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差速离心分离线粒体
差速离心法分离线粒体实验名称：差速离心法分离线粒体同组学生姓名：喻儿一、实验目的和要求（必填）二、实验内容和原理（必填）三、实验材料与试剂（必填）四、实验器材与仪器（必填）五、操作方法和实验步骤（必填）六、实验数据记录和处理七、实验结果与分析（必填）八、讨论、心得一、实验目的1.学会差速离心方法及活体染色一般方法。
2.掌握鼠肝线粒体的分离与鉴定方法二、实验原理1.差速离心法:在一定的离心场中，大小不一的颗粒的沉降速度取决于它的密度、半径和悬浮介质的粘度。
在一个均匀悬浮介质中离心一定时间，组织匀浆中的各种细胞器及其它内含物由于沉降速度不同而停留在高低不同的位置。
依次增加离心力和离心时间，就能够使这些颗粒按其大小、轻重分批沉降在离心管底部，从而分批收集。
细胞器中最先沉淀的是细胞核，其次是线粒体，其它更轻的细胞器和大分子可依次再分离。
2.悬浮介质的选择：通常用缓冲的蔗糖溶液，它比较接近细胞质的分散相，在一定程度上能保持细胞器的结构和酶的活性，在pH7.2 的条件下，亚细胞组分不容易重新聚集，有利于分离。
离心力 RCF=1.119 ⨯ 10-5 ⨯ r ⨯ n2 （单位：重力常数 g ； r 离心场半径；n 转速）3.詹纳斯绿活染法鉴定线粒体：线粒体内的细胞色素氧化酶能使詹纳斯绿染料始终保持在氧化状态而呈现蓝色；而在周围的细胞质内，这些染料被还原成为无色。
在进行线粒体的体外染色时，至少要使材料在詹纳斯绿染液中染色15min以上，才能放上盖玻片，以便材料经过氧化（即与空气接触）后，线粒体被染色。
活性样品检测的关键环节：整个操作过程应注意使样品保持4℃，避免酶失活。
三、实验材料与试剂材料：小白鼠肝脏器材：玻璃匀浆器，高速冷冻离心机，普通离心机，剪刀，镊子，小烧杯，离心管，载玻片，盖玻片，滴管，普通光学显微镜，试剂：匀浆介质；詹纳斯绿染色液四、实验步骤I 差速离心法分离线粒体1．小白鼠断颈致死，用75%乙醇消毒外部皮肤后，剖腹取肝；2．用预冷至0℃的匀浆介质洗肝，干净滤纸吸干水分后称重；3．往平皿中先加入适量匀浆介质，将肝剪碎，按每克肝组织加8mL匀浆介质，加至10mL玻璃匀浆器中，在冰浴中匀浆；4．待肝组织基本碎裂后，将匀浆液移至10mL离心管中，平衡后， 4℃下4800rpm离心15min，吸取上清液；（染色观察）；5.将1mL上清液转移至Eppendorf (EP)管中，4℃，11000rpm(10000g)离心20min；(位置)6．转移上清液至新EP管中；7．沉淀以适量匀浆介质悬浮制成线粒体悬浮液。
线粒体的提取与纯化
mt DNA的分离及纯化按戴建华等报道的方法，就具体情况稍加改进，步骤如下（除特别说明，均在4℃下完成）：1.1 取新鲜肝组织，放在缓冲液A（0.25M 蔗糖，0.01M Tris·Hcl，0.001M Na2-EDTA，pH8.0）中漂洗2~3次，尽可能去除表面血污、结缔组织及脂肪组织后剪碎。
按组织重﹕缓冲液A=1﹕5~10加入缓冲液A，用玻璃匀浆器冰浴匀浆。
1.2 1000 g•min-1离心15min；取上清液；15000 g•min-1离心20min，弃上清，沉淀用缓冲液B （0.25M 蔗糖，0.05M Tris·Hcl，0.007M Mg Cl2，p H7.5）洗涤，按0.5m L•g-1肝的比例加入缓冲液B 悬浮沉淀后加入DNase I 至终浓度为100 µg•m L-1，30℃下作用30min。
1.3 冰浴冷却，加入2倍体积的DNase I反应终止液（0.25M蔗糖，0.1M Na2-EDTA，pH8.0）。
15000g•min-1离心20min。
沉淀用DNaseI反应终止液洗涤一次，重复离心。
1.4 按0.5 m L•g-1肝加入缓冲液C（0.1M Nacl，0.05M Tris·Hcl，0.01M Na2-EDTA，p H8.5）悬浮沉淀，加入SDS至终浓度为1%~1.5%，吸打混匀后37℃保温15min。
