基于化学荧光测定的板蓝根抗病毒效价检测方法的建立
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ＦＬＵＯｓｔａｒ ＯＰＴＩＭＡ荧光酶标检测仪，德国ＢＭＧ公司； ９６孔荧光酶标板，美国ＣＬＬｑＴＡＲ公司。
。
１．３ ＮＡ的制备 参照文献方法［１厶１３］，对培养的ＭＤＣＫ细胞接种流感病
毒（Ａ／ＰＲ８／３４标准株），待完全感染病变后取滤除细胞的病
毒液，加ＮＰ－４０灭活，用０．２２肿滤器滤过后分装，作为
检定５拿来源扳蓝校鹃效徐，结果冤表ｌ。
Ｔａｂｌｅ １ Ｂｉｏｐｏｔｅｎｃｙ ｒｅｓｕｌｔｓ ｏｆ ｅａｃｈ ｓａｍｐｌｅ
Ｎｏｔｅ：＊Ｒｅｌｉａｂｉｌｉｔｙ ｔｅｓｔ：ｄｅｖｉａｔｉｏｎ ｆｒｏｍ ｓｔｒａｉｇｈｔ ｌｉｎｅ Ｐ＞０．０５，ｄｅｖｉａｔｉｏｎ ｆｒｏｍ ｐａｒａｌｌｅｌ ｌｉｎｅ Ｐ＞０。０５； ▲Ｉｎｆｅｒｉｏｒ ｑｕａｌｉｔｙ ｓａｍｐｌｅｓ，ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ ｂｙ ｒｏｕｔｉｎｅ ｍｅｔｈｏｄ（ｅｘｐｉｒｅｄ ｓａｍｐｌｅｓ，ｇｏｔ ｆｒｏｍ ｍａｒｋｅｔ）
Ｃｏｎｅｅｎｔｒａｔｉｏｎ／（ｍｇ·ｍＬ一１）
Ｆｉｇ．３ Ｄｏｓｅ－ｅｆｆｅｃｔ ｒｅｌａｔｉｏｍｈｉｐ
０．１２
由图２可见药物作用组荧光强度随样品浓度的增加而递 减，而背景对照组（ＭＩ跗ＡＮＡ＋板蓝根）荧光强度并没有相 应减弱（反而略有增加，可能与样品自身含少量荧光成分有 关，在计算中予以扣除），可见板蓝根通过抑制ＮＡ的活性使 荧光性产物（７－Ｈｙｄｒｏｘｙ－４－ｍｅｔｈｙｌｃｏｕｍａｒｉｎ）生成量减少而表 现出测得荧光值下降。扣除背景荧光后，通过与空白组（未 加药物组）比较（转化成抑制率），抑制率与剂量之间是一条 长尾的“肩斜”型曲线（图３），剂量对数转换，则呈对称的“Ｓ” 型曲线，属典型的药理反应量效曲线Ｌｌ引，经计算本反应体系 中板蓝根对ＮＡ的抑制活性ＩＣｓｏ一（ｏ．９０土０．２０）ｍｇ（生药）
Ｆｉｇ，２ Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｂｅｔｗｅｅｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｎｏｎｒｅａｃｔｉｏｎ ｆｏｒ ｒａｄｉｘ ｉｓａｔｉｄｉｓ ｗｉｔｈ ＮＡ
１：１３１ａｎｋ；２：Ｔｅｓｔ ｏｆ ｓａｍｐｌｅｓ；３：Ｂａｃｌ【ｇｒｏｕｎｄ ∞
∞ ∞
们
ｏｑ正＿Ｉｏ葛。月与嗣 ∞
Ｏ
０
０．０２
Ｏ．０４
Ｏ．Ｉ）６ ０．∞０．１
分别于０，１，２，３，４ ｈ将冷藏保存于４℃的同一供试晶 溶液进行效价检测，计算ＲＳＤ为４．７５％，结果说明供试晶 溶液在４℃保存条件下４ ｈ内怒稳定的。 ３．４不同来源板蓝摄抑制ＮＡ活性的毙较
按照上法溺定不嗣产瑰叛鏊搬撵燕在稷霹生药浓度下对
ＮＡ的抑制活性，以凝（对数浓度）／效（抑制率）关系作图（图 ４）。结果可见不同来源样晶间对ＮＡ活性的抑制率有明显的 差异，与对照药材相比来源于甘肃的板蓝根各浓度抑制率显 著较高（Ｐ＜ｏ．０１），“劣成板蓝根”是长年放置的陈货，常规 鉴别为“劣药”，其抑制率也最低，与对照药材相比麓髯显著 （Ｐ＜ｏ。０１），提示通过ＮＡ的活性测定可以定性袭德板菠根 品质戆差异。
