第五章 工业微生物育种诱变剂讲解
工业微生物诱变育种诱变剂(ppt)
2、紫外光的剂量
单位:尔格能量/mm2 (灯具发射强度随使用时间延长而下降。) 实际应用-相对剂量：照射时间、杀菌率来表示 杀菌率：90.0%-99.9% 时间：芽孢菌10min；
小芽孢杆菌营养缺陷型1-3min； 一般营养体3-5min； 无芽孢菌和革兰氏阳性菌0.5-2min。
3、诱变机理
照射 ❖ 设备：紫外灯、磁力搅拌器、暗室、培养皿等; ❖ 紫外灯：波长为253.7nm,功率是15W; ❖处理时的照射距离：20cm — 30cm; ❖ 样品：要直接暴露在紫外灯下，厚度不能超过
3mm,照射时，要用磁力搅拌器搅拌。 注意：操作和培养时必需避免可见光直射液面， 最好在黄色或红色灯光下操作。
后培养：1.5-2小时；
稀释涂皿
（四）、电离辐射
（五）新型诱变剂
❖ 微波:电磁波 ❖ 红外线：0.75～1000μm ❖ 激光：光量子流 ❖ 高能电子流：强电离辐射 ❖ 航天育种：利用返回式卫星进行农作
物新品种的选育的一种方法。
航椒1号
航茄2号
航 天 葫 芦
6、低能离子注入
过程：能量沉积、动量传递、离子注入和电荷 交换
染色体方面的表现: 断裂，形成染色体断片、环、桥等。 染色体畸变率与辐射剂量成正比 染色体畸变率是评价遗传损伤的指标
DNA方面的表现: DNA断裂、分解，形成单链结构 DNA非按时合成 存在自我损伤修复机制，提前进行DNA合成， 进行DNA损伤修复 生长素类物质促进DNA损伤修复 咖啡因、EDTA等拟制DNA损伤修复
结合的复合诱变效应
二、化学诱变剂
化学诱变剂是一些能和DNA起作用，改变 其结构，并引起遗传变异的化学物质。
碱基类似物 烷化剂 种类 移码突变剂 其他类
第五章 工业微生物诱变育种
株时，应选择多种遗传类型的菌株作为出发菌株比较
稳妥，容易在较短时期内达到育种目的。
8. 菌种代谢特点
了解菌种代谢特点有助于选择有效的出发菌株。 有人曾研究过肌苷酸产生菌的代谢特性，发现肌苷 酸的生物合成过程与肌苷、肌苷酸及核苷酸、磷酸 化酶的活性有关，如果从产生肌苷酸野生型的枯草 杆菌中筛选到降解酶活性低而磷酸化酶活性强的作 为诱变出发菌株，一般都能得到良好的诱变效果。
6. 药品和原材料质量
药品规格和原材料来源不同，都会影响菌种的质量。
四、了解菌种有效产物中的 各种组分在代谢 合成过程中与培养条件的关系
由棘孢小单孢菌(Micromonospora echinopora) 产生的庆大霉素，其中C1是有效的组分； C2是无效
的。在发酵过程中加入适量的磷或蛋白胨以及加大 通 风量都有利于C1的合成；反之，C2的比例就上升。
菌悬液由出发菌株的孢子或菌体细胞与生理盐水或 缓冲液制备而成。对菌悬液的制备有如下的要求：
1、供试菌株的孢子或菌体要年轻、健壮。
细胞要新培养的，细胞生理活性方面既要同步， 又要处在最旺盛的对数期，这样突变率高，重现性也 好。 霉菌孢子浓度约为：106ml-1，放线菌孢子浓度约 为：106~107ml-1。菌悬液通常采用生理盐水制备。如 果用化学诱变剂处理时，应采用相应的缓冲液配制， 以防处理过程中pH变化而影响诱变效果。
1. 对一般出发菌株的要求
（1）从自然界样品中分离筛选出来的野生菌株，虽 然产量较低，但对诱变因素敏感，变异幅度大，
正突变率高；
（2）在生产中使用的，具有一定生产能力，并且在 生产过程经过自然选育的菌株； （3）采用具有有利性状的菌株，如生长速度快、营 养要求低以及产生孢子早而多的菌株；
工业微生物育种诱变剂
