pET-48b(+)大肠杆菌表达载体说明
大肠杆菌表达操作规程
大肠杆菌表达操作规程大肠杆菌表达操作规程一、实验材料和仪器准备1. 大肠杆菌菌株：选择适合表达目标蛋白的大肠杆菌菌株，如BL21(DE3)、Rosetta(DE3)等。
2. 表达载体：选择适合目标蛋白表达的载体，如pET 系列、pBAD系列等。
3. 目标蛋白基因：基因可以通过PCR扩增获得，或者从其他载体中克隆。
4. 培养基：溶液制备LB培养基，配制好含有适当抗生素的LB琼脂板，另外还需要制备适用于大肠杆菌表达的诱导培养基，如TB、SB等。
5. 抗生素：根据载体的需要，选用适当浓度的抗生素。
二、诱导表达实验操作流程1. 预先培养：取一株原始菌落接种到含有适当抗生素的LB液体培养基中，为了避免突变株的污染，建议每次都从冷冻保存的单一菌落开始。
培养条件为37℃，180rpm，过夜培养。
2. 选取合适菌液接种量：从过夜的预培养液中取2ml，用于接种适当量的诱导培养基。
3. 诱导表达：根据所用的表达载体，将接种量转移到含有适当抗生素的诱导培养基中，继续培养。
4. 培养条件：培养条件根据所选表达载体的要求进行设置，一般为37℃，180rpm。
5. 收集细胞：在适当的时间点，如在菌液浓度达到指定值或培养时间达到一定程度后，通过离心收集细胞。
6. 细胞破碎：采用适当的方法破碎细胞膜，如超声波破碎、冻融法等。
7. 蛋白质提取：以适当的缓冲液提取目标蛋白质。
8. 蛋白质纯化：采用各种纯化方法（如亲和层析法、凝胶过滤法等）对蛋白质进行纯化。
9. 检测和分析：对蛋白质进行SDS-PAGE、Western blot等分析方法进行检测。
三、注意事项1. 培养条件的控制：控制好培养温度、转速和时间等条件，以保证表达的效果。
2. 抗生素浓度的选择：根据所用载体对抗生素的要求，选择适当的浓度以抑制非目标菌株的生长。
3. 提取和纯化条件的选择：选择适当的缓冲液、酶和抑制剂，以保持目标蛋白的活性和稳定性。
4. 实验材料的无菌处理：所有实验材料（包括培养基、平板、显微镜片等）都要经过严格的无菌处理，以防止外源性污染。
chapter 04 表达载体
该细胞株是目前应用最广泛的哺乳动物基因表达受体细胞 之一，已有多种外源基因如人组织型纤溶酶原激活剂（tPA）、 干扰素β、干扰素γ 、凝血因子Ⅷ等在CHO细胞中得到表达。
COS细胞
它来源于非洲绿猴肾细胞系，能组成性表达SV40的大T 抗原。
COS细胞的特点： ①细胞来源丰富；
②细胞易于培养和转染；
启动子和增强子
长为100～200bp，位于转录起始位点上游，一般由核心启动 子和上游启动子两部分组成。
目前构建的哺乳动物基因表达载体的启动子，主要来源于病 毒，如SV40早期和晚期转录启动子、腺病毒晚期启动子等。
病毒载体的增强子位于转录起始位点的上游，它可大幅 度提高启动子的转录水平。多数增强子具有宿主特异性。
常用的加poly(A)信号来自SV40，它是一段长为237bp的 BamH I-Bcl I限制酶酶切片段，它同时含有早期转录和晚期 转录单位的切割信号与加poly(A)信号。
剪接信号
mRNA剪接所必需的最短序列位于内含子5 ′和3 ′边界上。 在构建真核表达载体时都组入一个SV40的内含子，利用该内含 子及其剪接信号构建的载体，表达外源基因的水平比普通的载 体要高。 GT-AG法则
鼠骨髓瘤细胞的特点：
①细胞易于培养和转染，可在无血清培 养基中进行高密度悬浮培养； ②能进行分泌表达，且表达量高； ③能对蛋白质进行糖基化修饰。
提高哺乳动物基因表达系统表达效率的策略
（1）设法提高外源基因的表达水平和产量
方法包括：
①载体启动子的强度和宿主范围，是外源基因高表达 的关键因素之一，选择强启动子可获得高效表达。
pET-39b(+)大肠杆菌表达载体说明
pET-39b(+)编号 载体名称北京华越洋生物VECT5020 pET-‐39b(+)pET39b载体基本信息别名: pET39b, p et 39b质粒类型: 大肠杆菌蛋白表达表达水平: 高克隆方法: 多克隆位点，限制性内切酶载体大小: 6106 b p5' 测序引物: T75' 测序引物序列: T7: 5'-‐TAATACGACTCACTATAGGG-‐3'载体标签: His (中间和C端), N-‐DsbA, N-‐S, N-‐EK, N-‐Thrombin载体抗性: Kanamycin备注: Encodes D sb t ag f or e xport a nd p eriplasmic f olding o f t arget p roteins. 稳定性: 瞬时表达 Transient组成型: 组成型 Constitutive病毒/非病毒: 非病毒pET39b载体质粒图谱和多克隆位点信息Feature N ame Start EndT7_terminator 120 1T7_Terminal_primer 69 87EK 266 252S15 326 2826xHIS 386 369T7_transl_en_RBS 1056 1040lacO 1101 1074T7_promoter 1119 1101tet (300 -‐ 563) 1155 1418pBRrevBam_primer 1226 1207lacI 1501 2592tet (576 -‐ 851) 2651 2926ROP 3401 3592pGEX_3_primer 3608 3586pBR322_origin 4626 4007KanR2 4732 5547ORF Start EndORF f rame 3 1031 147ORF Start EndORF f rame 3 1032 1760ORF f rame 1 1633 2592ORF f rame 1 4732 5547Enzyme N ame CutXhoI 174NotI 182EagI 182HindIII 189SalI 195SacI 206EcoRI 208BamHI 214NcoI 227KpnI 271BstBI 301SacII 365SpeI 396AflII 418PstI 552AscI 917AgeI 928NdeI 1030XbaI 1068BclI 1874ApaI 2071FspI 2942NruI 4820pET39b载体简介The pET-‐39b(+) vector (Cat. No. 70090-‐3) is designed for expression of DsbA fusion proteins. Unique sites are shown on the circle map. Note that the sequence is numbered by t he p BR322 c onvention, s o t he T7 e xpression r egion i s r eversed o n t he c ircle m ap. T he cloning/expression region of the coding strand transcribed by T7 RNA polymerase is shown below. The f1 origin is oriented so that infection with helper phage will produce virions containing single stranded DNA that corresponds to the coding strand. Therefore, single s tranded s equencing s hould b e p erformed u sing t he T7 t erminator p rimer (Cat. N o. 69337-‐3).pET39b载体序列ORIGIN1 ATCCGGATAT AGTTCCTCCT TTCAGCAAAA AACCCCTCAA GACCCGTTTA GAGGCCCCAA 61 GGGGTTATGC TAGTTATTGC TCAGCGGTGG CAGCAGCCAA CTCAGCTTCC TTTCGGGCTT 121 TGTTTAGCAG CCTAGGTATT AATCAATTAG TGGTGGTGGT GGTGGTGGTG GTGCTCGAGT181 GCGGCCGCAA GCTTGTCGAC GGAGCTCGAA TTCGGATCCG ATATCGCCAT GGTTGAGGAG 241 AAGCCCGGGC TCTTGTCGTC GTCATCGGTA CCCAGATCTG GGCTGTCCAT GTGCTGGCGT 301 TCGAATTTAG CAGCAGCGGT TTCTTTCATA CCAATTGCAG TACTACCGCG TGGCACCAGA 361 CCCGCGGAGT GATGGTGATG GTGATGACCA GAACCACTAG TTGATCCTTT TTTCTCGCTT 421 AAGTATTTCA CTGTATCAGC ATACTGCTGA ACAAAAACAT CCATATTGCT GGTATCCATA 481 CCCTGCGGAT TCAGCTGATA TTTACCGTTA ACAAACATCG CCGGAACGCC ACGCAATTGC 541 ACGTCAGCTG CAGCTTTTTC CTGCTGAGCG ACCAGAGATT TCACCACGAA GCTGTTCCAC 601 GCCGCGTCGT ACTCTTCACC TTTAATACCT GCGTTGATAA ATACATCGCG GATATCAGAA 661 GCAGAACGAA TGGTCTGGGT TTTCTGTACG CCTTCAAACA GCGGAACAGT CACTTTGTCT 721 TCCACGCCCA GCGCCATCGC CACAGCCCAT GCCTGAGTCA GATCTTTGCC CAGGTCACCA 781 CCCATGAAGT TGACGTGGTA TTTAGTCATC TTCACGCCTT CCGGCAGTTT TTTCTTCACA 841 TTATCAGAAA TATGCAGAAC TTCTTCAAAC TGATAGCAGT GCGGGCAGAA GAAAGAGAAA 901 AACTCCAGCA CTTGCGGCGC GCCAGCTACC GGTTTTTCCA GGGTAGTGTA CTGTTTACCA 961 TCTTCATACT GCGCCGCCGA TGCGCTAAAC GCTAAAACTA AACCAGCCAG CGCCAGCCAA 1021 ATCTTTTTCA TATGTATATC TCCTTCTTAA AGTTAAACAA AATTATTTCT AGAGGGGAAT 1081 TGTTATCCGC TCACAATTCC CCTATAGTGA GTCGTATTAA TTTCGCGGGA TCGAGATCGA 1141 TCTCGATCCT CTACGCCGGA CGCATCGTGG CCGGCATCAC CGGCGCCACA GGTGCGGTTG 1201 CTGGCGCCTA TATCGCCGAC ATCACCGATG GGGAAGATCG GGCTCGCCAC TTCGGGCTCA 1261 TGAGCGCTTG TTTCGGCGTG GGTATGGTGG CAGGCCCCGT GGCCGGGGGA CTGTTGGGCG 1321 CCATCTCCTT GCATGCACCA TTCCTTGCGG CGGCGGTGCT CAACGGCCTC AACCTACTAC 1381 TGGGCTGCTT CCTAATGCAG GAGTCGCATA AGGGAGAGCG TCGAGATCCC GGACACCATC 1441 GAATGGCGCA AAACCTTTCG CGGTATGGCA TGATAGCGCC CGGAAGAGAG TCAATTCAGG 1501 GTGGTGAATG TGAAACCAGT AACGTTATAC GATGTCGCAG AGTATGCCGG TGTCTCTTAT 1561 CAGACCGTTT CCCGCGTGGT GAACCAGGCC AGCCACGTTT CTGCGAAAAC GCGGGAAAAA 1621 GTGGAAGCGG CGATGGCGGA GCTGAATTAC ATTCCCAACC GCGTGGCACA ACAACTGGCG 1681 GGCAAACAGT CGTTGCTGAT TGGCGTTGCC ACCTCCAGTC TGGCCCTGCA CGCGCCGTCG 1741 CAAATTGTCG CGGCGATTAA ATCTCGCGCC GATCAACTGG GTGCCAGCGT GGTGGTGTCG 1801 ATGGTAGAAC GAAGCGGCGT CGAAGCCTGT AAAGCGGCGG TGCACAATCT TCTCGCGCAA 1861 CGCGTCAGTG GGCTGATCAT TAACTATCCG CTGGATGACC AGGATGCCAT TGCTGTGGAA 1921 GCTGCCTGCA CTAATGTTCC GGCGTTATTT CTTGATGTCT CTGACCAGAC ACCCATCAAC 1981 AGTATTATTT TCTCCCATGA AGACGGTACG CGACTGGGCG TGGAGCATCT GGTCGCATTG 2041 GGTCACCAGC AAATCGCGCT GTTAGCGGGC CCATTAAGTT CTGTCTCGGC GCGTCTGCGT 2101 CTGGCTGGCT GGCATAAATA TCTCACTCGC AATCAAATTC AGCCGATAGC GGAACGGGAA 2161 GGCGACTGGA GTGCCATGTC CGGTTTTCAA CAAACCATGC AAATGCTGAA TGAGGGCATC 2221 GTTCCCACTG CGATGCTGGT TGCCAACGAT CAGATGGCGC TGGGCGCAAT GCGCGCCATT 2281 ACCGAGTCCG GGCTGCGCGT TGGTGCGGAC ATCTCGGTAG TGGGATACGA CGATACCGAA 2341 GACAGCTCAT GTTATATCCC GCCGTTAACC ACCATCAAAC AGGATTTTCG CCTGCTGGGG 2401 CAAACCAGCG TGGACCGCTT GCTGCAACTC TCTCAGGGCC AGGCGGTGAA GGGCAATCAG 