收稿日期：２００８－０５－０２。修订日期：２００８４）８－０６
基金项目：国家杰出青年科学基金项目（３０６２５０４２）和国家“十一直”科技支撑计划课题（２００６ＢＡｌ０８８０３）资助
作者简介：李寒冰，１９７３年生，解放军第３０２医院全军中药研究所药学博士 ＊通讯联系人 ｅ－ｍａｉｌ：ｐｈａｒｒｎａｃｙ３０２｛园１２６．ｃｏｍ
上述实测结果反映出样晶间生物效价的差异性，与药理 活性的检测结果趋势相同。同时常规鉴别方法判为劣药的样 黼其效价值最低，两种方法的结果具有一致性，提示该方法 能够定量刻划板蓝根的品质熬异。
３．１板蓝根抑制ＮＡ活性检测 按上述条件和加样方法进行加样，反应结束后检测各组
荧光值并比较，作为样品对ＮＡ抑制活性计算的参数（图２）。 按２．３（１）所列反应率计算公式计算各浓度样品的抑制率，与 样品浓度作图（图３）。
臼罚岳§ｏｕ二。譬翌声Ｉ＿ｌＴ
Ｆｉｇ．１
Ｓｃｈｅｍａｔｉｃ ｄｉａｇｒａｍ ｏｆ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｆｏｒ ＮＡ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ａｃｔｉｖｉｔｙ
按上述条件，取工作对照黼配成不同浓度溶液，点样于 ９６孔板中参与酶促反应，绱泶后用ＦＬＵ（）ｓｔａｒ ＯＰＴＩＭＡ酶 标仪进行连续６次荧光扫描，计算每孑Ｌ荧光值的变异系数。 结果ＲＳＤ值在０．５％～１．５％之阔，表明仪器精密度良好。 ３．３．２重复往考察
弱一撬群瑟分５次提取，按上法与工幸＃对照晶溶滚送行 瓣魄检定，计算效价著求审阅德的变异系数。ＲｓＤ一５．７８％， 液明该方法具有较好的重复性。 ３．３．３稳定性考察
ＮＡ的原酶液，－－７０℃冻存备用。
各组样品设复孔加样。根据各组荧光值（取复孔的平均值）计
算各样品的抑制活性（２．３．１所列公式）。
２．３数据处理与效价计算
Βιβλιοθήκη Baidu
Ｉ－－嚆黼蒜耘琶㈣×１００ （１）反应抑制率（Ｄ计算公式
酶活性对照荧光一背景荧光
ｏＡ。。
（２）效价计算：ＰＴ—Ｒ·Ｐ。（Ｐ。为工作对照品的效价约定为１
１仪器与材料
１．１药材及试剂 板蓝根药材，经解放军中药研究所肖小河研究员鉴定为
来源于十字花科（Ｃｒｕｃｉｆｅｒａｅ）植物菘蓝Ｉｓａｔｉｓ ｉｎｄｉｇｏｔｉｃａ Ｆｏｒｔ． 的干燥根；达菲胶囊（Ｏｓｅｌｔａｍｉｖｉｒ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ Ｃａｐｓｕｌｅｓ），批号 Ｂ１２１２，Ｒｏｃｈｅ ｐｈａｒｍａ（Ｓｃｈｗｅｉｚ）公司；取板蓝根对照药材（中 国药品生物制品检定所），制成醇提取物（得率７．７０％），作
２．２反应条件与加样方法 ２．２．１样品制备
制取板蓝根乙醇提取物，用时加水溶解，微孔滤膜 （Ｏ．２２肚ｍ）滤过，将滤液等比稀释成供试品溶液。另取工作 对照品制成每１ ｍＬ含５０ ｍｇ的对照品溶液，与供试品相同 的剂距稀释成工作对照品溶液。 ２．２．２反应条件与加样