第一章工业微生物育种诱变剂1物理诱变剂的总类：物理辐射分为电离辐射和非电离辐射。
包括紫外线、X射线、r射线。
快中子。
微波，超声波、电磁波、激光射线和宇宙线等。
（X 射线、r射线属于电离辐射，紫外线属于非电离辐射）2物理诱变剂对微生物的影响实质：由高能辐射导致生物系统损伤，继而发生遗传变异的一系列复杂的连锁反应过程。
3辐射作用的时相阶段：物理阶段——直接作用DNA或作用于水物理化学阶段——激发和电离DNA分子或激发电离水分子化学阶段——产生生物自由基生物学阶段——分子发生变化，变异或死亡4细菌中紫外线对DNA的影响：促使G:C A:T的转换； DNA链断裂，单链或双链；嘧啶或嘌呤被氧化脱去氨基；碱基分子结构中碳与碳之间的链断裂形成开环现象；辐射击中单个核苷酸后，使碱基或磷酸酯游离出来；交联作用5辐射引起的生物学效应的影响因素：微生物的遗传背景；微生物的生理状态；可见光；细胞水分；温度；空气或氧气。
6紫外线的诱变机理及原因？机理：(1)DNA与蛋白质交联(2)胞嘧啶与尿嘧啶之间的水合作用(3)DNA链断裂，形成嘧啶二聚体原因：形成嘧啶二聚体7DNA损伤修复中光修复与暗修复的主要机理？光修复：嘧啶二聚体被一种光激活酶结合形成复合物，这种复合物在可见光下由于光激活酶获得光能而发生解离，从而使二聚体重新分解成单体。
暗修复：嘧啶二聚体的5’端限制性内切酶和外切酶的作用下，造成单链断裂，接着在外切核酸酶的作用下，切除嘧啶二聚体。
然后再DNA聚合酶Ⅰ、Ⅲ的作用下，并以另一条完整的单链做模板合成正确的碱基对序列，最后由连接酶完成双链结构。
8紫外线有效波长（诱变）范围是：200~300nm9紫外线的剂量以什么计算？绝对剂量：erg/mm2；相对剂量：照射时间、杀菌率表示10紫外线诱变的步骤方法（以及应用，包括如何计数、致死率的计算）步骤：（1）出发菌株的选择将细菌斜面培养至对数期，霉菌或放线菌培养至孢子刚成熟（2）前培养培养基中可添加咖啡碱或异烟肼等抗修复物质。
诱变育种是用物理或化学的诱变剂使诱变对象内的遗传物质
以选育高产突变株为例，诱变育种的基本环节概括如下：
可见，设计和采用效率高的筛选方案和方法 极其重要。
第一轮：
一个出发菌株→→→选出200个菌株→→→选出50株
（每瓶一株） 复筛
诱变处理
初筛
→→→选出5株
（每瓶四株）
40株 第二轮： 5个出发菌株→→→
诱变处理
40株
→→ → 选出50株 →→ →选出5株 40株
最适剂量的选择：产量性状的育种中多倾向于低剂量（致 死率在70~80%）
选择诱变剂的种类：在选用理化因子作诱变剂时，在同样 效果下，应选用最方便 的因素；而在同样方便的情况下，
则应选择 最高效 的因素。在物理诱变剂中，尤以紫外线 为最方便，而在化学诱变剂中，一般可选用诱变效果最为 显著的“超诱变剂”，如NTG。
ห้องสมุดไป่ตู้
简便有效的诱变方法：紫外线的照射最为方便。
化学诱变剂的种类、浓度和处理方法尤其是中止 反映的方法很多，实际工作时可参看有关书籍。一种较有 效的简易处理方法的大致操作步骤是：先在平板上涂上出 发菌株细胞，然后在平板上均匀地放上几颗很小的诱变剂 颗粒（也可放吸有诱变剂溶液的滤纸片），经培养后，在 制菌圈的边缘挑取若干突变菌落，分别制成悬浮液，然后 将其涂在一般平板表面使长出许多单菌落，最后可用影印 培养法或逐个检出法选出突变种。
表型迟延现象:指某一突变在DNA复制和细胞分裂后，才 在表型上显示出来，造成不纯的菌落。 产生原因： ①分离性迟延现象
②生理性迟延现象
3.诱变处理：