1.5 用等体积的苯酚，苯酚/氯仿（1:1），氯仿/异戊醇（24:1）各抽提一次。
取水相，加0.2 倍体积1M Na Ac和2倍体积的预冷无水乙醇，混匀后放在4℃冰箱中过夜。
1.6 15000g•min-1离心30min后去上清；沉淀用70%乙醇洗涤2次，干燥，TE（0.01M Tris·Hcl，0.001M Na2-EDTA，pH8.0）溶解。
1.7 加入预处理的RNase I 至终浓度为50µg•m L-1，37℃保温1h。
线粒体的分离及活性测定实验原理及步骤
实验十一线粒体的分离及活性测定线粒体是真核细胞的一个重要细胞器，好氧生物细胞需能的 25%以上是靠有氧呼吸供给，而线粒体是细胞内惟一有氧呼吸的场所，因此，人们就一细胞“动力站”之称。
线粒体结构和功能上的研究至今向来是一个非常活跃的领域，本试验在于学会分离线粒体和测定线粒体活力，以高活力的线粒体制剂用于各种目的的研究。
一、仪器与设备：1.冰冻高速离心机，或者万转/分离心机。
2.组织捣碎机或者匀浆器。
3.冰浴，研钵、漏斗、纱布(尼龙布)、量筒、微量注射器、移液管、试管等。
4.瓦氏呼吸器(氧极普测试系统)。
5.显微镜、冰浴。
6.分光光度计。
二、材料与试剂：1.绝大多数的动植物材料通常都可以制备线粒体，但最好是生活力强，生长旺盛，幼嫩组织为好，如心肌、肝脏、骨骼肌、黄化幼苗、块根、块茎等。
2.TriS-HCl (0.05M，pH7.2)缓冲液。
3.磷酸缓冲液(0.2M，Ph7.2)。
4.提取洗涤液：在 1000ml 溶液中含有甘露醇 (0.35M)、牛血清蛋白 (Bovine Serum Albumin，BSA，1mg/ml)，EDTA (0.001M)，TriS-HCl (0.01M，pH7.2)缓冲液。
5.悬浮液(同试剂 4，但不加 BSA)。
6.反应液：在 1000ml 溶液中含有甘露醇(0.35M)、蔗糖(0.25M)、KCl (10ml，pH7.2)、EDTA (0.2mM)、MgCl2 (5mM)、TriS-HCl (10mM，pH7.2)。
7.反应底物：α—酮戊二酸 0.4M，ADP 0.06M。
三、线粒体的分离：线粒体在离体条件先很容易受各种因素 (物理和化学的)作用而失活，特殊是膜的完整性极其重要，因为惟独完整的线粒体才干进行有氧呼吸。
所以在分离操作中要掌握以下几个要点：[1].整个过程要保持在低温下(0-4 o C)进行。
[2].要注意分离介质的 pH 值， pH 值应和被采用的材料一致。
线粒体的分离与鉴定
三、实验用品
1. 材料 昆明种小白鼠 若干只 2. 器材
冷冻高速离心机、解剖刀剪、小烧杯、冰浴、漏斗、200 目尼龙网（通常为铜筛）、玻璃匀浆器、PH计、高压灭 菌锅等。
3. 试剂 ① 0.9%灭菌的生理盐水。 ② 1%詹纳斯绿B染液，用0.9%灭菌的生理盐水配制。
③ 0.25mol/L蔗糖十0.01mo1／L Tris-盐酸缓冲液(pH7.4)： ④ 0.34mol/L蔗糖十0.01mol/L tris-盐酸缓冲液(pH7.4) ⑤ ⑦ 固定液：甲醇：冰醋酸(9:1)
一、实验目的
初步掌握用差速离心法分离大鼠肝细胞线粒体的方 法。 学习并掌握高速离心机和匀浆器的使用方法。
二、实验原理
线粒体(mitochondria)是真核细胞中产生能量的重要细胞器。细胞中的
能源物质—脂肪、糖、部分氨基酸在此进行最终的氧化，并通过偶联 磷酸化生成ATP，供给细胞生理活动之需。对线粒体结构与功能的研 究通常是在离体的线粒体上进行的。
七、作
业
线粒体提取分离过程中，为什么要在0～4℃进行？ 将线粒体沉淀作一涂片，用姬姆萨染色，检查是否混杂细 胞核和胞质碎片，估计分离所得线粒体的纯度。要获得高 活性的线粒体，在线粒体提取、分离和活性鉴定的过程中 需注意哪些问题？根据你的实际体会，写出操作注意事项 及改进方法。
分离介质0.25mol/L及0.34mol/L缓冲蔗糖溶液哪一种在下层 有什么作用?