参考已广泛应用的ＮＡ活性测定方法［１３Ｊ“，为便于对 比，将反应设置在９６孔荧光酶标板中进行。经考察，ＭＵ－ ＮＡＮＡ的浓度为０．０２ ｍｍｏｌ·Ｌ～，酶浓度对原酶液进行１０ 倍稀释（原酶液是在定量的细胞和培养液条件下接种定量的 病毒按规范操作成的酶液）时反应的信噪比最大，灵敏度较 好。反应体系中首先加入２５弘Ｌ稀释的原酶液和２５ ｐＬ样品 溶液，室温作用３０ ｍｉｎ后加５０“Ｌ ＭＵＮＡＮＡ，３７℃孵育 ６０ ｒａｉｎ后加入终止液终止反应，测定荧光强度值，激发波长
第２９卷，第４期 ２ ０ ０ ９年４月
光谱学与光谱分析 Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ ａｎｄ Ｓｐｅｃｔｒａｌ Ａｎａｌｙｓｉｓ
Ｖ０１．２９，Ｎｏ．４，ｐｐ９０８—９１２ Ａｐｒｉｌ，２００９
基于化学荧光测定的板蓝根抗病毒效价检测方法的建立
李寒冰１’２，鄢 丹１，金 城１，王伽伯１，魏 丽１’２，肖小河¨，曹俊岭３
万方数据
９１０
光游攀奄光谱分祈
第２９卷
·ｒａｔ，～。 ３．２板蓝根与阳性对照药量效关系比较
结果表明板蓝根量效关系曲线与阳性对照药达菲相似， 说明两者与ＮＡ的作用方式殷作用规律相近。将反应率转换 成概率单位后，对数剂量与反成函数呈直线关系，板蓝根＿燃 效越线的回归方程ｙ一８。７２５ ９＋ｌ。２１６ ９×ｌｏｇ＜Ｄ），Ｒ２— ０．９９９，说鹱该反应适会惩垒物捻定孛“质反应平行线测定” 浚遴行效价测定陆强】。 ３．３方法学考察 ３．３．１仪器精密度考察
ｅ－ｍａｉｌ：１ｈｂ８８９９（园１６３．ｔｏｍ
万方数据
第４期
光谱学与光谱分析
为工作对照品；ＮＡ底物，４－ｍｅｔｈｙｌｕｍｂｅｌｌｉｆｅｒｙｌ－Ｎ－ａｃｅｔｙｂａ－Ｄ－ ｎｅｕｒａｍｉｎｉｃ ａｃｉｄ（ＭＵＮＡＮＡ）Ｓｉｇｍａ公司；Ｎｐ－４０，ＦＩｕｋａ公 司；ＤＭＥＭ，ＧＩＢＣＤ公司；其余为分析纯。 １．２主要仪器
Ｕ·ｍｇ叫）。具体算法由根据“质反应的平行线测定（４·４）
法＂［１５］效价测定原理编制的计算软件完成。
３结果与讨论
２实验方法
２．１ ＮＡ体外荧光检测原理 化合物ＭＵＮＡＮＡ是ＮＡ的特异性底物，在ＮＡ作用下
的产物４ＭＵ（７一Ｈｙｄｒｏｘｙ－４－ｍｅｔｈｙｌｃｏｕｍａｒｉｎ，Ｃ４０ Ｈ８０３）在３５５ ｎｍ入射波长激发下，可以产生４６０ ｎｎｌ荧光，采用荧光检测 器测定该波长荧光强度的变化，可灵敏地反应ＮＡ活性Ｌｌ钉； 同样，如果反应体系中加入能够抑制ＮＡ活性的药物，则荧 光强度会相应减弱，从而该药物的ＮＡ抑制活性就能通过荧 光强度的变化被表征（见图１）。
近年来，化学荧光法测定流感病毒神经氨酸酶（ＮＡ）的 体外活性用以评价流感病毒的活力已被广泛采用。ＮＡ在流 感病毒的复制、感染和致病过程中起重要作用，通过抑制 ＮＡ活性，可有效地控制流感症状和疾病的传播［５“］。因此， 通过测定ＮＡ与药物作用以后活性变化，可以反映药物的抗 流感病毒活性，目前该方法已成为抗流感病毒药（包括植物 药）的体外筛选方法之一［７］。ＮＡ活性的体外化学荧光测定
法具有灵敏、快捷、可定量、重复性好等特点，是较理想的 药物体外生物活性检测方法，然而在中药的抗病毒活性筛选 和评价中还未见报道，尤其是未见将该方法按生物检定的统 计学原理设计和条件优化后用于抗病毒类中药的生物效价检 测，进而用于中药的质量控制和品质评价。