诱变剂的作用： ①提高突变的频率 ②扩大产量变异的幅度 ③使产量变异朝着正突变或负突变移动
剂量的表示法：不同种类和不同生长阶段的微生物对诱变 剂的敏感程度不同，所以在诱变处理前，一般应预先 作诱变剂用量对菌体死亡数量的致死曲线，选择合适 的处理剂量。—致死率是最好的诱变剂相对剂量的表 示方法。
工业微生物育种学4
四、电离辐射
常用的微生物诱变电离辐射
物理诱变剂 X射线 波长 生物学效应 0.06~136nm 1 脱氧核糖的降解 2 糖-磷酸骨架的断裂 3 丧失嘌呤 0.006~1.4nm 4 碱基的羟基化 5 自由基和DNA分子反应 6 DNA链的断裂
γ射线
快中子
X射线和γ射线
X射线和γ射线的剂量单位通常以伦琴来表示，即 1cm3干燥空气在0℃、1.013×105帕气压下，产生 2.08×109离子时所需的能量。 其作用机理是使原子中的电子被击出而变成正离子。 由于具有很强的穿透能力，所以对细胞的杀死作用 比紫外线和一般化学试剂更强。在实践中不用象紫 外线那样进行反复多次照射。 切忌使用高剂量进行处理，一般掌握在90~99.9% 的杀菌率为宜。
电离辐射
一些高能射线在照射并穿过物质的过程中，能把 该物质分子或原子上的电子击中而产生正离子， 故称电离辐射。产生的正离子数量随着射线发射 的能量增高而增加。 如X射线、γ射线和快中子等。
快中子有点特别。它本身是不带电荷的粒子，不 直接产生电离，但是它可使吸收中子物质的原子 核被撞击出质子。
杀菌率和诱变效果
照射剂量越高，杀菌率也越高，在残存细胞中的 变异幅度也广。一般认为杀菌率以90%~99%效 果较好。但也有报道说，较低的杀菌率 （70%~80%）有利于正突变型的产生。
因此我们要设法掌握好减少死亡率和提高诱变效 果之间的矛盾。
紫外线诱变的步骤和方法
1 斜面培养出发菌株
关于辐射引起的生物效应
辐射引起的生物效应与射线种类和微生物的种 类有关。同一种射线对不同的微生物其效应也 不一样，这与每种微生物修复系统的强弱不同 有关。 电离辐射主要引起DNA上的基因突变和染色体 畸变；非电离辐射主要是形成嘧啶二聚体。 物理诱变剂引起微生物的变异或死亡与辐射剂 量成正比。在相同的总辐射剂量的条件下，不管是一次连续
第五章 工业微生物育种诱变剂
目活根 性据 烷烷 基化 的剂 数中
单功能烷化剂 亚硝基类、磺酸酯类、硫酸酯类、 重氮烷类、乙烯亚胺类化合物
双功能烷化剂 硫芥子、氮芥子类等
多功能烷化剂 第五章 工业微生物育种诱变剂
部分烷化剂
部分烷化剂 和 烷化碱基
烷化碱基
甲基磺酸甲酯
亚硝基乙基脲
7-甲基鸟嘌呤
3-甲基腺嘌呤
第五章 工业微生物育种诱变剂
第五章 工业微生物育种诱变剂
第五章 工业微生物育种诱变剂
11
A 2 A P 2 A P * G T TCC
12
第五似物的诱变处理方法（以5-BU为例）
5-BU是白色结晶粉末，能溶于水或乙醇。诱变处理方法如下：
1.单独处理 新鲜斜面的细菌——转接到前培养的液体培养基中——培养 到对数期——离心除去培养液——加入生理盐水或缓冲液— —饥饿培养8—10小时——加入5-BU到培养液中，使最后的 处理浓度为25—40μg/ml,混合均匀——取0.1—0.2ml菌悬液 加入到琼脂平板上涂布培养——在适宜温度下，使之在生长 过程中诱变处理——培养后挑取单菌落，进行筛选。
5-溴尿嘧啶（5-BU）的结构 第五章 工业微生物育种诱变剂
-
5 溴 尿 嘧 啶 配（ 对5
） 的 碱 基
第五章 工业微生物育种诱变剂
7
-BU
A A GG T B U K B U E C
酮 式 烯 醇 式
8
第五章 工业微生物育种诱变剂
