酶切原理

粘性末端：是交错切割，结果形成两条单链末端，这 粘性末端 种末端的核苷酸顺序是互补的，可形成氢键，所以称为粘 性末端。 如EcoRI的识别顺序为： 5’…… G|AATTC ……3’ | 3’…… CTTAA|G …… 5’ ’…… ’ | 在双链上交错切割的位置切割后生成 5’……G 3’……CTTAA AATTC……3’ G……5’
实验三 质粒DNA限制性酶切图谱分析 质粒DNA DNA限制性酶切图谱分析 一、DNA的限制性酶切实验原理 DNA的限制性酶切实验原理
核酸限制性内切酶是一类能识别双链ＤＮＡ中特定碱基顺序 核酸限制性内切酶是一类能识别双链ＤＮＡ中特定碱基顺序 ＤＮＡ 的核酸水解酶，这些酶都是从原核生物中发现，它们的功能 的核酸水解酶，这些酶都是从原核生物中发现， 犹似高等功物的免疫系统， 用于抗击外来ＤＮＡ的侵袭。 ＤＮＡ的侵袭 犹似高等功物的免疫系统， 用于抗击外来ＤＮＡ的侵袭。 限制性内切酶以内切方式水解核酸链中的磷酸二酯键， 限制性内切酶以内切方式水解核酸链中的磷酸二酯键， 产 生的ＤＮＡ片段５ 端为Ｐ， ＤＮＡ片段 Ｐ，３ 端为ＯＨ。 生的ＤＮＡ片段５’端为Ｐ，３’端为ＯＨ。
配制多大浓度的琼脂糖凝胶， 配制多大浓度的琼脂糖凝胶，要根据被检的 DNA分子大小来确定 分子大小来确定。 DNA分子大小来确定。
琼脂糖凝胶浓度与线性DNA分辨范围 琼脂糖凝胶浓度与线性DNA分辨范围 DNA
常用的电泳缓冲液
常用的6X载样缓冲液 常用的6X载样缓冲液 6X 0.25%溴wenku.baidu.com蓝 0.25%二甲苯青 40%蔗糖水溶液 Ⅰ 0.25%溴酚蓝 ，0.25%二甲苯青 ，40%蔗糖水溶液 0.25%溴酚蓝 0.25%二甲苯青 30%甘油水溶液 Ⅱ 0.25%溴酚蓝 ，0.25%二甲苯青 ，30%甘油水溶液 保存备用. 4℃ 保存备用.
一、DNA的限制性酶切实验原理 DNA的限制性酶切实验原理
1. 限制性内切酶的类型 第三类（III型 限制性内切酶也有专一的识别 第三类（III型）限制性内切酶也有专一的识别 顺序，在识别顺序旁边几个核苷酸对的固定位置上 顺序， 切割双链。但这几个核苷酸对也不是特异性的。 切割双链。但这几个核苷酸对也不是特异性的。因 这种限制性内切酶切割后产生的一定长度DNA 此，这种限制性内切酶切割后产生的一定长度DNA 片段，具有各种单链末端。 片段，具有各种单链末端。因此也不能应用于基因 克隆。 克隆。
材料、 三 材料、设备及试剂
质粒 ：pUC118、pEGFP 设备 ：eppendorf管、微量取液器(20μl,200μl,1000μl)， 台式 高速离心机， 电泳仪、电泳槽、UVP凝胶成像系统、微波炉 试剂： 试剂：琼脂糖 、TAE电极缓冲液、Lamdar DNA EcoR I /HindⅢ 、 EB 、 加样缓冲液
一、DNA的限制性酶切实验原理 DNA的限制性酶切实验原理
1. 限制性内切酶的类型 第三类（ 第三类（Ⅱ型）限制性内切酶就是通常指的ＤＮＡ限制性内 限制性内切酶就是通常指的ＤＮＡ限制性内 就是通常指的ＤＮＡ 切酶. 切酶. 它们能识别双链ＤＮＡ的特异顺序， ＤＮＡ的特异顺序 它们能识别双链ＤＮＡ的特异顺序，并在这个顺序内进行切 产生特异的ＤＮＡ片段； ＤＮＡ片段 割，产生特异的ＤＮＡ片段； 型酶分子量较小，仅需Mg2+作为催化反应的辅助因子， Mg2+作为催化反应的辅助因子 Ⅱ型酶分子量较小，仅需Mg2+作为催化反应的辅助因子， 识别顺序一般为４ 个碱基对的反转重复顺序； 识别顺序一般为４～６个碱基对的反转重复顺序； 型内切酶切割双链ＤＮＡ产生３种不同的切口－－ ＤＮＡ产生 －－５ Ⅱ型内切酶切割双链ＤＮＡ产生３种不同的切口－－５’端 突出； 端突出和平末端。 突出；３’端突出和平末端。 正是得益于限制性的内切酶的发现和应用， 正是得益于限制性的内切酶的发现和应用， 才使得人们能 在体外有目的地对遗传物质ＤＮＡ进行改造， ＤＮＡ进行改造 在体外有目的地对遗传物质ＤＮＡ进行改造，从而极大地推 动了分子生物学的兴旺和发展。 动了分子生物学的兴旺和发展。