板蓝根（ＲＡＤＩＸ ＩＳＡＴｌＤＩＳ）是常用的防治感冒中药，临 床疗效可靠，文献报道其具有确切的抗流感病毒作用陪１１］， 预试验表明板蓝根具有明显的体外抑制ＮＡ作用。本文采用 化学荧光法系统考察了板蓝根的体外抑制ＮＡ作用，并以此 为基础，建立了板蓝根抗流感病毒效价检测方法作为其质量 评价方法。一方面可以提高其自身质量控制水平，另一方面 为其他药效物质不清楚中药质量的生物控制研究提供参考。
３５５劬，发射波长４６０ ｎｎ－ｔ，测定温度３７℃。为便于活性比
较，同时设样品测试组（ＮＡ＋样品＋ＭＵＮＡＮＡ），背景对照 组（样品＋ＭＵＮＡＮＡ，ｂｕｆｆｅｒ补足至相同体积），酶活性对照 组（ＮＡ＋ＭＵＮＡＮＡ，反应终止后再加入同体积样品溶液）。
Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｓａｍｐｌｅｓ／（ｍｇ·ＩｎＬ一１）
１．解放军第３０２医院全军中药研究所，北京１０００３９ ２．成都中医药大学药学院，四川成都６１００７５ ３．北京中医药大学东直门医院药学部，北京１００７００
摘要荧光测定法在化学分析和生物检测中已广泛应用，将该法引用到中药的生物效价检测中则是一种 新的尝试。而生物效价检测与药效直接相关联，是研究中药质量控制与品质评价方法的新趋势。为了建立与 抗病毒药效相关的板蓝根质量控制和评价方法，采用化学荧光测定法考察了板蓝根提取物对流感病毒神经 氨酸酶（ＮＡ）的体外抑制活性，分析了其药理作用的量效曲线变化趋势和作用规律。在此基础上并根据生物 检定的统计学原理，以“质反应平行线”法设计和优化检测条件，建立了板蓝根抗病毒生物效价荧光检测方 法。实际测试结果能够灵敏、定量表征样品间的品质差异，方法的可靠性和可重复性较好。以此作为板蓝根 质量生物控制和评价方法，能够体现中药药效特点。
关键词化学荧光测定；抗病毒效价；板蓝根；生物测定 中图分类号：０６５７．３ 文献标识码：Ａ ＤＯＩ：１０．３９６４／ｊ．ｉｓｓｍ １０００－０５９３（２００９｝０４－０９０８－０５
，
引言
将生物效价（Ｂｉｏｐｏｔｅｎｃｙ）测定方法引入到中药质量控制 和品质评价中来，是现今中药质量控制模式和方法研究的重 要发展方向［１’２］。建立和优选适宜的生物效价检测方法是中 药质量生物控制模式的关键点也是难点。当前在中药质量评 价中已应用的有益母草缩宫素生物效价检测法［３］，部分清热 解毒中药的小鼠抗炎、镇痛、解热以及毒性致死卧］等生物效 价检测方法。这些方法多是基于药物对整体或离体组织的定 性或定量药理实验，存在影响因素多、精密度相对较低、费 用高、周期长等弊端。质量控制不同于药效研究，所用方法 除了要求临床疗效相关外，更应满足定性／定量准确、灵敏 快捷、简单、重现性好等基本要求。
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对燕药材
Ｆｉｇ．４
ｌｏｇｄｏｓｅ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｓ ｏｆ ＮＡ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｒａｄｉｘ ｉｓａｔｉｄｉｓ ｆｒｏｍ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｐｌａｃｅｓ
３．５不同产地板蓝根抗病毒效价的测定 以工作对照品为参比，按照上述效价测定和计算方法，
。
１．３ ＮＡ的制备 参照文献方法［１厶１３］，对培养的ＭＤＣＫ细胞接种流感病