2461 CTGTTGCCCG TCTCACTGGT GAAAAGAAAA ACCACCCTGG CGCCCAATAC GCAAACCGCC 2521 TCTCCCCGCG CGTTGGCCGA TTCATTAATG CAGCTGGCAC GACAGGTTTC CCGACTGGAA 2581 AGCGGGCAGT GAGCGCAACG CAATTAATGT AAGTTAGCTC ACTCATTAGG CACCGGGATC 2641 TCGACCGATG CCCTTGAGAG CCTTCAACCC AGTCAGCTCC TTCCGGTGGG CGCGGGGCAT 2701 GACTATCGTC GCCGCACTTA TGACTGTCTT CTTTATCATG CAACTCGTAG GACAGGTGCC 2761 GGCAGCGCTC TGGGTCATTT TCGGCGAGGA CCGCTTTCGC TGGAGCGCGA CGATGATCGG2821 CCTGTCGCTT GCGGTATTCG GAATCTTGCA CGCCCTCGCT CAAGCCTTCG TCACTGGTCC 2881 CGCCACCAAA CGTTTCGGCG AGAAGCAGGC CATTATCGCC GGCATGGCGG CCCCACGGGT 2941 GCGCATGATC GTGCTCCTGT CGTTGAGGAC CCGGCTAGGC TGGCGGGGTT GCCTTACTGG 3001 TTAGCAGAAT GAATCACCGA TACGCGAGCG AACGTGAAGC GACTGCTGCT GCAAAACGTC 3061 TGCGACCTGA GCAACAACAT GAATGGTCTT CGGTTTCCGT GTTTCGTAAA GTCTGGAAAC 3121 GCGGAAGTCA GCGCCCTGCA CCATTATGTT CCGGATCTGC ATCGCAGGAT GCTGCTGGCT 3181 ACCCTGTGGA ACACCTACAT CTGTATTAAC GAAGCGCTGG CATTGACCCT GAGTGATTTT 3241 TCTCTGGTCC CGCCGCATCC ATACCGCCAG TTGTTTACCC TCACAACGTT CCAGTAACCG 3301 GGCATGTTCA TCATCAGTAA CCCGTATCGT GAGCATCCTC TCTCGTTTCA TCGGTATCAT 3361 TACCCCCATG AACAGAAATC CCCCTTACAC GGAGGCATCA GTGACCAAAC AGGAAAAAAC 3421 CGCCCTTAAC ATGGCCCGCT TTATCAGAAG CCAGACATTA ACGCTTCTGG AGAAACTCAA 3481 CGAGCTGGAC GCGGATGAAC AGGCAGACAT CTGTGAATCG CTTCACGACC ACGCTGATGA 3541 GCTTTACCGC AGCTGCCTCG CGCGTTTCGG TGATGACGGT GAAAACCTCT GACACATGCA 3601 GCTCCCGGAG ACGGTCACAG CTTGTCTGTA AGCGGATGCC GGGAGCAGAC AAGCCCGTCA 3661 GGGCGCGTCA GCGGGTGTTG GCGGGTGTCG GGGCGCAGCC ATGACCCAGT CACGTAGCGA 3721 TAGCGGAGTG TATACTGGCT TAACTATGCG GCATCAGAGC AGATTGTACT GAGAGTGCAC 3781 CATATATGCG GTGTGAAATA CCGCACAGAT GCGTAAGGAG AAAATACCGC ATCAGGCGCT 3841 CTTCCGCTTC CTCGCTCACT GACTCGCTGC GCTCGGTCGT TCGGCTGCGG CGAGCGGTAT 3901 CAGCTCACTC AAAGGCGGTA ATACGGTTAT CCACAGAATC AGGGGATAAC GCAGGAAAGA 3961 ACATGTGAGC AAAAGGCCAG CAAAAGGCCA GGAACCGTAA AAAGGCCGCG TTGCTGGCGT 4021 TTTTCCATAG GCTCCGCCCC CCTGACGAGC ATCACAAAAA TCGACGCTCA AGTCAGAGGT 4081 GGCGAAACCC GACAGGACTA TAAAGATACC AGGCGTTTCC CCCTGGAAGC TCCCTCGTGC 4141 GCTCTCCTGT TCCGACCCTG CCGCTTACCG GATACCTGTC CGCCTTTCTC CCTTCGGGAA 4201 GCGTGGCGCT TTCTCATAGC TCACGCTGTA GGTATCTCAG TTCGGTGTAG GTCGTTCGCT 4261 CCAAGCTGGG CTGTGTGCAC GAACCCCCCG TTCAGCCCGA CCGCTGCGCC TTATCCGGTA 4321 ACTATCGTCT TGAGTCCAAC CCGGTAAGAC ACGACTTATC GCCACTGGCA GCAGCCACTG 4381 GTAACAGGAT TAGCAGAGCG AGGTATGTAG GCGGTGCTAC AGAGTTCTTG AAGTGGTGGC 4441 CTAACTACGG CTACACTAGA AGGACAGTAT TTGGTATCTG CGCTCTGCTG AAGCCAGTTA 4501 CCTTCGGAAA AAGAGTTGGT AGCTCTTGAT CCGGCAAACA AACCACCGCT GGTAGCGGTG 4561 GTTTTTTTGT TTGCAAGCAG CAGATTACGC GCAGAAAAAA AGGATCTCAA GAAGATCCTT 4621 TGATCTTTTC TACGGGGTCT GACGCTCAGT GGAACGAAAA CTCACGTTAA GGGATTTTGG 4681 TCATGAACAA TAAAACTGTC TGCTTACATA AACAGTAATA CAAGGGGTGT TATGAGCCAT 4741 ATTCAACGGG AAACGTCTTG CTCTAGGCCG CGATTAAATT CCAACATGGA TGCTGATTTA 4801 TATGGGTATA AATGGGCTCG CGATAATGTC GGGCAATCAG GTGCGACAAT CTATCGATTG 4861 TATGGGAAGC CCGATGCGCC AGAGTTGTTT CTGAAACATG GCAAAGGTAG CGTTGCCAAT 4921 GATGTTACAG ATGAGATGGT CAGACTAAAC TGGCTGACGG AATTTATGCC TCTTCCGACC 4981 ATCAAGCATT TTATCCGTAC TCCTGATGAT GCATGGTTAC TCACCACTGC GATCCCCGGG 5041 AAAACAGCAT TCCAGGTATT AGAAGAATAT CCTGATTCAG GTGAAAATAT TGTTGATGCG 5101 CTGGCAGTGT TCCTGCGCCG GTTGCATTCG ATTCCTGTTT GTAATTGTCC TTTTAACAGC 5161 GATCGCGTAT TTCGTCTCGC TCAGGCGCAA TCACGAATGA ATAACGGTTT GGTTGATGCG 5221 AGTGATTTTG ATGACGAGCG TAATGGCTGG CCTGTTGAAC AAGTCTGGAA AGAAATGCAT 5281 AAACTTTTGC CATTCTCACC GGATTCAGTC GTCACTCATG GTGATTTCTC ACTTGATAAC 5341 CTTATTTTTG ACGAGGGGAA ATTAATAGGT TGTATTGATG TTGGACGAGT CGGAATCGCA 5401 GACCGATACC AGGATCTTGC CATCCTATGG AACTGCCTCG GTGAGTTTTC TCCTTCATTA5461 CAGAAACGGC TTTTTCAAAA ATATGGTATT GATAATCCTG ATATGAATAA ATTGCAGTTT 5521 CATTTGATGC TCGATGAGTT TTTCTAAGAA TTAATTCATG AGCGGATACA TATTTGAATG 5581 TATTTAGAAA AATAAACAAA TAGGGGTTCC GCGCACATTT CCCCGAAAAG TGCCACCTGA 5641 AATTGTAAAC GTTAATATTT TGTTAAAATT CGCGTTAAAT TTTTGTTAAA TCAGCTCATT 5701 TTTTAACCAA TAGGCCGAAA TCGGCAAAAT CCCTTATAAA TCAAAAGAAT AGACCGAGAT 5761 AGGGTTGAGT GTTGTTCCAG TTTGGAACAA GAGTCCACTA TTAAAGAACG TGGACTCCAA 5821 CGTCAAAGGG CGAAAAACCG TCTATCAGGG CGATGGCCCA CTACGTGAAC CATCACCCTA 5881 ATCAAGTTTT TTGGGGTCGA GGTGCCGTAA AGCACTAAAT CGGAACCCTA AAGGGAGCCC 5941 CCGATTTAGA GCTTGACGGG GAAAGCCGGC GAACGTGGCG AGAAAGGAAG GGAAGAAAGC 6001 GAAAGGAGCG GGCGCTAGGG CGCTGGCAAG TGTAGCGGTC ACGCTGCGCG TAACCACCAC 6061 ACCCGCCGCG CTTAATGCGC CGCTACAGGG CGCGTCCCAT TCGCCA//其他大肠杆菌表达载体：pBV221 ptdTomato pET-52b(+) pAmCyanpDsRed-Express2 pBV220 pCold-GST pColdS-SUMOpCold TF pCold IV pCold III pCold IIpCold I pE-SUMO pCold-ProS2 pBAD102/D-TOPOpBAD202/D-TOPO pACYC184 pBAD/Thio-TOPO pBad/Myc-His CpBad/Myc-His B pBad/Myc-His A pBad/His C pBad/His BpBad/His A pBAD-TOPO pET-23b(+) pET-23a(+)pET-23c(+) pET-23(+) pET-12b(+) pET-12c(+)pET-12a(+) pET-11b(+) pET-11a(+) pET-11c(+)pBad24 pQE-82L pQE-81L pQE-80LpQE-32 pQE-9 pQE-16 pQE-31pQE-60 pQE-70 pQE-40 pET-51b(+)pET-50b(+) pET-49b(+) pET-48b(+) pET-47b(+)pET-26b(+) pET-32a(+) pET-21b(+) pET-22b(+)pET-14b pET-16b pET-15b pET-19bpET-20b(+) pET-21d(+) pET-21c(+) pET-21b(+)pET-21a(+) pET-24a(+) pET-24d(+) pET-25b(+)pET-27b(+) pET-28a(+) pET-30a(+) pET-42a(+)pET-43.1c(+) pET-43.1b(+) pET-43.1a(+) pET-44a(+)pET-44c(+) pET-46 EK/LIC pET-37b(+) pTrcHis2 CpTrcHis2 B pTrcHis2 A pET303/CT-His pET302/NT-His pRSET-CFP pRSET-EmGFP pRSET-BFP pGFPuvpET300/NT-DEST pET301/CT-DEST pGEM-T pBad43pGEX-4T-3 pGEX-5X-2 pBlueScript SK(+) pG-Tf2pG-KJE8 pGro7 pET-SUMO pSE380pET-17b pET102/D-TOPO pCDFDuet-1 pMAL-p5xpTf16 pET-28c(+) pBluescript II SK(+) pET-30b(+)pSUMO pProEX HTc pProEX HTb pProEX HTapKD3 pKD13 pKD46 pTYB1pTYB2 pTWIN2 pBluescript II KS(-) pTYB12pMAL-p5e pACYCDuet-1 pEGM-11ZF(+) pEGM-7ZF(+) PinPoint Xa-3 PinPoint Xa-2 PinPoint Xa-1 pSP73pSP64 pTWIN1 pTYB11 pTXB1pET-5b(+) pBad/gIII C pBad/gIII B pBad/gIII A pET-5a(+) pMal-p4X pMal-p2G pkk223-3pkk232-8 pCYB1 pEZZ18 pBAD18pMAL-c5x pMal-p2E pMal-p2X pET-44 EK/LIC pET-43.1 EK/LIC pET-41 EK/LIC pMal-c4X pTrcHis BpET-31b(+) pET-3b(+) pET-41a(+) pGEX-3XpGEX-4T-2 pETDuet-1 pGEX-4T-1 pTrc99apET-28b(+) pET-His pALEX a,b,c pACYC177pBR322 pKD4 pKD20 pMXB10pEcoli-6xHN-GFPuv pKJE7 pRSET B pGEX-KGpGEX-2T pRSFDuet-1 pCOLADuet-1 pTrcHis C pTrcHis A pET-41b(+) pET-42b(+) pET-3a(+) pGEX-6P-3 pGEX-6P-2 pGEX-6P-1 pGEX-5X-3 pGEX-5X-1 pGEX-2TK pRSET A pMal-c2GpMal-c2E pMal-c2X pRSET C pQE-30pET-45b(+) pET-44b(+) pET-42c(+) pET-41c(+) pET-40b(+) pET-33b(+) pET-39b(+) pET-32 EK/LIC pET-32 Xa/LIC pET-32c(+) pET-32b(+) pET-30 Xa/LIC pET-30 EK/LIC pET-30c(+) pET-29c(+) pET-29b(+) pET-29a(+) pET-24c(+) pET-24b(+) pET-24(+)pET-23d(+) pET-11d(+) pBad33。