琼脂糖是一种天然聚合长链状分子， 琼脂糖是一种天然聚合长链状分子，可以形成具 有刚性的滤孔，凝胶孔径的大小决定于琼脂糖的浓 有刚性的滤孔， 度。 DNA分子在碱性缓冲液中带负电荷，在外加电场 DNA分子在碱性缓冲液中带负电荷， 分子在碱性缓冲液中带负电荷 作用下向正极泳动。 作用下向正极泳动。 DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时，有电荷效应与 DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时， 分子在琼脂糖凝胶中泳动时 分子筛效应。不同DNA的分子量大小及构型不同， DNA的分子量大小及构型不同 分子筛效应。不同DNA的分子量大小及构型不同， 电泳时的泳动率就不同，从而分出不同的区带。 电泳时的泳动率就不同，从而分出不同的区带。
琼脂糖电泳的优点 （1）琼脂糖含液体量大，可达98-99%，近似自由 琼脂糖含液体量大，可达98-99%， 98 电泳，但是样品的扩散度比自由电泳小。 电泳，但是样品的扩散度比自由电泳小。 （2）电泳速度快。 电泳速度快。 （3）透明而不吸收紫外线，可以直接用紫外检测 透明而不吸收紫外线， 仪作定量测定。 仪作定量测定。 （4）样品易回收，常用于制备。 样品易回收，常用于制备。
2、琼脂糖凝胶电泳 (1) 称取0.25g琼脂糖，置25ml电泳缓冲液中，加热使琼脂糖溶解； (2)待溶液冷至60℃，加入2ul SYBR Green I。 (3)在距离胶模底板0.5-1mm处放置电泳梳，将琼脂糖溶液倒入胶模 中，厚度约3-5mm，注意避免产生气泡； (4)凝胶完全凝固后，移去梳子和挡板，将凝胶放入电泳槽。加入 TAE缓冲液使恰好没过胶面约1mm； (5)将DNA样品与1/6体积加样缓冲液混合后，加入样品槽中； (6)接通电源，使样品槽在负极端，用80V的电压，至溴酚蓝到胶前 沿时，停止电泳。 (7)凝胶自动处理系统（UVP）观察和拍照，记录结果。 样品：DNA5ul、6X点样液2 ul，电极缓冲液5ul pUC118、pEGFP、 pUC118、pEGFP、 pUC118/ EcoRI 、 细菌基因组DNA pEGFP/ EcoRI 、细菌基因组DNA DNA Marker (2ul，6X点样液2 ul，电极缓冲液5ul ) 实验结果：分析酶切图谱
四、操作步骤
1、质粒DNA的限制性酶切反应 质粒DNA的限制性酶切反应 DNA （1）、将清洁干燥并经灭菌的eppendorf管编号,用微量移液枪 分别加入DNA 5μl， 10×缓冲液2μl,BSA 2ul，EcoRI 1ul， ddH2O 10ul，用微量离心机甩一下,使溶液集中在管底。此步操 作是整个实验成败的关键,要防止错加，漏加。使用限制性内切酶 时应尽量减少其离开冰箱的时间，以免活性降低。 （2）、混匀反应体系后,将eppendorf管置于适当的支持物上 （如插在泡沫塑料板上）,37℃水浴保温1小时,使酶切反应完全。 （3）、每管加入2μl 0.1mol/L EDTA(pH8.0),混匀,以停止反应, 置于冰箱中保存备用。
二、琼脂糖凝胶电泳实验原理
琼脂糖凝胶电泳法分离DNA， 琼脂糖凝胶电泳法分离DNA，主要是利用分子筛 DNA 效应，迁移速度与分子量的对数值成反比关系。 效应，迁移速度与分子量的对数值成反比关系。 因而就可依据DNA分子的大小使其分离。 DNA分子的大小使其分离 因而就可依据DNA分子的大小使其分离。该过程 可以通过把分子量标准参照物和样品一起进行电 泳而得到检测。 泳而得到检测。 溴化乙锭（EB）为扁平状分子， 溴化乙锭（EB）为扁平状分子，在紫外光照射下 发射荧光。EB可与DNA分子形成EB-DNA复合物 可与DNA分子形成EB 复合物， 发射荧光。EB可与DNA分子形成EB-DNA复合物， 其荧光强度与DNA的含量成正比。 DNA的含量成正比 其荧光强度与DNA的含量成正比。据此可粗略估 计样品DNA浓度。 DNA浓度 计样品DNA浓度。
五、注意事项——限制性内切酶酶切 注意事项——限制性内切酶酶切