5-BU掺入错误
G≡ C
A:T
G ≡ BUe G ≡ C G ≡ C A=BUk
第五章 工业微生物育种诱变剂
• 如果是处理细菌，亚硝酸最后浓度以0.05mol/L为例：将 斜面新鲜菌体移入肉汤培养基，适温培养到对数期，将培养 液进行离心，弃去上清液，用生理盐水洗涤。pH4.5醋酸缓 冲液和0.1mol/L硝酸钠溶液1:1浓度加入沉淀的菌体中，使 之悬浮。于35—37℃处理5—10min、加入5倍的pH8.6的磷 酸氢二钠溶液，使pH下降到6.8。取一定量进行后培养1.5— 2h。然后稀释分离于平板上。
微生物育种――诱变育种
微生物育种――诱变育种微生物育种――诱变育种摘要分析了近几年国内外对微生物诱变育种领域的研究新进展，对生物学效应及诱变微生物机理进行总结。
从物理诱变、化学诱变方面的诱变效应和作用机制及育种在酶制剂、抗生素、氨基酸、维生素及杀虫剂等高产菌种选育中的应用；对该技术与空间技术的结合在微生物菌种选育中的应用前景进行了分析。
关键词诱变微生物育种展望诱变育种是通过诱变剂的处理提高菌种突变的几率，从中筛选出具有优良特性的变异菌株，也是通过诱发基因突变为手段的微生物育种技术。
1927年发现X射线具有增加突变率的效应；1944年发现氮芥子气的诱变效应；其后，人们陆续发现了许多物理的和化学诱变因素。
诱变育种其操作简便，突变率高，突变谱也广，不仅提高产量，改良质量还可以扩大产品的品种和简化工艺条件，随着新的诱变因子不断发现和筛选体系进一步的完善，微生物的诱变育种有了开展。
一、诱变方法物理诱变1、紫外照射：是诱发微生物突变的常用的非常有用的物理诱变方法之一，紫外辐射的作用有许多解释，比拟确定的作用是能够使DNA 分子形成嘧啶二聚体，阻碍碱基也碱基之间正常配对。
2、电离辐射：是电离生物学上有高能量的产生电离作用，应用最广泛的电离射线之一，可直接或间接的变化DNA 结构。
直接效应可以氧化脱氧核糖的碱基，间接效应是使水或有机分子产生自由基。
3、激光：是一种光量子流，能量密度高、靶点小而且单色性与方向性都好的光微粒。
这种辐射通过产生光、热等效应的综合应用，直接、间接影响有机体，从而引起细胞染色体畸变效应和酶的激活与钝化。
4、微波：是一种有较强生物效应的低能电磁辐射，对生物体有热效应或非热效应。
热效应指它能引起生物体局部温度上升，非热效应是在其作用下，生物体产生非温度关系的各种反响。
所以，微波也被用作多个领域的诱变育种。
化学诱变1、烷化剂：诱发突变中一类相当有效的化学诱变剂，引起DNA 复制碱基配对的转换而遗传变异。
常用的烷化剂都有甲基磺酸乙酯、亚硝基胍或硫酸二乙酯等。
微生物诱变育种的方法
微生物诱变育种的方法微生物，这小小的生物世界里的居民，有着大大的能量。
而诱变育种呢，就像是给微生物来一场奇妙的变身之旅。
物理诱变是一种常见的法子。
紫外线就像是微生物世界的严厉教官。
微生物们在紫外线的照射下，就如同小士兵接受艰苦的训练。
紫外线那强烈的能量，会打乱微生物内部的基因结构。
比如说一些细菌，原本规规矩矩地按照自己的基因蓝图进行生长繁殖，紫外线一照，就像打乱了建筑图纸一样，基因里的一些部分发生了错乱。
有的微生物在这错乱中就产生了新的特性，也许原本不会产生某种特殊酶的，经过紫外线照射后就有了这种能力。
还有X射线，这可是更厉害的家伙。
如果把微生物比作是一个精密的小机器，X射线就像一把强力的干扰器。
它能深深钻进微生物的内部，对基因进行破坏和重组。
就像把小机器里的一些零件拆下来又重新组装，只不过这里是在基因层面。
有的微生物经X射线诱变后，抗逆性变强了。