毒（Ａ／ＰＲ８／３４标准株），待完全感染病变后取滤除细胞的病
毒液，加ＮＰ－４０灭活，用０．２２肿滤器滤过后分装，作为
检定５拿来源扳蓝校鹃效徐，结果冤表ｌ。
Ｔａｂｌｅ １ Ｂｉｏｐｏｔｅｎｃｙ ｒｅｓｕｌｔｓ ｏｆ ｅａｃｈ ｓａｍｐｌｅ
Ｎｏｔｅ：＊Ｒｅｌｉａｂｉｌｉｔｙ ｔｅｓｔ：ｄｅｖｉａｔｉｏｎ ｆｒｏｍ ｓｔｒａｉｇｈｔ ｌｉｎｅ Ｐ＞０．０５，ｄｅｖｉａｔｉｏｎ ｆｒｏｍ ｐａｒａｌｌｅｌ ｌｉｎｅ Ｐ＞０。０５； ▲Ｉｎｆｅｒｉｏｒ ｑｕａｌｉｔｙ ｓａｍｐｌｅｓ，ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ ｂｙ ｒｏｕｔｉｎｅ ｍｅｔｈｏｄ（ｅｘｐｉｒｅｄ ｓａｍｐｌｅｓ，ｇｏｔ ｆｒｏｍ ｍａｒｋｅｔ）
Ｃｏｎｅｅｎｔｒａｔｉｏｎ／（ｍｇ·ｍＬ一１）
Ｆｉｇ．３ Ｄｏｓｅ－ｅｆｆｅｃｔ ｒｅｌａｔｉｏｍｈｉｐ
０．１２
由图２可见药物作用组荧光强度随样品浓度的增加而递 减，而背景对照组（ＭＩ跗ＡＮＡ＋板蓝根）荧光强度并没有相 应减弱（反而略有增加，可能与样品自身含少量荧光成分有 关，在计算中予以扣除），可见板蓝根通过抑制ＮＡ的活性使 荧光性产物（７－Ｈｙｄｒｏｘｙ－４－ｍｅｔｈｙｌｃｏｕｍａｒｉｎ）生成量减少而表 现出测得荧光值下降。扣除背景荧光后，通过与空白组（未 加药物组）比较（转化成抑制率），抑制率与剂量之间是一条 长尾的“肩斜”型曲线（图３），剂量对数转换，则呈对称的“Ｓ” 型曲线，属典型的药理反应量效曲线Ｌｌ引，经计算本反应体系 中板蓝根对ＮＡ的抑制活性ＩＣｓｏ一（ｏ．９０土０．２０）ｍｇ（生药）
Ｆｉｇ，２ Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｂｅｔｗｅｅｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｎｏｎｒｅａｃｔｉｏｎ ｆｏｒ ｒａｄｉｘ ｉｓａｔｉｄｉｓ ｗｉｔｈ ＮＡ
１：１３１ａｎｋ；２：Ｔｅｓｔ ｏｆ ｓａｍｐｌｅｓ；３：Ｂａｃｌ【ｇｒｏｕｎｄ ∞
∞ ∞
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ｏｑ正＿Ｉｏ葛。月与嗣 ∞
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０．０２
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Ｏ．Ｉ）６ ０．∞０．１
分别于０，１，２，３，４ ｈ将冷藏保存于４℃的同一供试晶 溶液进行效价检测，计算ＲＳＤ为４．７５％，结果说明供试晶 溶液在４℃保存条件下４ ｈ内怒稳定的。 ３．４不同来源板蓝摄抑制ＮＡ活性的毙较
按照上法溺定不嗣产瑰叛鏊搬撵燕在稷霹生药浓度下对
ＮＡ的抑制活性，以凝（对数浓度）／效（抑制率）关系作图（图 ４）。结果可见不同来源样晶间对ＮＡ活性的抑制率有明显的 差异，与对照药材相比来源于甘肃的板蓝根各浓度抑制率显 著较高（Ｐ＜ｏ．０１），“劣成板蓝根”是长年放置的陈货，常规 鉴别为“劣药”，其抑制率也最低，与对照药材相比麓髯显著 （Ｐ＜ｏ。０１），提示通过ＮＡ的活性测定可以定性袭德板菠根 品质戆差异。