常用大肠杆菌基础信息及使用说明
常用大肠杆菌基础信息及使用说明菌株目录BL21 (2)BL21(DE3) (4)BL21(DE3)pLysS (6)BL21 Star(DE3) (8)BL21(AI) (10)OverExpress C43(DE3) (13)M15(pREP4) (15)CopyCutter EPI400 (16)Rosetta(DE3) (18)XL10 (20)Mach1-T1 (22)DH5a (23)TOP10 (24)BL21基因型F- dcm omp T hsd S(r B- m B-) gal产品说明作为E.coli B宿主菌，主要用来进行蛋白表达，细胞内缺少lon蛋白酶和ompT外膜蛋白酶，能够有效避免目的蛋白的降解；当使用CE6噬菌体启动子时，BL21感受态细胞对目的蛋白在未诱导情况下的蛋白表达严密控制；用于非T7启动子驱动的基因表达，表达水平极高。
操作方法1.BL21感受态细胞从-80℃拿出，迅速插入冰中，5分钟后待菌块融化，加入目的DNA（质粒或连接产物）并用手拨打EP管底轻轻混匀(避免用枪吸打)，冰中静置25分钟。
2.42℃水浴热激45秒，迅速放回冰上并静置2分钟，晃动会降低转化效率。
3.向离心管中加入700μl不含抗生素的无菌培养基(2YT或LB)，混匀后37℃，200rpm复苏60分钟。
4.5000rpm离心一分钟收菌，留取100μl左右上清轻轻吹打重悬菌块并涂布到含相应抗生素的2YT或LB培养基上。
5.将平板倒置放于37℃培养箱过夜培养。
Sample Induction Protocol (for reference only)1. Inoculate a single colony from a freshly streaked plate into 5 ml of LB medium containing the appropriate antibiotic for the plasmid and host strain.2. Incubate with shaking at 200 rpm at 37℃overnight.3. Inoculate 50 ml of LB medium containing the appropriate antibiotic with 0.5 ml of the overnight culture prepared in step 2(use the 500 ml triangular flask as the container would be better).4. Incubate with shaking at 150 rpm at 37℃until the OD 600 reaches 0.5-0.8.5. (Optional)Pipet 1ml of the cultures into clean microcentrifuge tubes and place the tubes on ice until needed for gel analysis or storage at -20℃. These will serve as the non-inducedcontrol samples.6. Add IPTG to a final concentration of 1 mM. Optimal time for induction of the target protein may vary from 2-16 hours, depending on the protein.7. Incubate with shaking at 120 rpm at 37℃for 3-4 hours. To determine the optimal time for induction of the target protein, it is recommended that a time course experiment be performed varying the induction from 2-16 hours.8. Place the culture on ice for 10 minutes. Harvest cells by centrifugation at 5,000×g for 10 min at 4℃.9. Remove the supernatant and store the cell pellet at -20℃(storage at lower temperatures is also acceptabl e).IPTGPrepare a 1 M solution of IPTG (Isopropyl-β-D-thiogalactoside; Isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside) bydissolving 2.38 g of IPTG in dd water and adjust the final volume to 10 ml. Filter sterilize before use.BL21(DE3)基因型F- omp T hsd S B(r B- m B- ) gal dcm(DE3)产品说明BL21(DE3)菌株用于高效表达克隆于含有噬菌体T7启动子的表达载体(如pET系列)的基因。
pBad gIII C大肠杆菌表达载体说明
pBad/gIII C编号 名称北京华越洋VECT-‐430 pBad/gIII CpBadgIII C载体基本信息载体名称: pBad/gIII C， pBadgIII C, p BadgIIIC. p Bad/gIIIC 质粒类型: 大肠杆菌蛋白表达载体表达水平: 高启动子: araBad克隆方法: 多克隆位点，限制性内切酶载体大小: 4149 b p5' 测序引物及序列: pBAD-‐F: A TGCCATAGCATTTTTATCC3' 测序引物及序列: pBAD-‐R: g atttaatctgtatcagg载体标签: N-‐GIII s ignal, C-‐His, C-‐Myc载体抗性: 氨苄备注: -‐-‐稳定性: 瞬时表达 Transient组成型: 诱导表达病毒/非病毒: 非病毒pBadgIII C载体质粒图谱和多克隆位点信息pBadgIII C载体简介pBAD/gIII载体质粒是衍生于pBR322载体。
载体设计用来在大肠杆菌中进行可调节分泌性表达和纯化重组目的蛋白。
使用基因III信号序列来定位重组蛋白，使其分泌到大肠杆菌周质腔中。
使用大肠杆菌araBAD启动子（pBAD）增强了大肠杆菌重组蛋白可溶性表达的水平。
载体上的调节蛋白AraC能够调控pBad启动子。
pBadgIII C载体序列 AAGAAACCAATTGTCCATATTGCATCAGACATTGCCGTCACTGCGTCTTTTACTGGCTCTTCTCGCTAACCA AACCGGTAACCCCGCTTATTAAAAGCATTCTGTAACAAAGCGGGACCAAAGCCATGACAAAAACGCGTAACA AAAGTGTCTATAATCACGGCAGAAAAGTCCACATTGATTATTTGCACGGCGTCACACTTTGCTATGCCATAG CATTTTTATCCATAAGATTAGCGGATCCTACCTGACGCTTTTTATCGCAACTCTCTACTGTTTCTCCATACC CGTTTTTTGGGCTAACAGGAGGAATTAACCATGAAAAAACTGCTGTTCGCGATTCCGCTGGTGGTGCCGTTC TATAGCCATAGCACCATGGCGGCCGCTCGAGATCTGCAGCTGGTACCATATGGGAATTCGAAGCTTTCTAGA ACAAAAACTCATCTCAGAAGAGGATCTGAATAGCGCCGTCGACCATCATCATCATCATCATTGAGTTTAAAC GGTCTCCAGCTTGGCTGTTTTGGCGGATGAGAGAAGATTTTCAGCCTGATACAGATTAAATCAGAACGCAGA AGCGGTCTGATAAAACAGAATTTGCCTGGCGGCAGTAGCGCGGTGGTCCCACCTGACCCCATGCCGAACTCA GAAGTGAAACGCCGTAGCGCCGATGGTAGTGTGGGGTCTCCCCATGCGAGAGTAGGGAACTGCCAGGCATCA AATAAAACGAAAGGCTCAGTCGAAAGACTGGGCCTTTCGTTTTATCTGTTGTTTGTCGGTGAACGCTCTCCT GAGTAGGACAAATCCGCCGGGAGCGGATTTGAACGTTGCGAAGCAACGGCCCGGAGGGTGGCGGGCAGGACG CCCGCCATAAACTGCCAGGCATCAAATTAAGCAGAAGGCCATCCTGACGGATGGCCTTTTTGCGTTTCTACA AACTCTTTTTGTTTATTTTTCTAAATACATTCAAATATGTATCCGCTCATGAGACAATAACCCTGATAAATG CTTCAATAATATTGAAAAAGGAAGAGTATGAGTATTCAACATTTCCGTGTCGCCCTTATTCCCTTTTTTGCGGCATTTTGCCTTCCTGTTTTTGCTCACCCAGAAACGCTGGTGAAAGTAAAAGATGCTGAAGATCAGTTGGGTGCACGAGTGGGTTACATCGAACTGGATCTCAACAGCGGTAAGATCCTTGAGAGTTTTCGCCCCGAAGAACGT TTTCCAATGATGAGCACTTTTAAAGTTCTGCTATGTGGCGCGGTATTATCCCGTGTTGACGCCGGGCAAGAG CAACTCGGTCGCCGCATACACTATTCTCAGAATGACTTGGTTGAGTACTCACCAGTCACAGAAAAGCATCTT ACGGATGGCATGACAGTAAGAGAATTATGCAGTGCTGCCATAACCATGAGTGATAACACTGCGGCCAACTTA CTTCTGACAACGATCGGAGGACCGAAGGAGCTAACCGCTTTTTTGCACAACATGGGGGATCATGTAACTCGC CTTGATCGTTGGGAACCGGAGCTGAATGAAGCCATACCAAACGACGAGCGTGACACCACGATGCCTGTAGCA ATGGCAACAACGTTGCGCAAACTATTAACTGGCGAACTACTTACTCTAGCTTCCCGGCAACAATTAATAGAC TGGATGGAGGCGGATAAAGTTGCAGGACCACTTCTGCGCTCGGCCCTTCCGGCTGGCTGGTTTATTGCTGAT AAATCTGGAGCCGGTGAGCGTGGGTCTCGCGGTATCATTGCAGCACTGGGGCCAGATGGTAAGCCCTCCCGT ATCGTAGTTATCTACACGACGGGGAGTCAGGCAACTATGGATGAACGAAATAGACAGATCGCTGAGATAGGT GCCTCACTGATTAAGCATTGGTAACTGTCAGACCAAGTTTACTCATATATACTTTAGATTGATTTAAAACTT CATTTTTAATTTAAAAGGATCTAGGTGAAGATCCTTTTTGATAATCTCATGACCAAAATCCCTTAACGTGAG TTTTCGTTCCACTGAGCGTCAGACCCCGTAGAAAAGATCAAAGGATCTTCTTGAGATCCTTTTTTTCTGCGC GTAATCTGCTGCTTGCAAACAAAAAAACCACCGCTACCAGCGGTGGTTTGTTTGCCGGATCAAGAGCTACCA ACTCTTTTTCCGAAGGTAACTGGCTTCAGCAGAGCGCAGATACCAAATACTGTCCTTCTAGTGTAGCCGTAG TTAGGCCACCACTTCAAGAACTCTGTAGCACCGCCTACATACCTCGCTCTGCTAATCCTGTTACCAGTGGCT GCTGCCAGTGGCGATAAGTCGTGTCTTACCGGGTTGGACTCAAGACGATAGTTACCGGATAAGGCGCAGCGG TCGGGCTGAACGGGGGGTTCGTGCACACAGCCCAGCTTGGAGCGAACGACCTACACCGAACTGAGATACCTA CAGCGTGAGCTATGAGAAAGCGCCACGCTTCCCGAAGGGAGAAAGGCGGACAGGTATCCGGTAAGCGGCAGG GTCGGAACAGGAGAGCGCACGAGGGAGCTTCCAGGGGGAAACGCCTGGTATCTTTATAGTCCTGTCGGGTTT CGCCACCTCTGACTTGAGCGTCGATTTTTGTGATGCTCGTCAGGGGGGCGGAGCCTATGGAAAAACGCCAGC AACGCGGCCTTTTTACGGTTCCTGGCCTTTTGCTGGCCTTTTGCTCACATGTTCTTTCCTGCGTTATCCCCT GATTCTGTGGATAACCGTATTACCGCCTTTGAGTGAGCTGATACCGCTCGCCGCAGCCGAACGACCGAGCGC AGCGAGTCAGTGAGCGAGGAAGCGGAAGAGCGCCTGATGCGGTATTTTCTCCTTACGCATCTGTGCGGTATT TCACACCGCATATGGTGCACTCTCAGTACAATCTGCTCTGATGCCGCATAGTTAAGCCAGTATACACTCCGC TATCGCTACGTGACTGGGTCATGGCTGCGCCCCGACACCCGCCAACACCCGCTGACGCGCCCTGACGGGCTT GTCTGCTCCCGGCATCCGCTTACAGACAAGCTGTGACCGTCTCCGGGAGCTGCATGTGTCAGAGGTTTTCAC