原本在稍微恶劣一点的环境里就奄奄一息的，现在能坚强地活下去，而且还活得挺好。
化学诱变也不甘示弱。
化学诱变剂就像是给微生物的基因施魔法的小巫师。
像亚硝酸，它悄悄地接近微生物的基因，把基因里的一些碱基偷偷换掉。
这就好比在密码锁上换了几个密码数字，整个密码锁的开锁方式就可能完全变了。
微生物的基因表达也就随之改变。
一些霉菌经过亚硝酸诱变后，产孢子的能力可能大大增强，原本产一点点孢子的，现在像开了挂一样大量产孢子。
再说说碱基类似物，它们是伪装高手。
它们混入微生物的基因大厦里，伪装成正常的碱基。
可是一旦到了基因复制的时候，就开始捣乱了。
就像一个假零件混进了真零件堆里，在机器组装的时候就会出问题。
这种捣乱会导致基因复制出错，从而产生突变。
有的酵母菌经过碱基类似物的诱变后，发酵能力变得超强，能产生更多的酒精或者其他有用的代谢产物。
复合诱变就像是给微生物来一套组合拳。
先给微生物来点物理诱变，就像先给它一个下马威，打乱它的基因阵脚。
然后再用化学诱变，进一步在混乱的基因里搞点新花样。
工业微生物育种学5
介绍几种烷化剂 及其诱变处理方法
Ⅰ亚硝基胍
亚硝基胍的结构式
亚硝基胍的性质
亚硝基胍是1-甲基-3-硝基-1-亚硝基胍的简称， 简写成NTG、NG或MNNG。
亚硝基胍为黄色结晶状物质，性质稳定，遇光易 分解，放出NO，颜色由黄变绿，诱变效应降低。 NTG不溶于水，须加助溶剂（甲酰胺或丙酮）
碱基类似物诱变的具体机制
正常的碱基存在着同分异构体，碱基类似物也 一样有同分异构现象，它是由电子结构改变引 起的。在嘧啶分子中异构现象以酮式和烯醇式 两种形式存在，在嘌呤分子中异构现象以氨基 和亚氨基两种形式存在。 一般互变异构现象在碱基类似物中比正常DNA 四种碱基中出现的频率高。而不同的异构体对 应的互补碱基是不同，由此造成基因的突变。
①取新鲜、年轻的斜面，用pH值一定的磷酸 缓冲液或tris缓冲液洗下细菌做成菌悬液。如 果细菌细胞或丝状菌孢子需进行前培养的，可 用有关培养基代替缓冲液，培养结束后离心洗 净，用同一种缓冲液做成菌悬液，浓度约控制 在106~107个/mL。 这一步的主要目的是使材料处于生长代谢的旺 盛期，有利于诱变。
脱氨基作用
脱氨基作用主要有三种变化： 腺嘌呤（A）变为次黄嘌呤（H）； 胞嘧啶（C）变为尿嘧啶（U）； 鸟嘌呤（G）变为黄嘌呤（X）。
腺嘌呤→次黄嘌呤
A→H时，第一次DNA 复制后次黄嘌呤不与 胸腺嘧啶（T）配对， 而与胞嘧啶配对，第 二次复制后，A：T就 变成了G：C。 脱氨基后碱基转换。
本节主要内容
介绍几种主要的化学诱变剂
二、化学诱变剂的种类
化学诱变剂种类
碱基类似物 烷化剂 脱氨剂 移码诱变剂 羟化剂 金属盐类 其他诱变剂
（一）碱基类似物
工业微生物菌种的选育——诱变选育(1)
工业微生物菌种的选育——诱变选育（1）工业微生物菌种的选育——诱变选育（1）诱变选育诱变育种是指利用各种诱变剂的物理因素和化学因素处理微生物细胞，提高基因突变频率，再通过适当的筛选方法获得所需的高产优质菌种的育种方法。
诱变育种具有速度快、方法简便等优点，是当前菌种选育的一种主要方法，使用普遍。
诱变育种的理论基础是基因突变，所谓突变是指由于染色体和基因本身的变化而产生的遗传性状的变异。
诱变育种的步骤与方法（一）、工业育种的一般步骤（图）（二）、诱变育种方案设计诱变育种方案包括突变的诱发、突变株的筛选和突变高产基因的表现。
1、出发菌株的选择工业上用来进行诱变处理的菌株，称为出发菌株。