收稿日期：２００８－０５－０２。修订日期：２００８４）８－０６
基金项目：国家杰出青年科学基金项目（３０６２５０４２）和国家“十一直”科技支撑计划课题（２００６ＢＡｌ０８８０３）资助
作者简介：李寒冰，１９７３年生，解放军第３０２医院全军中药研究所药学博士 ＊通讯联系人 ｅ－ｍａｉｌ：ｐｈａｒｒｎａｃｙ３０２｛园１２６．ｃｏｍ
上述实测结果反映出样晶间生物效价的差异性，与药理 活性的检测结果趋势相同。同时常规鉴别方法判为劣药的样 黼其效价值最低，两种方法的结果具有一致性，提示该方法 能够定量刻划板蓝根的品质熬异。
３．１板蓝根抑制ＮＡ活性检测 按上述条件和加样方法进行加样，反应结束后检测各组
荧光值并比较，作为样品对ＮＡ抑制活性计算的参数（图２）。 按２．３（１）所列反应率计算公式计算各浓度样品的抑制率，与 样品浓度作图（图３）。
臼罚岳§ｏｕ二。譬翌声Ｉ＿ｌＴ
Ｆｉｇ．１
Ｓｃｈｅｍａｔｉｃ ｄｉａｇｒａｍ ｏｆ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｆｏｒ ＮＡ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ａｃｔｉｖｉｔｙ
按上述条件，取工作对照黼配成不同浓度溶液，点样于 ９６孔板中参与酶促反应，绱泶后用ＦＬＵ（）ｓｔａｒ ＯＰＴＩＭＡ酶 标仪进行连续６次荧光扫描，计算每孑Ｌ荧光值的变异系数。 结果ＲＳＤ值在０．５％～１．５％之阔，表明仪器精密度良好。 ３．３．２重复往考察
弱一撬群瑟分５次提取，按上法与工幸＃对照晶溶滚送行 瓣魄检定，计算效价著求审阅德的变异系数。ＲｓＤ一５．７８％， 液明该方法具有较好的重复性。 ３．３．３稳定性考察
ＮＡ的原酶液，－－７０℃冻存备用。
各组样品设复孔加样。根据各组荧光值（取复孔的平均值）计
算各样品的抑制活性（２．３．１所列公式）。
２．３数据处理与效价计算
Βιβλιοθήκη Baidu
Ｉ－－嚆黼蒜耘琶㈣×１００ （１）反应抑制率（Ｄ计算公式
酶活性对照荧光一背景荧光
ｏＡ。。
（２）效价计算：ＰＴ—Ｒ·Ｐ。（Ｐ。为工作对照品的效价约定为１
１仪器与材料
１．１药材及试剂 板蓝根药材，经解放军中药研究所肖小河研究员鉴定为
来源于十字花科（Ｃｒｕｃｉｆｅｒａｅ）植物菘蓝Ｉｓａｔｉｓ ｉｎｄｉｇｏｔｉｃａ Ｆｏｒｔ． 的干燥根；达菲胶囊（Ｏｓｅｌｔａｍｉｖｉｒ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ Ｃａｐｓｕｌｅｓ），批号 Ｂ１２１２，Ｒｏｃｈｅ ｐｈａｒｍａ（Ｓｃｈｗｅｉｚ）公司；取板蓝根对照药材（中 国药品生物制品检定所），制成醇提取物（得率７．７０％），作
２．２反应条件与加样方法 ２．２．１样品制备
制取板蓝根乙醇提取物，用时加水溶解，微孔滤膜 （Ｏ．２２肚ｍ）滤过，将滤液等比稀释成供试品溶液。另取工作 对照品制成每１ ｍＬ含５０ ｍｇ的对照品溶液，与供试品相同 的剂距稀释成工作对照品溶液。 ２．２．２反应条件与加样