１．内切酶： 内切酶： 不应混有其它杂蛋白特别是其它内切酶或外切酶的污染； 不应混有其它杂蛋白特别是其它内切酶或外切酶的污染； 注意内切酶的识别位点及形成的粘性末端； 注意内切酶的识别位点及形成的粘性末端； 内切酶的用量：根据内切酶单位和ＤＮＡ用量而定， ＤＮＡ用量而定 内切酶的用量：根据内切酶单位和ＤＮＡ用量而定，通常 1u指在适当条件下 小时内完全酶解１ug特定ＤＮＡ底物 指在适当条件下， 特定ＤＮＡ 1u指在适当条件下，1小时内完全酶解１ug特定ＤＮＡ底物 所需要的限制性内切酶量，使用中一般以１ DNA对 所需要的限制性内切酶量，使用中一般以１ug DNA对２－ 酶短时间为宜。 ３u酶短时间为宜。 同时内切酶体积不能超过反应体系１０％，因内切酶中含 １０％， 同时内切酶体积不能超过反应体系１０％，因内切酶中含 ５０％甘油，体系中甘油超过５ 会抑制内切酶活力； ５０％甘油，体系中甘油超过５％会抑制内切酶活力； 内切酶操作应在低温下进行（冰上）； ）；使用时防止操作中 内切酶操作应在低温下进行（冰上）；使用时防止操作中 对内切酶的污染。 对内切酶的污染。
一、DNA的限制性酶切实验原理 DNA的限制性酶切实验原理
2. 限制性核酸内切酶的命名法 用属名的头一个字母和种名的头两个字母表示寄 主菌的物种名称，如E. coli 用Eco表示，所以用斜 主菌的物种名称， 表示， 体字。 体字。 用一个字母代表菌株或型，如流感嗜血菌 influenzae)Rd菌株用d )Rd菌株用 (Heamophilus influenzae)Rd菌株用d，即Hind。 如果一种特殊的寄主菌株， 具有几个不同的限制 如果一种特殊的寄主菌株 ， 与 修 饰 酶 ， 则 以 罗 马 数 字 表 示 ， 如 HindⅠ, HindⅡ，HindⅢ等。 dⅡ， dⅢ等
一、DNA的限制性酶切实验原理 DNA的限制性酶切实验原理
1. 限制性内切酶的类型 根据限制酶的识别切割特性， 根据限制酶的识别切割特性， 催化条件及是否具有修饰酶活 性可分为Ⅰ 型三大类。 性可分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型三大类。 第一类（ 限制性内切酶能识别专一的核苷酸顺序 能识别专一的核苷酸顺序， 第一类（I型）限制性内切酶能识别专一的核苷酸顺序，它 们在识别位点很远的地方任意切割DNA DNA链 们在识别位点很远的地方任意切割DNA链，但是切割的核苷 酸顺序没有专一性，是随机的。这类限制性内切酶在DNA DNA重 酸顺序没有专一性，是随机的。这类限制性内切酶在DNA重 组技术或基因工程中用处不大，无法用于分析DNA结构或克 组技术或基因工程中用处不大，无法用于分析DNA结构或克 DNA 隆基因。 隆基因。这类酶如EcoB、EcoK等。
pUC18改造而来 改造而来， pUC18中增加了带有 由 pUC18改造而来，大小为 3162bp 。相当于在 pUC18中增加了带有 M13 合成的起始与终止以及包装进入噬菌体颗粒所必需的顺式序列。 噬菌体 DNA 合成的起始与终止以及包装进入噬菌体颗粒所必需的顺式序列。
二、琼脂糖凝胶电泳实验原理
五、注意事项——限制性内切酶酶切 注意事项——限制性内切酶酶切
２．ＤＮＡ： 作为内切酶底物，ＤＮＡ应该具备一定的纯度， 作为内切酶底物，ＤＮＡ应该具备一定的纯度，其溶液中不 ，ＤＮＡ应该具备一定的纯度 能含酚、氯仿、乙醚、SDS、EDTA、高盐浓度、酒精等， 能含酚、氯仿、乙醚、SDS、EDTA、高盐浓度、酒精等，这 些因素的存在均不同程度影响限制性内切酶的活力。 些因素的存在均不同程度影响限制性内切酶的活力。 这种抑制可通过： 这种抑制可通过： 增加酶作用单位数（ DNA）、 增加酶作用单位数（10~20U/ug DNA）、 增大反应体积以稀释可能的抑制剂 或延长反应时间加以克服。 或延长反应时间加以克服。
各有一个单链末端，二条单链是互补的，其断裂的磷 酸二酯键以及氢键可通过DNA连接酶的作用而“粘合”。
平头末端： 平头末端： II型酶切割方式的另一种是在同一位置上切割双 链，产生平头末端。例如EcoRV 的识别位置是： 5’…… GAT|ATC …… 3’ | 3’…… CTA|TAG …… 5’ | 切割后形成 5’…… GAT ATC …… 3’ 3’…… CTA TAG …… 5’ 这种末端同样可以通过DNA连接酶连接起来。