CGTCATCACCGAAACGCGCGAGGCAGCAGATCAATTCGCGCGCGAAGGCGAAGCGGCATGCATAATGTGCCT GTCAAATGGACGAAGCAGGGATTCTGCAAACCCTATGCTACTCCGTCAAGCCGTCAATTGTCTGATTCGTTA CCAATTATGACAACTTGACGGCTACATCATTCACTTTTTCTTCACAACCGGCACGGAACTCGCTCGGGCTGG CCCCGGTGCATTTTTTAAATACCCGCGAGAAATAGAGTTGATCGTCAAAACCAACATTGCGACCGACGGTGG CGATAGGCATCCGGGTGGTGCTCAAAAGCAGCTTCGCCTGGCTGATACGTTGGTCCTCGCGCCAGCTTAAGA CGCTAATCCCTAACTGCTGGCGGAAAAGATGTGACAGACGCGACGGCGACAAGCAAACATGCTGTGCGACGC TGGCGATATCAAAATTGCTGTCTGCCAGGTGATCGCTGATGTACTGACAAGCCTCGCGTACCCGATTATCCA TCGGTGGATGGAGCGACTCGTTAATCGCTTCCATGCGCCGCAGTAACAATTGCTCAAGCAGATTTATCGCCA GCAGCTCCGAATAGCGCCCTTCCCCTTGCCCGGCGTTAATGATTTGCCCAAACAGGTCGCTGAAATGCGGCT GGTGCGCTTCATCCGGGCGAAAGAACCCCGTATTGGCAAATATTGACGGCCAGTTAAGCCATTCATGCCAGT AGGCGCGCGGACGAAAGTAAACCCACTGGTGATACCATTCGCGAGCCTCCGGATGACGACCGTAGTGATGAA TCTCTCCTGGCGGGAACAGCAAAATATCACCCGGTCGGCAAACAAATTCTCGTCCCTGATTTTTCACCACCC CCTGACCGCGAATGGTGAGATTGAGAATATAACCTTTCATTCCCAGCGGTCGGTCGATAAAAAAATCGAGAT AACCGTTGGCCTCAATCGGCGTTAAACCCGCCACCAGATGGGCATTAAACGAGTATCCCGGCAGCAGGGGAT CATTTTGCGCTTCAGCCATACTTTTCATACTCCCGCCATTCAGAG其他大肠杆菌表达载体：pBV221 ptdTomato pET-‐52b(+) pAmCyan pDsRed-‐Express2 pBV220 pCold-‐GST pColdS-‐SUMO pCold T F pCold I V pCold I II pCold I IpCold I pE-‐SUMO pCold-‐ProS2 pBAD102/D-‐TOPO pBAD202/D-‐TOPO pACYC184 pBAD/Thio-‐TOPO pBad/Myc-‐His C pBad/Myc-‐His B pBad/Myc-‐His A pBad/His C pBad/His B pBad/His A pBAD-‐TOPO pET-‐23b(+) pET-‐23a(+)pET-‐23c(+) pET-‐23(+) pET-‐12b(+) pET-‐12c(+)pET-‐12a(+) pET-‐11b(+) pET-‐11a(+) pET-‐11c(+) pBad24 pQE-‐82L pQE-‐81L pQE-‐80LpQE-‐32 pQE-‐9 pQE-‐16 pQE-‐31pQE-‐60 pQE-‐70 pQE-‐40 pET-‐51b(+)pET-‐50b(+) pET-‐49b(+) pET-‐48b(+) pET-‐47b(+)pET-‐26b(+) pET-‐32a(+) pET-‐21b(+) pET-‐22b(+)pET-‐14b pET-‐16b pET-‐15b pET-‐19bpET-‐20b(+) pET-‐21d(+) pET-‐21c(+) pET-‐21b(+)pET-‐21a(+) pET-‐24a(+) pET-‐24d(+) pET-‐25b(+)pET-‐27b(+) pET-‐28a(+) pET-‐30a(+) pET-‐42a(+)pET-‐43.1c(+) pET-‐43.1b(+) pET-‐43.1a(+) pET-‐44a(+)pET-‐44c(+) pET-‐46 E K/LIC pET-‐37b(+) pTrcHis2 C pTrcHis2 B pTrcHis2 A pET303/CT-‐His pET302/NT-‐His pRSET-‐CFP pRSET-‐EmGFP pRSET-‐BFP pGFPuvpET300/NT-‐DEST pET301/CT-‐DEST pGEM-‐T pBad43pGEX-‐4T-‐3 pGEX-‐5X-‐2 pBlueScript S K(+) pG-‐Tf2pG-‐KJE8 pGro7 pET-‐SUMO pSE380pET-‐17b pET102/D-‐TOPO pCDFDuet-‐1 pMAL-‐p5xpTf16 pET-‐28c(+) pBluescript I I S K(+) pET-‐30b(+) pSUMO pProEX H Tc pProEX H Tb pProEX H Ta pKD3 pKD13 pKD46 pTYB1pTYB2 pTWIN2 pBluescript I I K S(-‐) pTYB12pMAL-‐p5e pACYCDuet-‐1 pEGM-‐11ZF(+) pEGM-‐7ZF(+) PinPoint X a-‐3 PinPoint X a-‐2 PinPoint X a-‐1 pSP73pSP64 pTWIN1 pTYB11 pTXB1pET-‐5b(+) pBad/gIII C pBad/gIII B pBad/gIII ApET-‐5a(+) pMal-‐p4X pMal-‐p2G pkk223-‐3pkk232-‐8 pCYB1 pEZZ18 pBAD18pMAL-‐c5x pMal-‐p2E pMal-‐p2X pET-‐44 E K/LIC pET-‐43.1 E K/LIC pET-‐41 E K/LIC pMal-‐c4X pTrcHis BpET-‐31b(+) pET-‐3b(+) pET-‐41a(+) pGEX-‐3XpGEX-‐4T-‐2 pETDuet-‐1 pGEX-‐4T-‐1 pTrc99apET-‐28b(+) pET-‐His pALEX a,b,c pACYC177pBR322 pKD4 pKD20 pMXB10pEcoli-‐6xHN-‐GFPuv pKJE7 pRSET B pGEX-‐KGpGEX-‐2T pRSFDuet-‐1 pCOLADuet-‐1 pTrcHis C pTrcHis A pET-‐41b(+) pET-‐42b(+) pET-‐3a(+) pGEX-‐6P-‐3 pGEX-‐6P-‐2 pGEX-‐6P-‐1 pGEX-‐5X-‐3 pGEX-‐5X-‐1 pGEX-‐2TK pRSET A pMal-‐c2G pMal-‐c2E pMal-‐c2X pRSET C pQE-‐30pET-‐45b(+) pET-‐44b(+) pET-‐42c(+) pET-‐41c(+) pET-‐40b(+) pET-‐33b(+) pET-‐39b(+) pET-‐32 E K/LIC pET-‐32 X a/LIC pET-‐32c(+) pET-‐32b(+) pET-‐30 X a/LIC pET-‐30 E K/LIC pET-‐30c(+) pET-‐29c(+) pET-‐29b(+) pET-‐29a(+) pET-‐24c(+) pET-‐24b(+) pET-‐24(+) pET-‐23d(+) pET-‐11d(+) pBad33。
pBV220大肠杆菌表达载体说明
pBV220⼤肠杆菌表达载体说明pBV220编号名称北京华越洋VECT--‐110 pBV220pBV220载体基本信息载体名称: pBV220质粒类型: 原核表达载体，温控型表达载体，热诱导表达载体⾼拷贝/低拷贝: ⾼拷贝启动⼦: pR/pL克隆⽅法: 多克隆位点，限制性内切酶载体⼤⼩: 3666 b p5' 测序引物及序列: pBV220--‐F: 5?′--‐AAGAAGGGCAGCATTCAAAG--‐3‘3' 测序引物及序列: pBV220--‐R: 5?′--‐CTGCGTTCTGATTTAATCTG--‐3‘载体标签: --‐--‐载体抗性: 氨苄筛选标记: --‐--‐备注: pBV220质粒的SD sequence（⽤于结合原核⽣物核糖体的序列）后紧跟多克隆酶切位点，便于插⼊带起始ATG的外源基因，可表达⾮融合蛋⽩。
载体含有强的转录终⽌⼦可防⽌出现"通读"现象，有利于质粒--‐宿主系统的稳定。
载体pBV220为3.7Kb，有利于增加其拷贝数及容量。
pBV220含有PL启动⼦和编码对该启动⼦具有抑制作⽤⽽⼜对温度敏感的cI蛋⽩基因cIts857调控基因cI，因此可⽤温度对插⼊其中的外源基因的转录进⾏调控。
温控型原核表达载体，⾼拷贝数，⼤容量，强启动⼦，强转录终⽌⼦，可在任何受体菌中诱导表达。
pBV220载体是λPL/PR--‐cI857温度敏感系统表达载体，能够在42 表达⾮融合的⽬的蛋⽩。
在利⽤pBV220载体进⾏质粒构建的时候，需要加⼊ATG起始密码⼦。
PBV220质粒属于温度诱导表达型，培养温度为30 ，诱导温度为42 。
稳定性: 诱导表达组成型: ⾮组成型病毒/⾮病毒: ⾮病毒pBV220载体质粒图谱和多克隆位点信息Ampr, 氨苄抗性基因;ori, 质粒复制起点;cIts857, lambda 噬菌体表达抑制基因，但是在热诱导条件下能够表达⽬的基因; PRPL, 来⾃于lambda 噬菌体的串联的PR和PL启动⼦，保证基因的⾼⽔平表达; SD, Shine-Dalgarno序列;rrnB, 核糖体rrnB基因，是基因转录终⽌信号;pBV220载体简介pBV220载体是我国预防医学科学院病毒研究所⾃⾏构建的⼤肠杆菌温控表达载体,⽬前仍在⼴泛使⽤.pBV220载体序列ORIGIN1 GAATTCCCGG GGATCCGTCG ACCTGCAGCC AAGCTTCTGT TTTGGCTTAT GAGAGAAGAT 61 TTTCAGCCTG ATACAGATTA AATCAGAACG CAGAAGCGGT CTGATAAAAC AGAATTTGCC 121 TCCCGGCAGT AGCGCGGTGG TCCCACCTGA CCCCATGCCG AACTCAGAAG TGAAACGCCG 181 TAGCGCCGAT GGTAGTGTGG GGTCTCCCCA TGCGAGAGTA GCCAACTGCC AGGCATCAAA 241 TAAAACGAAA GGCTCAGTCG AAAGACTGGG CCTTTCGTTT TATCTGTTGT TTGTCGGTGA 301 ACGCTCTCCT GAGTAGGACA AATCCGCCGG GAGCGGATTT GAACGTTGCG AAGCAACGGC 361 CCGGAGGGTG GCGGGCAGGA CGCCCGCCAT AAACTGCCAG GCATCAAAGG AATCAGAAGG 421 CCATCCTGAC GGATGGCCTT TTTGCGTTTC TACAAACTCT TTGTTTATTT TTCTAAATAC 481 ATTCAAATAT GTATCCGCTC ATGAGACAAT AACCCTGATA AATGCTTCAA TAATATTGAA 541 AAAGGAAGAG TATGAGTATT CAACATTTCC GTGTCGCCCT TATTCCCTTT TTTGCGGCAT 601 TTTGCCTTCC TGTTTTTGCT CACCCAGAAA CGCTGGTGAA AGTAAAAGAT GCTGAAGATC 661 AGTTGGGTGC ACGAGTGGGT TACATCGAAC TGGATCTCAA CAGCGGTAAG ATCCTTGAGA 721 GTTTTCGCCC CGAAGAACGT TTTCCAATGA TGAGCACTTT TAAAGTTCTG CTATGTGGCG 781 CGGTATTATC CCGTGTTGAC GCCGGGCAAG AGCAACTCGG TCGCCGCATA CACTATTCTC 841 AGAATGACTT GGTTGAGTAC TCACCAGTCA CAGAAAAGCA TCTTACGGAT GGCATGACAG 901 TAAGAGAATT ATGCAGTGCT GCCATAACCA TGAGTGATAA CACTGCGGCC AACTTACTTC 961 TGACAACGAT CGGGAGGACCGAAGGAGCTA ACCGCTTTTT TGCACAACAT GGGGGATCAT 1021 GTAACTCGCC TTGATCGTTG GGAACCGGAT CTGAATGAAG CCATACCAAA CGACGAGCGT 1081 GACACCACGA TGCCTGTAGC AATGGCAACA ACGTTGCGCA AACTATTAAC TGGCGAACTA 1141 CTTACTCTAG CTTCCCGGCA ACAATTAATA GACTGGATGG AGGCGGATAA AGTTGCAGGA 1201 CCACTTCTGC GCTCGGCCCT TCCGGCTGGC TGGTTTATTG CTGATAAATC TGGAGCCGGT 1261 GAGCGTGGGT CTCGCGGTAT CATTGCAGCA CTGGGGCCAG ATGGTAAGCC CTCCCGTATC 1321 GTAGTTATCT ACACGACGGG GAGTCAGGCA ACTATGGATG AACGAAATAG ACAGATCGCT 1381 GAGATAGGTG CCTCACTGAT TAAGCATTGG TAACTGTCAG ACCAAGTTTA CTCATATATA 1441 CTTTAGATTG ATTTAAAACT TCATTTTTAA TTTAAAAGGA TCTAGGTGAA GATCCTTTTT 1501 GATAATCTCA TGACCAAAAT CCCTTAACGT