出发菌株选择目前主要依据实际经验，总结如下：①以单倍体纯种为出发菌株；②采用具有优良性状的菌株；③选择对诱变剂敏感的菌株；④许多高产突变往往要经过逐步累积的过程，才变得明显，所以有必要多挑选一些已经过诱变的菌株为出发菌株，进行多步育种，确保高产菌株的获得。
2、出发菌株的纯化为什么要对出发菌株进行纯化呢？这是因为微生物容易发生变异和染菌，同时一般丝状菌的野生菌株多为异核体。
生产菌在不断移代过程中，菌丝间接触、吻合后，易产生异核体、部分结合子、杂合二倍体及自然突变株等。
这些都会造成细胞内遗传物质的异质化，使遗传性状不稳定。
通过纯种分离，从中挑选所需的优良菌株。
常用划线分离和稀释分离法，并结合显微镜操纵器分离单孢子。
3、单孢子悬液的制备诱变育种要求所处理的细胞必须是处于对数生长期同步生长的细胞，并且是均匀状态的单细胞悬液。
首先是细胞的生理状态对诱变处理也会产生很大的影响，如细菌在对数期诱变处理效果较好；霉菌或放线菌的分生孢子一般都处于休眠状态，所以培养时间的长短对孢子影响不大，但稍加萌发后的孢子则可提高诱变效率。
其次是分散状态的细胞可以均匀地接触诱变剂，又可避免长出不纯菌落。
由于在许多微生物的细胞内同时含有几个核，所以即使用单细胞悬浮液处理，还是容易出现不纯的菌落。
第五章工业微生物育种诱变剂共62页文档
➢ 在DNA复制过程中取代正常碱基，整合进 DNA分子 ➢ 它们产生异构体的频率高，出现碱基错配的 概率也高
5
（一）碱基类似物的诱变机制
——现以5-BU为例来分析碱基类似物的诱变机制。当胸 腺嘧啶分子结构中5位碳原子上的甲基被溴（Br）原子取 代，就构成了5-BU的结构式。
C
U
A
次黄嘌呤H
16
亚 硝 酸 的 脱 氨 基 作 用 及 其 诱 发 的 突 变
17
亚硝酸诱发的突变
H N O 2 A H GG A A T C CC U T
H N O 2
A:T G┆C
18
亚硝酸的处理方法
1. 试剂的配制
（1）1mol/LpH4.5醋酸缓冲液 （2）0.1mol/L亚硝酸钠溶液
由于羟胺是诱发G:C
A:T的专一性诱变剂，因
此，可以用来鉴别突变体是A:T G:C还是G:C
A:T转换。
羟胺的处理方法：常用浓度为0.1—5%，可直接 在溶液中处理，时间1—2h，然后分离培养。但一般 都加到琼脂平板或振荡培养基中，然后接入孢子或 细菌，在适温下培养，生长过程中处理，所用浓度 比直接处理时低些。
（3）0.07mol/LpH8.6磷酸氢二钠溶液
2.处理方法（以处理浓度0.025mol/L为例）
• 取孢子悬液1ml，pH4.5醋酸缓冲液2ml及0.1mol/L亚硝酸钠溶 液1ml，最后处理浓度为0.025mol/L。于25—26℃保温10— 20min，加入0.07mol/L、pH8.6的磷酸氢二钠溶液20ml，使 pH下降至6.8左右，以终止反应。稀释分离于平板。
3．烷化剂
——烷化剂是诱发突变中一类相当有效的化学诱变剂， 这类诱变剂具有一个或多个活性烷基，它们易取代DNA 分子中活泼的氢原子，直接与一个或多个碱基起烷化反 应，从而改变DNA分子结构，引起突变。
5工业微生物育种诱变剂
X射线波长是0.06~136纳米， X射线一般由X光机产生。 γ射线的波长是0.006~1.4纳米 ，γ射线来自放射性元素钴、
镭或氡等。 中子可以从回旋加速器、静电加速器或原子反应堆中产生 快中子具有的能量最高，为0.2~10MeV
电离辐射诱变机理
直接作用：打断化学键 间接作用：通过自由基打断化学键，引起缺失和损伤 • 效应：染色体畸变，碱基置换，移码突变
1.4 非电离辐射——紫外线
–2. 紫外线诱变