参考已广泛应用的ＮＡ活性测定方法［１３Ｊ“，为便于对 比，将反应设置在９６孔荧光酶标板中进行。经考察，ＭＵ－ ＮＡＮＡ的浓度为０．０２ ｍｍｏｌ·Ｌ～，酶浓度对原酶液进行１０ 倍稀释（原酶液是在定量的细胞和培养液条件下接种定量的 病毒按规范操作成的酶液）时反应的信噪比最大，灵敏度较 好。反应体系中首先加入２５弘Ｌ稀释的原酶液和２５ ｐＬ样品 溶液，室温作用３０ ｍｉｎ后加５０“Ｌ ＭＵＮＡＮＡ，３７℃孵育 ６０ ｒａｉｎ后加入终止液终止反应，测定荧光强度值，激发波长
第２９卷，第４期 ２ ０ ０ ９年４月
光谱学与光谱分析 Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ ａｎｄ Ｓｐｅｃｔｒａｌ Ａｎａｌｙｓｉｓ
Ｖ０１．２９，Ｎｏ．４，ｐｐ９０８—９１２ Ａｐｒｉｌ，２００９
基于化学荧光测定的板蓝根抗病毒效价检测方法的建立
李寒冰１’２，鄢 丹１，金 城１，王伽伯１，魏 丽１’２，肖小河¨，曹俊岭３
万方数据
９１０
光游攀奄光谱分祈
第２９卷
·ｒａｔ，～。 ３．２板蓝根与阳性对照药量效关系比较
结果表明板蓝根量效关系曲线与阳性对照药达菲相似， 说明两者与ＮＡ的作用方式殷作用规律相近。将反应率转换 成概率单位后，对数剂量与反成函数呈直线关系，板蓝根＿燃 效越线的回归方程ｙ一８。７２５ ９＋ｌ。２１６ ９×ｌｏｇ＜Ｄ），Ｒ２— ０．９９９，说鹱该反应适会惩垒物捻定孛“质反应平行线测定” 浚遴行效价测定陆强】。 ３．３方法学考察 ３．３．１仪器精密度考察
ｅ－ｍａｉｌ：１ｈｂ８８９９（园１６３．ｔｏｍ
万方数据
第４期
光谱学与光谱分析
为工作对照品；ＮＡ底物，４－ｍｅｔｈｙｌｕｍｂｅｌｌｉｆｅｒｙｌ－Ｎ－ａｃｅｔｙｂａ－Ｄ－ ｎｅｕｒａｍｉｎｉｃ ａｃｉｄ（ＭＵＮＡＮＡ）Ｓｉｇｍａ公司；Ｎｐ－４０，ＦＩｕｋａ公 司；ＤＭＥＭ，ＧＩＢＣＤ公司；其余为分析纯。 １．２主要仪器
Ｕ·ｍｇ叫）。具体算法由根据“质反应的平行线测定（４·４）
法＂［１５］效价测定原理编制的计算软件完成。
３结果与讨论
２实验方法
２．１ ＮＡ体外荧光检测原理 化合物ＭＵＮＡＮＡ是ＮＡ的特异性底物，在ＮＡ作用下
的产物４ＭＵ（７一Ｈｙｄｒｏｘｙ－４－ｍｅｔｈｙｌｃｏｕｍａｒｉｎ，Ｃ４０ Ｈ８０３）在３５５ ｎｍ入射波长激发下，可以产生４６０ ｎｎｌ荧光，采用荧光检测 器测定该波长荧光强度的变化，可灵敏地反应ＮＡ活性Ｌｌ钉； 同样，如果反应体系中加入能够抑制ＮＡ活性的药物，则荧 光强度会相应减弱，从而该药物的ＮＡ抑制活性就能通过荧 光强度的变化被表征（见图１）。
近年来，化学荧光法测定流感病毒神经氨酸酶（ＮＡ）的 体外活性用以评价流感病毒的活力已被广泛采用。ＮＡ在流 感病毒的复制、感染和致病过程中起重要作用，通过抑制 ＮＡ活性，可有效地控制流感症状和疾病的传播［５“］。因此， 通过测定ＮＡ与药物作用以后活性变化，可以反映药物的抗 流感病毒活性，目前该方法已成为抗流感病毒药（包括植物 药）的体外筛选方法之一［７］。ＮＡ活性的体外化学荧光测定
法具有灵敏、快捷、可定量、重复性好等特点，是较理想的 药物体外生物活性检测方法，然而在中药的抗病毒活性筛选 和评价中还未见报道，尤其是未见将该方法按生物检定的统 计学原理设计和条件优化后用于抗病毒类中药的生物效价检 测，进而用于中药的质量控制和品质评价。
板蓝根（ＲＡＤＩＸ ＩＳＡＴｌＤＩＳ）是常用的防治感冒中药，临 床疗效可靠，文献报道其具有确切的抗流感病毒作用陪１１］， 预试验表明板蓝根具有明显的体外抑制ＮＡ作用。本文采用 化学荧光法系统考察了板蓝根的体外抑制ＮＡ作用，并以此 为基础，建立了板蓝根抗流感病毒效价检测方法作为其质量 评价方法。一方面可以提高其自身质量控制水平，另一方面 为其他药效物质不清楚中药质量的生物控制研究提供参考。