GAGTTTTCGT TCCACTGAGC GTCAGACCCC 1561 GTAGAAAAGA TCAAAGGATC TTCTTGAGAT CCTTTTTTTC TGCGCGTAAT CTGCTGCTTG 1621 CAAACAAAAA AACCACCGCT ACCAGCGGTG GTTTGTTTGC CGGATCAAGA GCTACCAACT 1681 CTTTTTCCGA AGGTAACTGG CTTCAGCAGA GCGCAGATAC CAAATACTGT CCTTCTAGTG 1741 TAGCCGTAGT TAGGCCACCA CTTCAAGAAC TCTGTAGCAC CGCCTACATA CCTCGCTCTG 1801 CTAATCCTGT TACCAGTGGC TGCTGCCAGT GGCGATAAGT CGTGTCTTAC CGGGTTGGAC 1861 TCAAGACGAT AGTTACCGGA TAAGGCGCAG CGGTCGGGCT GAACGGGGGG TTCGTGCACA 1921 CAGCCCAGCT TGGAGCGAAC GACCTACACC GAACTGAGAT ACCTACAGCG TGAGCATTGA 1981 GAAAGCGCCA CGCTTCCCGA AGGGAGAAAG GCGGACAGGT ATCCGGTAAG CGGCAGGGTC 2041 GGAACAGGAG AGCGCACGAG GGAGCTTCCA GGGGGAAACG CCTGGTATCT TTATAGTCCT 2101 GTCGGGTTTC GCCAACCTCT GACTTGAGCG TCGATTTTGT GATGCTCGTC AGGGGGGCGG 2161 AGCCTATGGA AAAACGCCAG CAACGCGGCC TTTTTACGGT TCCTGGCCTT TTGCTGGCCT 2221 TTTGCTCACA TGTTCTTTCC TGCGTTATCC CCTGATTCTG TGGATAACCG TATTACCGCC 2281 TTTGAGTGAG CTGATACCGC TCGCCGCAGC CGAACGACCG AGCGCAGCGA GTCAGTGAGC 2341 GAGGAAGCGG AAGAGCGCCC TTATCTTTCC CTTTATTTTT GCTGCGGTAA GTCGCATAAA 2401 AACCATTCTT其他⼤肠杆菌表达载体：pBV221 ptdTomato pET--‐52b(+) pAmCyan pDsRed--‐Express2 pBV220 pCold--‐GST pColdS--‐SUMO pCold T F pCold I V pCold I II pCold I IpCold I pE--‐SUMO pCold--‐ProS2 pBAD102/D--‐TOPO pBAD202/D--‐TOPO pACYC184 pBAD/Thio--‐TOPO pBad/Myc--‐His C pBad/Myc--‐His B pBad/Myc--‐His A pBad/His C pBad/His B pBad/His A pBAD--‐TOPO pET--‐23b(+) pET--‐23a(+) pET--‐23c(+) pET--‐23(+) pET--‐12b(+) pET--‐12c(+)pET--‐12a(+) pET--‐11b(+) pET--‐11a(+) pET--‐11c(+) pBad24 pQE--‐82L pQE--‐81L pQE--‐80LpQE--‐32 pQE--‐9 pQE--‐16 pQE--‐31pQE--‐60 pQE--‐70 pQE--‐40 pET--‐51b(+)pET--‐50b(+) pET--‐49b(+) pET--‐48b(+) pET--‐47b(+)pET--‐26b(+) pET--‐32a(+) pET--‐21b(+) pET--‐22b(+)pET--‐14b pET--‐16b pET--‐15b pET--‐19bpET--‐20b(+) pET--‐21d(+) pET--‐21c(+) pET--‐21b(+)pET--‐21a(+) pET--‐24a(+) pET--‐24d(+) pET--‐25b(+)pET--‐27b(+) pET--‐28a(+) pET--‐30a(+) pET--‐42a(+)pET--‐43.1c(+) pET--‐43.1b(+) pET--‐43.1a(+) pET--‐44a(+)pET--‐44c(+) pET--‐46 E K/LIC pET--‐37b(+) pTrcHis2 C pTrcHis2 B pTrcHis2 A pET303/CT--‐His pET302/NT--‐His pRSET--‐CFP pRSET--‐EmGFP pRSET--‐BFP pGFPuvpET300/NT--‐DEST pET301/CT--‐DEST pGEM--‐T pBad43pGEX--‐4T--‐3 pGEX--‐5X--‐2 pBlueScript S K(+) pG--‐Tf2pG--‐KJE8 pGro7 pET--‐SUMO pSE380pET--‐17b pET102/D--‐TOPO pCDFDuet--‐1 pMAL--‐p5xpTf16 pET--‐28c(+) pBluescript I I S K(+) pET--‐30b(+) pSUMO pProEX H Tc pProEX H Tb pProEX H Ta pKD3 pKD13 pKD46 pTYB1pTYB2 pTWIN2 pBluescript I I K S(--‐) pTYB12pMAL--‐p5e pACYCDuet--‐1 pEGM--‐11ZF(+) pEGM--‐7ZF(+) PinPoint X a--‐3 PinPoint X a--‐2 PinPoint X a--‐1 pSP73 pSP64 pTWIN1 pTYB11 pTXB1pET--‐5b(+) pBad/gIII C pBad/gIII B pBad/gIII ApET--‐5a(+) pMal--‐p4X pMal--‐p2G pkk223--‐3pkk232--‐8 pCYB1 pEZZ18 pBAD18pMAL--‐c5x pMal--‐p2E pMal--‐p2X pET--‐44 E K/LIC pET--‐43.1 E K/LIC pET--‐41 E K/LIC pMal--‐c4X pTrcHis BpET--‐31b(+) pET--‐3b(+) pET--‐41a(+) pGEX--‐3XpGEX--‐4T--‐2 pETDuet--‐1 pGEX--‐4T--‐1 pTrc99apET--‐28b(+) pET--‐His pALEX a,b,c pACYC177pBR322 pKD4 pKD20 pMXB10pEcoli--‐6xHN--‐GFPuv pKJE7 pRSET B pGEX--‐KGpGEX--‐2T pRSFDuet--‐1 pCOLADuet--‐1 pTrcHis C pTrcHis A pET--‐41b(+) pET--‐42b(+) pET--‐3a(+) pGEX--‐6P--‐3 pGEX--‐6P--‐2 pGEX--‐6P--‐1 pGEX--‐5X--‐3 pGEX--‐5X--‐1 pGEX--‐2TK pRSET A pMal--‐c2G pMal--‐c2E pMal--‐c2X pRSET C pQE--‐30pET--‐45b(+) pET--‐44b(+) pET--‐42c(+) pET--‐41c(+) pET--‐40b(+) pET--‐33b(+) pET--‐39b(+) pET--‐32 E K/LIC pET--‐32 X a/LIC pET--‐32c(+) pET--‐32b(+) pET--‐30 X a/LIC pET--‐30 E K/LIC pET--‐30c(+) pET--‐29c(+) pET--‐29b(+) pET--‐29a(+) pET--‐24c(+) pET--‐24b(+) pET--‐24(+) pET--‐23d(+) pET--‐11d(+) pBad33。
大肠杆菌表达系统使用指导
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体系选择
研究基因功能: 大肠杆菌, 裂殖酵母,昆虫细胞, CHO细胞
多肽药物生产: 大肠杆菌, 毕氏酵母, CHO细胞, 乳腺组织
• HSA是包含585个氨基酸残基的单链无糖基化的球形蛋白 质， 分子量65kD。它是人血浆中含量最高的单一蛋白质 (达40g/L)， 在体内有维持血液渗透压， 运输营养和其它 重要生物物质的作用。HSA本身是许多内源因子和外源药 物的载体。药物和血清白蛋白结合后。可以减少其生物利 用度， 增加在体内的半衰期至19d之久。
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各种融合蛋白表达载体
• Protein A • GST（glutathione S-transferase） • CBD (chitin-binding domain, BioLabs;
cellulose-binding domain, Novagen) calmodulin-binding domain, Stratagene) • MBP (maltose-binding protein) • GFP (green fluorescence protein) • Thioredoxin **帮助二硫键形成 • Dsb (periplasma enzyme DsbA, DsbC) ** 二硫键的形成与 • SUMO (small ubiquitin-related modifier) • KSI (ketosteroid isomerase) 基本上全部沉淀 可用亲和层析纯化 帮助可溶化 帮助分泌到周质
pet经典质粒pet系统是有史以来在大肠杆菌中表达重组蛋白
pET经典质粒pET系统是有史以来在大肠杆菌中表达重组蛋白的功能最强大的系统，也是现今原核表达方面使用最广泛的系统。
该系统中，目的基因被克隆到pET质粒载体上，受强噬菌体T7转录及翻译信号控制；表达由宿主细胞提供的T7 RNA聚合酶诱导。
T7 RNA聚合酶机制十分有效：充分诱导时，几乎所有的细胞资源都用于表达目的蛋白；诱导表达后仅几个小时，目的蛋白通常可以占到细胞总蛋白的50%以上。
尽管该系统极为强大，却仍能很容易地通过改变诱导物的浓度来降低表达水平。
降低表达水平常用以提高某些目的蛋白的可溶部分产量。
该系统的另一个重要优点是在非诱导条件下，可以使目的基因完全处于沉默状态而不转录。
用不含有T7 RNA聚合酶的宿主菌克隆目的基因，即可解决免因目的蛋白表达对宿主细胞的毒性造成的质粒不稳定难题。
两种T7启动子以及多种拥有不同抑制本底表达水平的宿主细胞共同构成了一个极为灵活而有效的系统，使各种目的蛋白都能得以最优化表达。
可选质粒最经典的pET-28a, pET-30a和pET-32a质粒，应用最广，参考文献最多。
下表列出三个经典系列载体主要特性。
其中命名后带有(+)的载体含有f1复制区，可以制备单链DNA，适合突变及测序等应用。
pET-28a: T7lac启动子，高效及严谨型控制表达水平；N端His.Tag/T7.Tag融合标签，可利用His.Tag进行金属离子螯合层析纯化表达蛋白，也可利用T7.T ag融合标签进行基于抗体结合的亲和纯化；含凝血酶（Thrombin）蛋白酶切位点；pET-30a：T7lac启动子；N端His.Tag/S.Tag融合标签，可利用His.Tag进行金属离子螯合层析纯化表达蛋白，也可利用S.Tag融合标签进行亲和纯化及高灵敏度定量检测；含凝血酶（Thrombin）及肠激酶（Enterokinase）蛋白酶切位点；pET-32a：T7lac启动子；Trx融合蛋白表达载体，帮助表达蛋白形成二硫键，增加蛋白溶解性及活性；His.Tag/S.Tag融合标签。
大肠杆菌蛋白表达体系的构建实验报告
⼤肠杆菌蛋⽩表达体系的构建实验报告⼤肠杆菌蛋⽩表达系统的构建与蛋⽩质的分离纯化●实验⽬的：1.学会氯化钙制备⼤肠杆菌DH10B感受态细胞及掌握质粒转化感受态细胞的操作⽅法2.转化BL21(DE3)并在合适条件下诱导表达蛋⽩，掌握蛋⽩质诱导表达的原理，学习蛋⽩质诱导表达的⽅法3. 学会使⽤镍柱分离纯化蛋⽩质，利⽤PEPC试剂盒测定PEPC的活⼒。
●实验原理：1. 钙转法：Ca2+能与加⼊的DNA分⼦结合，形成抗DNA酶(DNase)的羟基-磷酸钙复合物，并黏附在细菌细胞膜的外表⾯上。
当42℃热刺激短暂处理细菌细胞时，细胞膜的液晶结构发⽣剧烈扰动，并随之出现许多间隙，为DNA分⼦提供了进⼊细胞的通道。
2. 诱导BL21(DE3)表达蛋⽩质的原理：E. coli BL21(DE3)其DE3是整合在细菌基因组上的⼀种携带T7 RNA聚合酶基因和lacI 基因的λ噬菌体，lacI编码的阻遏蛋⽩与lac操纵基因结合，从⽽不能进⾏外源基因的转录和表达，此时宿主菌正常⽣长。
IPTG 为乳糖类似物，不能被细胞利⽤，可以特异结合阻遏蛋⽩，阻遏蛋⽩不能与操纵基因结合，则外源基因⼤量转录并⾼效表达。
3. 六聚组氨酸纯化蛋⽩的原理：亲和层析是⼀种通过⽣物分⼦之间的特异性的相互作⽤来分离物质的层析⽅法。
组氨酸是具有杂环的氨基酸，每个组氨基酸含有⼀个咪唑基团，这个化学结构带有很多额外电⼦，对于带正电的化学物质有静电引⼒，亲和层析是利⽤这个原理来进⾏吸附的，亲和配体（也就是填料）上的阳离⼦（⼀般是镍离⼦）带正电对组氨酸有亲和作⽤。
组氨酸标签是原核表达载体上6个组氨酸的区段,这个标签在PH8.0时不带电,且⽆免疫原性,对蛋⽩质的分泌,折叠,功能基本上⽆影响.能⾼度亲和镍离⼦,⽤于蛋⽩质的亲和纯化.4. ⽬标蛋⽩：磷酸烯醇丙酮酸羧化酶（Phosphoenolpyruvate carboxykinase，PEPC.酸羧化酶的催化下，草酰⼄酸转变为磷酸烯醇式丙酮酸和⼆氧化碳。
真核细胞常见表达载体
真核细胞常见表达载体真核细胞, 表达载体1、pCMVp-NEO-BAN载体特点:该真核细胞表达载体分子量为6600碱基对，主要由CMVp启动子、兔β-球蛋白基因内含子、聚腺嘌呤、氨青霉素抗性基因和抗neo基因以及pBR322骨架构成，在大多数真核细胞内都能高水平稳定地表达外源目的基因。