(4) 紫外线诱变的步骤与方法
① 出发菌株：把细菌斜面培养到对数期，霉菌或放线菌则培养到孢子 刚成熟。
② 前培养：营养丰富的培养基+抑制修复物质，如咖啡碱或异烟肼等。 霉菌、放线菌培养到绝大部分孢子刚刚萌发。
③ 制备菌悬液：离心去除培养基，用生理盐水制备菌悬液，分散程度 达90~95%。要求菌悬液浓度：细菌约1×108个/毫升，放线菌107~108 个/毫升，霉菌约106~107个/毫升。
1.4 非电离辐射——紫外线
136-390nm
1.4 非电离辐射——紫外线
紫外线可由紫外灯管产生。要求的设备 简单、操作方便、价格低廉。
紫外线诱变效果显著。诱变频率高，而 且不易发生回复突变。
因此紫外线是一种使用最早也是沿用最 久的应用效果最明显的物理诱变剂。
DNA分子能吸收紫外线光谱。其中嘧啶碱基比嘌呤碱基敏感上 百倍。 紫外线使DNA分子发生如下几种变化：①DNA与蛋白质交联； ②胞嘧啶和尿嘧啶之间的水合作用；③DNA链的断裂；④形成 嘧啶二聚体。这是紫外线引起的主要变化。
碱基类似物：是指其分子结构同DNA分子中的碱基非常类 似，因此能取代碱基掺入到DNA分子中的一类化合物。 主要诱变剂：5-溴尿嘧啶（5-BU） /T
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三、非电离辐射——紫外线
紫外线是电磁波谱中波长从0.01~0.40微米辐射 的总称，不能引起人们的视觉。电磁谱中波长0.01~ 0.04微米辐射，既可见光紫端到X射线间的辐射。
绝对剂量单位：erg/mm2 相对剂量单位：用照射时间或杀菌率表示。一般认为杀 菌率在90%~99.9%时，诱变效果较好。
移动式紫外灯
15W紫外灯
不同微生物所需杀菌时间
15W功率的紫外灯管和固定距离为30cm的条件下 照射微生物，要使杀菌率达到90％～99.9％的效果：
芽孢菌约需10 min； 照射短小芽孢杆菌的营养体来获得缺陷型需要1～3 min； 一般微生物营养体照射3～5min； 无芽孢菌和革兰氏阳性菌只需0.5～2 min。
在实际诱变工作中要采取某些措施避免暗修复，如 加入某些物质，提高突变频率。
（二）紫外线诱变
1. 紫外线的有效光谱
最有效波长为253.7 nm（2537Å），即260 nm的紫外 线。
30W紫外灯光谱分布范围广，诱变效率差，15W紫外 灯80%波长几种在2537Å，诱变效果比30W的好。
2. 紫外线的辐射剂量
第五章 工业微生物育种诱变剂
诱变剂：凡能诱发生物基因突变，并且突变频率远 远超过自发突变率的物理因子或化学物质。
（1）物理诱变剂，例如，电离辐射、紫外线、电 磁波等
（2）化学诱变剂，如药品、农药、食品添加剂、 调味品、化妆品、洗涤剂、塑料、着色剂、 化肥、化纤等。
（3）生物诱变剂，如真菌的代谢产物、病毒、寄 生虫等。
非常好的防护 4.1－2.6
25，30，35
40－50，50＋ 非常优异的防护 ≤ 2.5
40，45，50，50＋
（一）紫外线的诱变机制和DNA损伤修复
1. 紫外线的诱变机制 紫外线引起：
DNA与蛋白质的交联； 胞嘧啶与尿嘧啶之间的水合作用； DNA链的断裂； 嘧啶二聚体的形成（单链上相邻两个胸腺嘧啶之
紫外线诱变的步骤与方法：
（1）出发菌株，把细菌斜面培养到对数期，霉菌或放线菌则培养 到孢子刚成熟。
（2）前培养，营养丰富的培养基，同时加入抑制修复的物质（咖 啡碱或异烟肼），达到最佳生理状态。
（3）制备菌悬液；
（4）紫外线照射，暗室进行，或诱变后立即浸入冰水中1～2 h， 低温抑制突变修复。
