少(1～100μg)和分辨率高等优点。
用途：蛋白质，核酸等物质的分离、定性和定量分析。
第四节 目的基因表达产物检测 与分离纯化
一、外源目的基因表达产物的检测
外源目的基因的表达包括转录和翻译两个阶 段。外源基因表达产物的检测过程就是对特异 性mRNA或蛋白质的检测。
特异性mRNA的检测: Northern杂交 特异性蛋白质的检测: ELISA, Western杂交
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1.Northern 印迹杂交(Northern blot)
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聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）的原理
聚丙烯酰胺凝胶的组成及特点
组成：主要由丙烯酰胺(Acr)和交联剂N,N’-甲叉(亚甲基)
双丙烯酰胺(Bis)聚合而成。
聚合：单独或混合时稳定，出现自由基团时会聚合。
化学法的引发剂：过硫酸铵（APS or AP)， 催化剂：四甲基乙二胺（TEMED)
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3. Western Blot
要检测一个基因的表达产物是否正确，或者比 较表达产物量的相对变化，首选方法是Western Blot。
Western blot 是生物学、生物化学、分子生物 学和免疫遗传学中常用的一种实验方法。
Western blot整个过程主要包括：PAGE电泳、 转膜及蛋白检测3个阶段。
1B. In the indirect detection method, unlabeled primary antibody binds to the
antigen. Then, a labeled secondary antibody binds to the primary antibody and
的量直接相关
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ELISA原理图
②酶标记的抗原或抗体（标记物）
③酶作用的底物（显色剂）
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①固相的抗原或抗体（免疫吸附剂）
5
ELISA可以分为直接法、间接法和夹心法等几种。
直接法：
直接法是指酶标抗原或抗体直接与包被在酶标板上的抗体或抗原 结合形成酶标抗原—抗体复合物，加入酶反应底物，测定产物的吸 光值，计算出包被在酶标上的抗体或抗原的量。见图a
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Western blot基本原理
A. Direct Detection
B. Indirect Detection
Figure 1A. In the direct detection method, labeled primary antibody binds to
antigen on the membrane and reacts with substrate, creating a detectable signal.