更重要的是，由于该真核细胞表达载体中抗neo基因存在，转染细胞后，用G418筛选，可建立稳定的、高表达目的基因的细胞株。
插入外源基因的克隆位点包括Sal1、BamH1和EcoR1位点。
注意在此载体中有二个EcoR1位点存在。
2、pEGFP, 增强型绦色荧光蛋白表达载体(Enhanced Fluorecent Protein Vector)特点:pEGFP表达载体中含有绿色荧光蛋白，在PCMV启动子驱动下，在真核细胞中高水平表达。
载体骨架中的SV40or igin使该载体在任何表达SV40T抗原的真核细胞内进行复制。
Neo抗性盒由SV40早期启动子、Tn5的neomycin/kanamycin抗性基因以及HSV-TK 基因的聚腺嘌呤信号组成，能应用G418筛选稳定转染的真核细胞株。
此外，载体中的pUC origin 能保证该载体在大肠杆菌中的复制，而位于此表达盒上游的细菌启动子能驱动kanamycin抗性基因在大肠杆菌中的表达。
用途:该表达载体EGFP上游有Nde1、Eco47111和Age1克隆位点，将外源基因扦入这些位点，将合成外源基因和EGFP 的融合基因。
借此可确定外源基因在细胞内的表达和/或组织中的定位。
亦可用于检测克隆的启动子活性(取代CMV启动子,Acet1-Nhe1)。
3、pEGFT-Actin, 增强型绿色荧光蛋白/人肌动蛋白表达载体特点:pEGFP-Actin表达载体中含有绿色荧光蛋白和人胞浆β-肌动蛋白基因，在PCMV启动子驱动下，在真核细胞中高水平表达。
载体骨架中的SV40origin使该载体在任何表达SV40T抗原的真核细胞内进行复制。
基因工程3大肠杆菌表达系统
3、电转化法
电转化法的转化效率受电场强度、电脉冲的 时间和DNA浓度等参数的影响。 转化效率：108-109转化体/µ g DNA。
• 当电压和电脉冲时间的一定方式组合而导致 50%-70%细菌死亡时，转化效率达到最高。
• 制备用于电转化的感受态细胞相对容易。
当细菌长到对数中期，冷却、离心，然后用 冷却的去离子水反复清洗，最后用10%甘油重 悬细胞，使其浓度为31010细胞/毫升，在干冰 或液氮中速冻后置于-70 ℃贮存。 • 转化必须在0-4 ℃下进行。 如果在室温下操作，转化效率会大大降低。
（4）分子伴侣（molecular chaperone）稳定作用
分子伴侣：指一类多功能蛋白质，它能够通过阻 止诸如聚合作用这样的副反应，来促使其它蛋白 质按正确的方式折叠，而其本身却不是最终形成 的功能蛋白质的组成成分。 通过分子伴侣与克隆的外源基因在大肠杆菌 寄主细胞中共表达是增强目标蛋白的稳定性、 实现高水平表达的有效方法。
mRNA转录本5’端的独特的结构特征（核糖 体结合位点，RBS），是决定mRNA翻译效率 的主要因素。
至今，仍未鉴定出通用有效的翻译起始序列的保 守结构，但却已经发展出许多种可以用来有效地降 低在mRNA转录本5’-末端形成二级结构的实验方法， 从而提高克隆的外源基因的表达效率。 例如: 在RBS序列中增加AT含量；诱发特异碱基 发生定点突变；以及使用翻译偶联系统进行克隆基 因的表达。
6）对目标蛋白质作疏水性修饰。
（2）结构决定因子与蛋白质的稳定性
• 与蛋白质稳定性相关的确切的分子结构特征？
不清楚
• 但已经明确了若干种影响蛋白质稳定性的结 构决定因子。
其中最重要的：N-端氨基酸性质。
N-端氨基酸性质
大肠菌群快速纸片检测试剂盒 使用说明
【结果判断】
1、 纸片上出现紫红色菌落，其周围有黄圈者为阳性。
2、 纸片为一种颜色，无菌落生长者为阴性。
3、 纸片呈紫色，有紫红色菌落，其周围无黄圈者为阴性。
4、 酸性食品接种后，纸片变黄，经培养后无紫红色菌落为阴性。
4、 确认试验的方法：进行确认试验，用灭菌摄子无菌操作将可疑纸片移种到乳糖发酵管里，置37℃24小时培养后，对其产酸产气者判为大肠菌群阳性，否则判为阴性。
大肠菌群量的多少与结果的显示密切相关，可出现3种不同现象：⑴菌量较晕)；⑵菌量适中(102～103 cfu/ml)，整个纸片也变黄，但有小而密集的红色斑点；⑶菌量较少(≤102cfu/ml)，纸片可呈紫蓝色，并有散在或较密集的红色斑点，其周围变黄。因此菌量较大时，可能出现可疑现象。此时应通过加大样品稀释度或进一步做复发酵进行证实。其它可疑现象也可通过发酵实验进行确认。
【标本处理】
1、样品处理：液体样品按国标方法进行；固体样品，取25g样品，研碎加入25ml灭菌盐水混匀。
2、接种：液体样品吸取三个1mL分别涂布于三疑于三张纸片，再吸取1︰10、1︰100稀释液各三个1ml，分别涂布于三张纸片。固体样品，吸取1︰1混悬液三个1mL(1g)分别涂布于三张纸片，再吸取1︰10、1︰100稀释液各三个1ml，分别涂布于三张纸片，而后用手轻轻压平，置36±1℃温箱，培养15小时观察结果。
【检验原理】应用灭菌的滤纸吸收选择性培养基，细菌通过滤纸纤维膨胀而被固定并生长繁殖，大肠菌群在发育时伴随产生琥珀酸脱氢酶将纸片上的TTC(红四碳唑)还原成不可逆的Formazane产生红色色素，即大肠菌在纸片培养上呈红菌落，菌落周围产生黄圈是大肠菌分解乳糖产酸使指示剂变色的结果。
pGEM-T大肠杆菌表达载体说明
pGEM-T编号 载体名称北京华越洋生物VECT4770 pGEM-‐TpGEM-‐T载体基本信息载体名称: pGEM-‐T质粒类型: 原核表达载体；pCR克隆载体 高拷贝/低拷贝: -‐-‐启动子: T7克隆方法: 多克隆位点，限制性内切酶 载体大小: 2867 b p5' 测序引物及序列: T7 f orward3' 测序引物及序列: -‐-‐载体标签: -‐-‐载体抗性: 氨苄青霉素筛选标记: -‐-‐备注: -‐-‐稳定性: 瞬表达组成型: 组成型病毒/非病毒: 非病毒pGEM-‐T载体质粒图谱和多克隆位点信息pGEM-‐T载体序列ORIGIN1 GGGCGAATTG GGCCCGACGT CGCATGCTCC CGGCCGCCAT GGCCGCGGGA TATCACTAGT 61 GCGGCCGCCT GCAGGTCGAC CATATGGGAG AGCTCCCAAC GCGTTGGATG CATAGCTTGA 121 GTATTCTATA GTGTCACCTA AATAGCTTGG CGTAATCATG GTCATAGCTG TTTCCTGTGT 181 GAAATTGTTA TCCGCTCACA ATTCCACACA ACATACGAGC CGGAAGCATA AAGTGTAAAG 241 CCTGGGGTGC CTAATGAGTG AGCTAACTCA CATTAATTGC GTTGCGCTCA CTGCCCGCTT 301 TCCAGTCGGG AAACCTGTCG TGCCAGCTGC ATTAATGAAT CGGCCAACGC GCGGGGAGAG 361 GCGGTTTGCG TATTGGGCGC TCTTCCGCTT CCTCGCTCAC TGACTCGCTG CGCTCGGTCG 421 TTCGGCTGCG GCGAGCGGTA TCAGCTCACT CAAAGGCGGT AATACGGTTA TCCACAGAAT 481 CAGGGGATAA CGCAGGAAAG AACATGTGAG CAAAAGGCCA GCAAAAGGCC AGGAACCGTA 541 AAAAGGCCGC GTTGCTGGCG TTTTTCCATA GGCTCCGCCC CCCTGACGAG CATCACAAAA 601 ATCGACGCTC AAGTCAGAGG TGGCGAAACC CGACAGGACT ATAAAGATAC CAGGCGTTTC 661 CCCCTGGAAG CTCCCTCGTG CGCTCTCCTG TTCCGACCCT GCCGCTTACC GGATACCTGT 721 CCGCCTTTCT CCCTTCGGGA AGCGTGGCGC TTTCTCATAG CTCACGCTGT AGGTATCTCA 781 GTTCGGTGTA GGTCGTTCGC TCCAAGCTGG GCTGTGTGCA CGAACCCCCC GTTCAGCCCG 841 ACCGCTGCGC CTTATCCGGT AACTATCGTC TTGAGTCCAA CCCGGTAAGA CACGACTTAT 901 CGCCACTGGC AGCAGCCACT GGTAACAGGA TTAGCAGAGC GAGGTATGTA GGCGGTGCTA 961 CAGAGTTCTT GAAGTGGTGG CCTAACTACG GCTACACTAG AAGAACAGTA TTTGGTATCT 1021 GCGCTCTGCT GAAGCCAGTT ACCTTCGGAA AAAGAGTTGG TAGCTCTTGA TCCGGCAAAC 1081 AAACCACCGC TGGTAGCGGT GGTTTTTTTG TTTGCAAGCA GCAGATTACG CGCAGAAAAA 1141 AAGGATCTCA AGAAGATCCT TTGATCTTTT CTACGGGGTC TGACGCTCAG TGGAACGAAA 1201 ACTCACGTTA AGGGATTTTG GTCATGAGAT TATCAAAAAG GATCTTCACC TAGATCCTTT 1261 TAAATTAAAA ATGAAGTTTT AAATCAATCT AAAGTATATA TGAGTAAACT TGGTCTGACA 1321 GTTACCAATG CTTAATCAGT GAGGCACCTA TCTCAGCGAT CTGTCTATTT CGTTCATCCA 1381 TAGTTGCCTG ACTCCCCGTC GTGTAGATAA CTACGATACG GGAGGGCTTA CCATCTGGCC 1441 CCAGTGCTGC AATGATACCG CGAGACCCAC GCTCACCGGC TCCAGATTTA TCAGCAATAA1501 ACCAGCCAGC CGGAAGGGCC GAGCGCAGAA GTGGTCCTGC AACTTTATCC GCCTCCATCC 1561 AGTCTATTAA TTGTTGCCGG GAAGCTAGAG TAAGTAGTTC GCCAGTTAAT AGTTTGCGCA 1621 ACGTTGTTGC CATTGCTACA GGCATCGTGG TGTCACGCTC GTCGTTTGGT ATGGCTTCAT 1681 TCAGCTCCGG TTCCCAACGA TCAAGGCGAG TTACATGATC CCCCATGTTG TGCAAAAAAG 1741 CGGTTAGCTC CTTCGGTCCT CCGATCGTTG TCAGAAGTAA GTTGGCCGCA GTGTTATCAC 1801 TCATGGTTAT GGCAGCACTG CATAATTCTC TTACTGTCAT GCCATCCGTA AGATGCTTTT 1861 CTGTGACTGG TGAGTACTCA ACCAAGTCAT TCTGAGAATA GTGTATGCGG CGACCGAGTT 1921 GCTCTTGCCC GGCGTCAATA CGGGATAATA CCGCGCCACA TAGCAGAACT TTAAAAGTGC 1981 TCATCATTGG AAAACGTTCT TCGGGGCGAA AACTCTCAAG GATCTTACCG CTGTTGAGAT 2041 CCAGTTCGAT GTAACCCACT CGTGCACCCA ACTGATCTTC AGCATCTTTT ACTTTCACCA 2101 GCGTTTCTGG GTGAGCAAAA ACAGGAAGGC AAAATGCCGC AAAAAAGGGA ATAAGGGCGA 2161 CACGGAAATG TTGAATACTC ATACTCTTCC TTTTTCAATA TTATTGAAGC ATTTATCAGG 2221 GTTATTGTCT CATGAGCGGA TACATATTTG AATGTATTTA GAAAAATAAA CAAATAGGGG 2281 TTCCGCGCAC ATTTCCCCGA AAAGTGCCAC CTGATGCGGT GTGAAATACC GCACAGATGC 2341 GTAAGGAGAA AATACCGCAT CAGGAAATTG TAAGCGTTAA TATTTTGTTA AAATTCGCGT 2401 TAAATTTTTG TTAAATCAGC TCATTTTTTA ACCAATAGGC CGAAATCGGC AAAATCCCTT 2461 ATAAATCAAA AGAATAGACC GAGATAGGGT TGAGTGTTGT TCCAGTTTGG AACAAGAGTC 2521 CACTATTAAA GAACGTGGAC TCCAACGTCA AAGGGCGAAA AACCGTCTAT CAGGGCGATG 2581 GCCCACTACG TGAACCATCA CCCTAATCAA GTTTTTTGGG GTCGAGGTGC CGTAAAGCAC 2641 TAAATCGGAA CCCTAAAGGG AGCCCCCGAT TTAGAGCTTG ACGGGGAAAG CCGGCGAACG 2701 TGGCGAGAAA GGAAGGGAAG AAAGCGAAAG GAGCGGGCGC TAGGGCGCTG GCAAGTGTAG 2761 CGGTCACGCT GCGCGTAACC ACCACACCCG CCGCGCTTAA TGCGCCGCTA CAGGGCGCGT 2821 CCATTCGCCA TTCAGGCTGC GCAACTGTTG GGAAGGGCGA TCGGTGCGGG CCTCTTCGCT 2881 ATTACGCCAG CTGGCGAAAG GGGGATGTGC TGCAAGGCGA TTAAGTTGGG TAACGCCAGG 2941 GTTTTCCCAG TCACGACGTT GTAAAACGAC GGCCAGTGAA TTGTAATACG ACTCACTATA//其他大肠杆菌表达载体：pBV221 ptdTomato pET-52b(+) pAmCyanpDsRed-Express2 pBV220 pCold-GST pColdS-SUMOpCold TF pCold IV pCold III pCold IIpCold I pE-SUMO pCold-ProS2 pBAD102/D-TOPOpBAD202/D-TOPO pACYC184 pBAD/Thio-TOPO pBad/Myc-His