（5）后培养，根据延迟现象的原理，照射完毕的菌悬液加入到适 合于正突变体繁殖的培养基，在适宜温度下培养1.5～2 h。
一、物理诱变剂的生物学效应
物理诱变剂对微生物的诱变作用主要是由高 能辐射导致生物系统损伤，继而发生遗传变异的 一系列复杂的连锁反应过程。分为物理、物理－ 化学、化学和生物学等几个阶段。
电离辐射主要引起DNA上的基因突变和染色 体的畸变。
非电离辐射主要导致形成嘧啶二聚体。
二、辐射引起生物效应的因素
紫外线强烈作用于皮肤时，可发生光照性皮炎， 皮肤上出现红斑、痒、水疱、水肿等；严重的还可引 起皮肤癌。
紫外线作用于中枢神经系统，可出现头痛、头晕、 体温升高等。作用于眼部，可引起结膜炎、角膜炎， 称为光照性眼炎，还有可能诱发白内障，在焊接过程 中产生的紫外线会使焊工患上电光性眼炎。
目前，国内外的标准对纺织品的防紫外线性能一 般都使用UPF值，即紫外线防护系数值进行评定。 1. UPF值是紫外线对未防护的皮肤的平均辐射量的比 值，UPF值越大，表明防紫外线性能越好。
1801年德国物理学家里特发现在日光光谱的紫 端外侧一段能够使含有溴化银的照相底片感光，因而 发现了紫外线的存在。
自然界的主要紫外线光源是太阳。太阳光透过大气 层时波长短于290×10-9米的紫外线为大气层中的臭 氧吸收掉。人工的紫外线光源有多种气体的电弧(如 低压汞弧、高压汞弧)，紫外线有化学作用能使照相 底片感光，荧光作用强，日光灯、各种荧光灯和农业 上用来诱杀害虫的黑光灯都是用紫外线激发荧光物质 发光的。紫外线还可以防伪。紫外线还有生理作用， 能杀菌、消毒、治疗皮肤病和软骨病等。紫外线的粒 子性较强，能使各种金属产生光电效应。
2. 只有当UPF＞30时，并且UVA的透过率小于5％时，才 能称为防紫外线产品，防护等级标识为UPF30＋；
3. 而当UPF＞50时，则表明该产品的紫外线防护性能极 佳，防护等级标识为UPF50＋。
UPF范围 15－24 25－39
防护分类
紫外线透过率（％） UPF标识
较好防护
6.7－4.2
15，20
电离辐射：X射线和γ射线、快中子 非电离辐射：紫外线
室外活体辐照圃 室内辐照源
辐射离我们有多远 在我们的生活环境中，辐射无处不在！ 家用电器：微波炉、吸尘器、电视、电冰箱、空调等；
办公设备：手机、电脑、复印机、电子仪器、医疗设备等 家庭装饰：大理石、复合地板、墙壁纸、涂料等 周边环境：高压线、变电站、电视（广播）信号发射塔等 自然环境：太阳黑子等
（6）稀释涂皿，后培养结束后，从中取一定量培养物，作不同稀 释度，涂皿，并且以未经紫外线照射过的菌悬液作对照，培 养后，挑取菌落，以待筛选。
四、电离辐射
伦 琴 和 射 线
间或双链相对应的两个胸腺嘧啶之间）。
紫外线可使空气中的Ｏ 分子变成Ｏ 臭氧易分解放
2
3
出原子氧→强杀菌作用。
Ｏ 紫外线 2
O3→ O2＋[O]
2. DNA损伤修复
包括光修复、切补修复、重组修复、SOS修复系统 及聚合酶的校正作用。 （1）光复活
一般微生物中都存在光复活作用，紫外线诱变时，照 射或分离均应在红光下进行。 （2）切补修复
生物体内还有一些内源性诱变剂。内源性诱变剂是 在人体健康异常的情况下产生的，如遗传因素、内 分泌紊乱等。
第一节 物理诱变剂
物理诱变剂是指通常使用的物理辐射中的各种射线。
射线的种类
射线包括：紫外线、X射线、γ射线、快中子、α射 线、β射线、微波、超声波、电磁波、激光射线和宇 宙线等。
物理辐射分为电离辐射和非电离辐射，பைடு நூலகம்是以量 子为单位的可以发射能量的射线。