３５５劬，发射波长４６０ ｎｎ－ｔ，测定温度３７℃。为便于活性比
较，同时设样品测试组（ＮＡ＋样品＋ＭＵＮＡＮＡ），背景对照 组（样品＋ＭＵＮＡＮＡ，ｂｕｆｆｅｒ补足至相同体积），酶活性对照 组（ＮＡ＋ＭＵＮＡＮＡ，反应终止后再加入同体积样品溶液）。
Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｓａｍｐｌｅｓ／（ｍｇ·ＩｎＬ一１）
１．解放军第３０２医院全军中药研究所，北京１０００３９ ２．成都中医药大学药学院，四川成都６１００７５ ３．北京中医药大学东直门医院药学部，北京１００７００
摘要荧光测定法在化学分析和生物检测中已广泛应用，将该法引用到中药的生物效价检测中则是一种 新的尝试。而生物效价检测与药效直接相关联，是研究中药质量控制与品质评价方法的新趋势。为了建立与 抗病毒药效相关的板蓝根质量控制和评价方法，采用化学荧光测定法考察了板蓝根提取物对流感病毒神经 氨酸酶（ＮＡ）的体外抑制活性，分析了其药理作用的量效曲线变化趋势和作用规律。在此基础上并根据生物 检定的统计学原理，以“质反应平行线”法设计和优化检测条件，建立了板蓝根抗病毒生物效价荧光检测方 法。实际测试结果能够灵敏、定量表征样品间的品质差异，方法的可靠性和可重复性较好。以此作为板蓝根 质量生物控制和评价方法，能够体现中药药效特点。
关键词化学荧光测定；抗病毒效价；板蓝根；生物测定 中图分类号：０６５７．３ 文献标识码：Ａ ＤＯＩ：１０．３９６４／ｊ．ｉｓｓｍ １０００－０５９３（２００９｝０４－０９０８－０５
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引言
将生物效价（Ｂｉｏｐｏｔｅｎｃｙ）测定方法引入到中药质量控制 和品质评价中来，是现今中药质量控制模式和方法研究的重 要发展方向［１’２］。建立和优选适宜的生物效价检测方法是中 药质量生物控制模式的关键点也是难点。当前在中药质量评 价中已应用的有益母草缩宫素生物效价检测法［３］，部分清热 解毒中药的小鼠抗炎、镇痛、解热以及毒性致死卧］等生物效 价检测方法。这些方法多是基于药物对整体或离体组织的定 性或定量药理实验，存在影响因素多、精密度相对较低、费 用高、周期长等弊端。质量控制不同于药效研究，所用方法 除了要求临床疗效相关外，更应满足定性／定量准确、灵敏 快捷、简单、重现性好等基本要求。
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ｌｏｇｄｏｓｅ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｓ ｏｆ ＮＡ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｒａｄｉｘ ｉｓａｔｉｄｉｓ ｆｒｏｍ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｐｌａｃｅｓ
３．５不同产地板蓝根抗病毒效价的测定 以工作对照品为参比，按照上述效价测定和计算方法，