CpBad/Myc-His B pBad/Myc-His A pBad/His C pBad/His BpBad/His A pBAD-TOPO pET-23b(+) pET-23a(+)pET-23c(+) pET-23(+) pET-12b(+) pET-12c(+)pET-12a(+) pET-11b(+) pET-11a(+) pET-11c(+)pBad24 pQE-82L pQE-81L pQE-80LpQE-32 pQE-9 pQE-16 pQE-31pQE-60 pQE-70 pQE-40 pET-51b(+)pET-50b(+) pET-49b(+) pET-48b(+) pET-47b(+)pET-26b(+) pET-32a(+) pET-21b(+) pET-22b(+)pET-14b pET-16b pET-15b pET-19bpET-20b(+) pET-21d(+) pET-21c(+) pET-21b(+) pET-21a(+) pET-24a(+) pET-24d(+) pET-25b(+) pET-27b(+) pET-28a(+) pET-30a(+) pET-42a(+) pET-43.1c(+) pET-43.1b(+) pET-43.1a(+) pET-44a(+) pET-44c(+) pET-46 EK/LIC pET-37b(+) pTrcHis2 C pTrcHis2 B pTrcHis2 A pET303/CT-His pET302/NT-His pRSET-CFP pRSET-EmGFP pRSET-BFP pGFPuvpET300/NT-DEST pET301/CT-DEST pGEM-T pBad43pGEX-4T-3 pGEX-5X-2 pBlueScript SK(+) pG-Tf2pG-KJE8 pGro7 pET-SUMO pSE380pET-17b pET102/D-TOPO pCDFDuet-1 pMAL-p5xpTf16 pET-28c(+) pBluescript II SK(+) pET-30b(+) pSUMO pProEX HTc pProEX HTb pProEX HTa pKD3 pKD13 pKD46 pTYB1pTYB2 pTWIN2 pBluescript II KS(-) pTYB12pMAL-p5e pACYCDuet-1 pEGM-11ZF(+) pEGM-7ZF(+) PinPoint Xa-3 PinPoint Xa-2 PinPoint Xa-1 pSP73pSP64 pTWIN1 pTYB11 pTXB1pET-5b(+) pBad/gIII C pBad/gIII B pBad/gIII A pET-5a(+) pMal-p4X pMal-p2G pkk223-3pkk232-8 pCYB1 pEZZ18 pBAD18pMAL-c5x pMal-p2E pMal-p2X pET-44 EK/LIC pET-43.1 EK/LIC pET-41 EK/LIC pMal-c4X pTrcHis BpET-31b(+) pET-3b(+) pET-41a(+) pGEX-3XpGEX-4T-2 pETDuet-1 pGEX-4T-1 pTrc99apET-28b(+) pET-His pALEX a,b,c pACYC177pBR322 pKD4 pKD20 pMXB10pEcoli-6xHN-GFPuv pKJE7 pRSET B pGEX-KGpGEX-2T pRSFDuet-1 pCOLADuet-1 pTrcHis C pTrcHis A pET-41b(+) pET-42b(+) pET-3a(+) pGEX-6P-3 pGEX-6P-2 pGEX-6P-1 pGEX-5X-3 pGEX-5X-1 pGEX-2TK pRSET A pMal-c2GpMal-c2E pMal-c2X pRSET C pQE-30pET-45b(+) pET-44b(+) pET-42c(+) pET-41c(+) pET-40b(+) pET-33b(+) pET-39b(+) pET-32 EK/LIC pET-32 Xa/LIC pET-32c(+) pET-32b(+) pET-30 Xa/LIC pET-30 EK/LIC pET-30c(+) pET-29c(+) pET-29b(+) pET-29a(+) pET-24c(+) pET-24b(+) pET-24(+)pET-23d(+) pET-11d(+) pBad33。
大肠杆菌表达系统教(学)案蛋白表达纯化
8.大肠杆菌表达系统与蛋白表达纯化大肠杆菌表达系统遗传背景清楚，目的基因表达水平高，培养周期短，抗污染能力强等特点, 是分子生物学研究和生物技术产业化发展进程中的重要工具。
因此熟练掌握并运用大肠杆菌表达系统的基本原理和常规操作是对每一个研究生来说是非常必要的。
本章节介绍了实验室常用的大肠杆菌表达系统的构成特点，归纳了利用大肠杆菌表达系统纯化重组蛋白的基本流程和详细操作步骤，并且结合笔者的操作经验，总结了初学者在操作过程中可能遇到的问题和解决策略。
8.1大肠杆菌表达系统的选择与构建8.1.1表达载体的选择根据启动子的不同这些载体大致可以分为热诱导启动子，如λPL，cspA 等和另外一类就是广泛使用的IPTG诱导的启动子，如lac，trc，tac，T5/lac operator，T5/lac operator等。
根据表达蛋白质的类型可分为单纯表达载体和融合表达载体。
融合表达是在目标蛋白的N端或C端添加特殊的序列，以提高蛋白的可溶性，促进蛋白的正确折叠，实现目的蛋白的快速亲和纯化，或者实现目标蛋白的表达定位。
常用的用于亲和纯化融合标签包括Poly-Arg，Poly-His, Strep-Tag Ⅱ，S-tag，MBP等。
其中His-Tag 和GST-Tag 是目前使用最多的。
His Tag 大多数是连续的六个His 融合于目标蛋白的N端或C端，通过His 与金属离子：Cu2+>Fe2+>Zn2+>Ni2+ 的螯合作用而实现亲和纯化，其中Ni2+是目前使用最广泛的。
His 标签具有较小的分子量，融合于目标蛋白的N端和C端不影响目标蛋白的活性，因此纯化过程中大多不需要去除。
目前常使用的表达载体主要是由Novagen 提供的pET 系列和Qiagen 公司提供的pQE 系列。
除了His 标签外，还原性谷胱甘肽S-转移酶是另一种实验室常用的融合标签。
它可以通过还原性谷胱甘肽琼脂糖亲和层析而快速纯化。
大肠杆菌表达载体,构建方法及其应用
大肠杆菌表达载体,构建方法及其应用大肠杆菌（Escherichia coli）是一种常见的肠道细菌，也是常用的表达宿主。
利用大肠杆菌表达载体，可以将目标基因导入大肠杆菌中进行表达，从而产生大量目标蛋白。
本文将介绍大肠杆菌表达载体的构建方法及其应用。
一、大肠杆菌表达载体的构建方法1. 选择适合的表达载体：常见的大肠杆菌表达载体包括pET系列、pBAD系列和pGEX系列等。
选择适合的表达载体主要考虑载体的复制起源、选择标记、表达调控元件和蛋白纯化标记等因素。
2. 克隆目标基因：将目标基因通过PCR扩增得到目标基因片段，然后利用限制性内切酶切割载体和目标基因片段，将目标基因片段插入载体中。
3. 进行质粒转化：将构建好的重组质粒导入大肠杆菌中。
可以通过化学法、电穿孔法或热冲击法等方法将质粒导入大肠杆菌中。
4. 筛选与鉴定：经过转化后，利用选择性培养基筛选出含有目标基因的重组大肠杆菌。
通过PCR、限制性酶切和测序等方法对重组菌株进行鉴定，确认目标基因已经成功插入载体。
二、大肠杆菌表达载体的应用1. 蛋白表达：利用大肠杆菌表达载体，可以将目标基因导入大肠杆菌中进行表达，从而大量产生目标蛋白。
这对于研究蛋白的结构、功能及其在生物学过程中的作用具有重要意义。
2. 蛋白纯化：大肠杆菌表达载体常含有蛋白纯化标记，如His标签、GST标签等。
通过这些标记，可以方便地对目标蛋白进行纯化和检测，为后续研究提供了便利。
3. 蛋白互作研究：大肠杆菌表达载体可以用于蛋白互作研究。
通过将目标蛋白与其他蛋白共同表达，可以研究它们之间的相互作用关系，揭示生物学过程中的分子机制。
4. 疫苗研究：大肠杆菌表达载体可以用于疫苗研究。
将目标抗原基因导入大肠杆菌中进行表达，可以获得大量的抗原蛋白，从而用于疫苗的开发和研究。
5. 酶工程：大肠杆菌表达载体可以用于酶工程研究。
通过将目标酶基因导入大肠杆菌中表达，可以进行酶的产量优化、酶的工艺改造等研究，提高酶的生产效率和稳定性。
pET表达载体
表达载体pETA.pET系统是有史以来在E.coli中克隆表达重组蛋白的功能最强大的系统。
目的基因被克隆到pET质粒载体上，受噬菌体T7强转录及翻译(可选择)信号控制；表达由宿主细胞提供的T7 RNA聚合酶诱导。
T7 RNA 聚合酶机制十分有效并具选择性：充分诱导时，几乎所有的细胞资源都用于表达目的蛋白；诱导表达后仅几个小时，目的蛋白通常可以占到细胞总蛋白的50%以上。
尽管该系统极为强大，却仍能很容易地通过降低诱导物的浓度来削弱蛋白表达。
降低表达水平可能可以提高某些目的蛋白的可溶部分产量。
该系统的另一个重要优点是在非诱导条件下，可以使目的基因完全处于沉默状态而不转录。
用不含T7 RNA聚合酶的宿主菌克隆目的基因，即可避免因目的蛋白对宿主细胞的可能毒性造成的质粒不稳定(详见I. F.部分)。
如果用非表达型宿主细胞克隆，可以通过两种方法启动目的蛋白的表达：用带有受λpL 和pI 启动子控制的T7 RNA聚合酶的λCE6噬菌体侵染宿主细胞，或者将质粒转入带有受lacUV5 控制的T7 RNA聚合酶基因的表达型细胞。
在第二种情形下，可以通过在细菌培养基中加入IPTG 来启动表达。
尽管有时(例如非毒性目的蛋白) 可以直接将目的基因克隆到表达型宿主细胞中，但这种策略并不是通用做法。
两种T7启动子以及多种拥有不同抑制本底表达水平的宿主细胞共同构成了一个极为灵活而有效的系统，使各种目的蛋白得以最优化表达。
所有pET载体以及相关产品均以试剂盒形式提供，用户可以很方便地进行克隆、表达检测以及纯化目的蛋白的所有操作。
pET 表达系统包括质粒和宿主菌。
您可参考系统组成部分，选择符合具体需要的载体/宿主菌最佳组合。
B.使用许可及协议Novagen的T7表达系统，包括细菌、噬菌体和带有T7 RNA 聚合酶基因的质粒，均依照非商业用户应用声明相应条款有条件提供。
详情请垂询。
C. 系统组成pET表达系统提供目的基因克隆和表达所需的核心试剂。
大肠杆菌表达载体
pGEX-1T—凝血酶
pGEX-2T---凝血酶
pGEX-3T---X因子
位相载体
西南大学生物技术专业 基因工程 14
分泌型融合表达载体----pEZZ18
西南大学生物技术专业 基因工程
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分泌型表达载体----pINIII-ompA1
西南大学生物技术专业 基因工程
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四、表达产物的纯化
1 、包涵体 (inclusion body) 的纯化：许多情况下表达产物 在细胞内形成不溶的颗粒状包涵体，可通过机械法、冻融 法、超声波处理等破碎细胞，离心收集包涵体，洗涤去除 杂蛋白，用盐酸胍、尿素和 SDS 溶解包涵体，再通过一定 的法使蛋白质折叠。 有的经上法得到后仍然有活性，有的蛋白一旦形成包涵体后 就没有活性了，但可作为抗原。 2、可溶性蛋白的纯化：表达的蛋白可以细胞内解物的上清部分用于 纯化目标蛋白，甚至可直接作为粗酶液进行生化反应。
西南大学生物技术专业 基因工程 7
3 、内含肽表达载体：如 NEB 公司的 Impact-Twin 系 统，将目的蛋白放在两个可自裂解的内含肽 (intein)中间，在得到融合蛋白以后不通过蛋白 酶消解、只需要调节pH值等条件就将标签蛋白切 除。 4 、分泌表达载体：产物可跨膜分泌至胞周间隙， 可避免受细胞内蛋白酶的降解，或使其正确折叠， 或去除N-端甲硫氨酸，以维护活性。 信号肽(signal peptide) 有碱性磷酸酶信号肽、蛋 白质 A 信号肽（如 Amersham 公司的 pEZZ18 系统）。
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2 ） 植 物 Ac-Ds 转 座 子 双 因 子 插 入 突 变 ： 玉 米 Ac (activator) 因子是一个转座子，含有完整的转 座酶， Ds (dissociation) 是 Ac 缺失转座酶基因 的缺失体，但具两端的反向重复序列。
pET载体
pET载体pET载体，原核表达金标准对于全世界许多研究者，Novagen 的pET 系统已成为在大肠杆菌中蛋白表达的首选。
该系统成功的一个主要原因是目标基因被克隆到不为大肠杆菌RNA 聚合酶识别的T7 启动子之下，因此在加入T7 RNA 聚合酶之前几乎没有表达发生。
克隆到pET 载体的基因实际上是被关闭的，不会由于产生的蛋白对细胞有毒性而引起质粒不稳定。
重组质粒转移到染色体上含有一拷贝由lacUV5 控制的T7 RNA 聚合酶基因的表达宿主中，并通过加入IPTG 诱导表达；也可通过l CE6 感染原始克隆宿主菌来提供T7 RNA 聚合酶。
使用大肠杆菌启动子系统( 如tac 、lac 、trc 、pL) 有困难的许多基因已经在pET 系统中稳定克隆和表达。
T7 RNA 聚合酶的选择性和活性使得几乎所有细胞资源都用于为目标基因表达。
诱导后几小时目标产物就可超过细胞总蛋白的50% 。
新开发的T7 驱动表达技术以pETBlue TM 系统为代表。
pETBlue 载体包括了pET 用于表达的优点，在目标基因克隆和质粒DNA 操作的方面更为方便。
pETBlue TM 系统：新一代T7 表达载体pETBlue 载体代表了新型表达载体，它具备所有广受欢迎的克隆载体的最理想特点和T7 驱动蛋白表达的完全功能。
目标基因以相对于修饰的大肠杆菌tet 启动子的反义方向插到lacZ a - 肽编码区，因此可进行蓝/ 白斑筛选。
正确定位于目标基因正义方向上游的T7 转录和翻译信号使表达成为可能。
与标准pET 载体一样，通过转化λ DE3 溶原菌并用IPTG 诱导或通过l CE6 感染原始宿主菌生产目标蛋白。
优点·蓝/ 白斑筛选，便于克隆·高拷贝数，质粒DNA 高产·以AccepTor TM 载体或perfectly Blunt a 载体形式提供，便于快速PCR 克隆·目标基因无基础水平表达，消除了毒性基因产物相关的质粒不稳定性·表达水平与经典pET 载体相同·用Tuner TM (DE3)pLacI 宿主菌实现真正的表达水平“变阻器”控制。
pET原核表达系统
诱导和阻遏表达（ Induction & Repression）
大肠杆菌表达外源基因的劣势 缺乏对真核生物蛋白质的复性功能 缺乏对真核生物蛋白质的修饰加工系统 内源性蛋白酶降解空间构象不正确的异源蛋白 细胞周质内含有种类繁多的内毒素
二、基因表达方式
• 根据生物对内外环境刺激的反应，将 基因表达的方式分为： 组成型表达 诱导或阻遏型表达 协同表达
组成型表达（constitutive gene expression） • 在个体发育的任一阶段都能在大多数细胞中持续进行 的基因表达，无论表达的水平高或低，它受环境因素 的影响较少、或变化很小。 且基因表达产物通常是对 生命过程必需的、必不可少的，这类基因通常被称为 持家基因（housekeeping gene）。 • 举例：
cI857 p15A ori 热诱导 PL 启动子 T7 RNA 聚合酶基因 T7 启动子 目的基因 ColE1 ori AmpR
பைடு நூலகம்
T7 RNA 聚合酶
KanR
调控方式为控制 T7 RNA 聚合 酶的启动子调控类型
T7 表达系统存在的问题
T7 表达系统表达目的基因的水平是目前所有表达系统中最高的，但 也不可避免出现在相对较高的本底转录，如果目的基因产物对大肠杆 菌宿主有毒性，会影响细胞的生长。
外源基因在大肠杆菌中的表达
大肠杆菌作为表达外源基因受体菌的特征
PET系统_原核表达详细总结
抗生素抗性
pET载体常用的两种筛选标记是Ampr+和Knar+ 因为内酰胺酶的消化和PH的降低，Ampr+的选择 性易于丢失。某种情况下使用Knar+更为有利。 Ampr+和Knar+的另一个不同是两种基因的转录 方向不同 。Ampr+位于T7启动子下游，与其方向 相同。除了pET5系列，T7转录终止序列位于内酰 胺酶基因前面，但是这个终止序列只有70%的有 效性。因此，T7聚合酶能够通读，导致内酰胺酶 的积累。相反Knar+的转录方向与T7启动子方向 相反，诱导时并没有Knar+基因的增加。
lacUV5 Promoter
与野生型lac启动子相比，控制T7RNA聚合 酶表达的 lacUV5启动子对 cAMP/CRP的刺 激并不敏感。然而，最近研究发现rDE3宿 主菌在缺少葡萄糖的培养基生长到稳定期 时，cAMP同样对lacUV5产生了去阻遏作用。 尽管宿主菌长到稳定期并不推荐，菌体培 养过夜（16h）后转入含有1%的葡萄糖的 培养基中，可以有效避免去阻遏作用，因 为glucose可以cAMP的产生。
BL21(DE3)
BL21(DE3)是应用最广泛的表达宿主菌。是 lon蛋白酶和ompT膜外蛋白酶（纯化过程可 以降解蛋白）缺陷型。目的蛋白BL21中更 加稳定。 因为BL21(DE3)对利福平敏感，如果有必要 可以用利福平来限制宿主RNA和蛋白质的 背景合成。
应该注意一些7启动子 而没有额外的lac阻遏子基因的载体并不适 合。这些载体上的多拷贝lac操纵 子（用于 蓝白斑筛选）会结合lac抑制因子，使pet菌 株中同样受lac抑制因子控制的基因部分表 达。。结果基本的T7RNA聚合酶活性升高， 使目的基因的稳定性受到影响。
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pET-48b(+)编号 载体名称北京华越洋生物VECT4670 pET-‐48b(+)pET48b载体基本信息别名: pET48b, p ET 48b质粒类型: 大肠杆菌蛋白表达表达水平: 高克隆方法: 多克隆位点，限制性内切酶载体大小: 5605 b p5' 测序引物序列: T7: 5'-‐TAATACGACTCACTATAGGG-‐3';Trx-‐F: 5'-‐TTCCTCGACGCTAACCTG-‐3'3' 测序引物序列: T7t: 5'-‐TGCTAGTTATTGCTCAGCGG-‐3'载体标签: N-‐Trx, N-‐His,N-‐HRV 3C, C-‐S, C-‐Thrombin载体抗性: Kanamycin (卡那霉素)备注: Same as pET47 but also has Nterm Trx Tag; contains HRV 3C Proteasecleavage site for fusion tag removal at low temperatures; Ctermthrombin c leavage s ite.稳定性: 瞬时表达组成型: 组成型病毒/非病毒: 非病毒pET48b载体质粒图谱和多克隆位点信息pET48b载体简介pET-‐48b载体含有N端Trx和His标签，在标签后面紧跟着的是HRV 3C蛋白酶切位点。
HRV 3C蛋白酶能够高特异性的识别LEVLFQ↓GP蛋白序列，能够在低温下高效切割掉融合标签序列。
pET-‐48b载体还含有一个可选择的C端Thrombin蛋白酶切位点，紧接着位点后是S标签。
pET48b载体的单一的多克隆位点见上面的环状质粒图谱。
注意：载体序列是以pBR322质粒的编码规矩进行编码的，所以T7蛋白表达区在质粒图谱上面是反向的。
T7 RNA聚合酶启动的克隆和表达区域在质粒图谱中也被标注了出来。
质粒的F1复制子是被定向的，所以在T7噬菌体聚合酶的作用下，包含有蛋白编码序列的病毒 粒子能够产生，并启动蛋白表达，同时蛋白表达将被T7终止子序列(Cat. N o. 69337-‐3)的作用下终止蛋白翻译。
载体的单链测序应该使用S 18引物(Cat. N o. 71262-‐3)。
The pET-‐48b(+) vector carries N-‐terminal Trx•Tag™ and His•Tag? coding sequences followed b y a r ecognition s ite f or t he h uman r hinovirus (HRV) 3C p rotease. T his p rotease is highly specifi c for cleavage of the sequence LEVLFQ↓GP (1), and is active at low temperatures (2). pET-‐48b(+) also contains an optional C-‐terminal thrombin recognition site followed by an S•Tag™ coding sequence. Unique restriction sites are shown on the circle map. Note that the sequence is numbered by the pBR322 convention, so the T7 expression region is reversed on the circle map. The cloning/expression region of the coding strand transcribed by T7 RNA polymerase is shown below. The f1 origin is oriented so that infection with the helper phage will produce virions containing single-‐stranded DNA that corresponds to the coding strand. Therefore, single-‐stranded sequencing s hould b e p erformed u sing t he A S S•Tag 18mer P rimer (Cat. N o. 71262-‐3).pET48b载体序列ORIGIN1 ATCCGGATAT AGTTCCTCCT TTCAGCAAAA AACCCCTCAA GACCCGTTTA GAGGCCCCAA61 GGGGTTATGC TAGTTATTGC TCAGCGGTGG CAGCAGCCAA CTCAGCTTCC TTTCGGGCTT121 TGTTTAGCAG CCTAGGTTAA TTAAGCCTCG AGAGCAGCAG AAGTAGAGCT GTCCATGTGC181 TGGCGTTCGA ATTTAGCAGC AGCGGTTTCT TTACTACCGC GTGGCACCAG AGCGAGCTCT241 GCGGCCGCAA GCTTGTCGAC GGACGTCGGG CGCGCCAAGG CCTGTACAGA ATTCGGATCC301 TGGTACCCGG GTCCCTGAAA GAGGACTTCA AGAGCCGCGG AGTGATGGTG ATGGTGATGA361 CCAGAACCAC TAGATGGAGT AGGAGTAGGA GGATTGTTAT TAGAACCGCC ACCACCACTA421 GTATGGCCAG AACCAGAACC GGCCAGGTTA GCGTCGAGGA ACTCTTTCAA CTGACCTTTA481 GACAGTGCAC CCACTTTGGT TGCCGCCACT TCACCGTTTT TGAACAGCAG CAGAGTCGGG541 ATACCACGGA TGCCATATTT CGGCGCAGTG CCAGGGTTTT GATCGATGTT CAGTTTTGCA601 ACGGTCAGTT TGCCCTGATA TTCGTCAGCG ATTTCATCCA GAATCGGGGC GATCATTTTG661 CACGGACCGC ACCACTCTGC CCAGAAATCG ACGAGGATCG CCCCGTCCGC TTTGAGTACA721 TCCGTGTCAA AACTGTCGTC AGTCAGGTGA ATAATTTTAT CGCTCATATG TATATCTCCT781 TCTTAAAGTT AAACAAAATT ATTTCTAGAG GGGAATTGTT ATCCGCTCAC AATTCCCCTA841 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pET-12b(+) pET-12c(+)pET-12a(+) pET-11b(+) pET-11a(+) pET-11c(+)pBad24 pQE-82L pQE-81L pQE-80LpQE-32 pQE-9 pQE-16 pQE-31pQE-60 pQE-70 pQE-40 pET-51b(+)pET-50b(+) pET-49b(+) pET-48b(+) pET-47b(+)pET-26b(+) pET-32a(+) pET-21b(+) pET-22b(+)pET-14b pET-16b pET-15b pET-19bpET-20b(+) pET-21d(+) pET-21c(+) pET-21b(+)pET-21a(+) pET-24a(+) pET-24d(+) pET-25b(+)pET-27b(+) pET-28a(+) pET-30a(+) pET-42a(+)pET-43.1c(+) pET-43.1b(+) pET-43.1a(+) pET-44a(+) pET-44c(+) pET-46 EK/LIC pET-37b(+) pTrcHis2 C pTrcHis2 B pTrcHis2 A pET303/CT-His pET302/NT-His pRSET-CFP pRSET-EmGFP pRSET-BFP pGFPuvpET300/NT-DEST pET301/CT-DEST pGEM-T pBad43pGEX-4T-3 pGEX-5X-2 pBlueScript SK(+) pG-Tf2pG-KJE8 pGro7 pET-SUMO pSE380pET-17b pET102/D-TOPO pCDFDuet-1 pMAL-p5xpTf16 pET-28c(+) pBluescript II SK(+) pET-30b(+) pSUMO pProEX HTc pProEX HTb pProEX HTa pKD3 pKD13 pKD46 pTYB1pTYB2 pTWIN2 pBluescript II KS(-) pTYB12pMAL-p5e pACYCDuet-1 pEGM-11ZF(+) pEGM-7ZF(+) PinPoint Xa-3 PinPoint Xa-2 PinPoint Xa-1 pSP73pSP64 pTWIN1 pTYB11 pTXB1pET-5b(+) pBad/gIII C pBad/gIII B pBad/gIII A pET-5a(+) pMal-p4X pMal-p2G pkk223-3pkk232-8 pCYB1 pEZZ18 pBAD18pMAL-c5x pMal-p2E pMal-p2X pET-44 EK/LIC pET-43.1 EK/LIC pET-41 EK/LIC pMal-c4X pTrcHis BpET-31b(+) pET-3b(+) pET-41a(+) pGEX-3XpGEX-4T-2 pETDuet-1 pGEX-4T-1 pTrc99apET-28b(+) pET-His pALEX a,b,c pACYC177pBR322 pKD4 pKD20 pMXB10pEcoli-6xHN-GFPuv pKJE7 pRSET B pGEX-KGpGEX-2T pRSFDuet-1 pCOLADuet-1 pTrcHis C pTrcHis A pET-41b(+) pET-42b(+) pET-3a(+) pGEX-6P-3 pGEX-6P-2 pGEX-6P-1 pGEX-5X-3 pGEX-5X-1 pGEX-2TK pRSET A pMal-c2GpMal-c2E pMal-c2X pRSET C pQE-30pET-45b(+) pET-44b(+) pET-42c(+) pET-41c(+) pET-40b(+) pET-33b(+) pET-39b(+) pET-32 EK/LIC pET-32 Xa/LIC pET-32c(+) pET-32b(+) pET-30 Xa/LIC pET-30 EK/LIC pET-30c(+) pET-29c(+) pET-29b(+) pET-29a(+) pET-24c(+) pET-24b(+) pET-24(+)pET-23d(+) pET-11d(+) pBad33。