心力和离心时间，就能够使这些颗粒按其大小、轻重分批沉降 在离心管底部，从而分批收集。细胞器中最先沉淀的是细胞 核，其次是线粒体，其它更轻的细胞器和大分子可依次再分 离。 悬浮介质通常用缓冲的蔗糖溶液，它比较接近细胞质的分散 相，在—定程度上能保持细胞器的结构和酶的活性，在pH7.2 的条件下，亚细胞组分不容易重新聚集，有利于分离。整个操 作过程应注意使样品保持4℃，避免酶失活。 线粒体的鉴定用詹纳斯绿活染法。
细胞核与线粒体的分离
的时间要越短越好，通常从开始收获细胞到匀浆结束 不要超过5分钟。否则匀浆物在低渗溶液中时间太长， 导致细胞器破裂，溶酶体酶泄漏，各种物质降解。
二、实验原理
（二）分离纯化的方法 根据细胞器的大小、形状、密度等物理特性差异，离心
常用介质(高溶解性的惰性物质): 氯化铯、蔗糖、多聚蔗糖
密度梯度离心 （Density-gradient centrifugation）
• 当颗粒之间存在沉降系数差时，在一定离心力作用下， 颗粒各自以一定速度沉降，在密度梯度不同区域上形 成区带的方法。
• 两种浓度的蔗糖溶液制成的梯度，离心时，线粒体和 比它沉降系数小的细胞组分聚集到梯度交界处，而沉 降系数较大的细胞组分沉到离心管底部。
②壁效应严重，特别是当颗粒很大或浓度很高时，在离 心管一侧会出现沉淀；
③颗粒被挤压，离心力过大、离心时间过长会使颗粒变 形、聚集而失活。
9.4 Isolation and Characterization of Cell Organelles (细胞器) Centrifugation can separate many types of oganelles from cell homogenate, 2nd Step: Density-gradient centrifugation
三、实验材料及用品：
器具：高速离心机、解剖刀剪、小烧杯、冰浴、组织捣碎机，培养 皿，离心管
2700/12800rpm
1500/2100水、 1. 0.25mol/L蔗糖-0.003mol/L氯化钙溶液、 2. 0.34mol/L蔗糖+0.01mol/L Tris-HCl缓冲液(pH7.4)、 3. 0.25mol/L蔗糖+0.01mol/L Tris-HCl缓冲液(pH7.4)、 4.1.0 mol/L 蔗糖+10 mmol/L Tris-HCl ( pH 7.4) +1mmol/L EDTA，pH 7.5. 5.1.5 mol/L 蔗糖+10 mmol/L Tris-HCl ( pH 7.4) +1mmol/L EDTA，pH 7.5 6. 固定液【甲醇-冰乙酸(9:1)】、姬姆萨染液(Giemsa) 7. 1%詹纳斯绿B染液(Janus Green染液)。
线粒体的分离与鉴
•
• 三、实验材料 • (一) 材料 猪肝 • （二）器材 冷冻高速离心机、解剖刀剪、 小烧杯、冰浴、漏斗、匀浆器等。 • （三）试剂 • 1.0.9%灭菌的生理盐水。 • 2. 1%詹纳斯绿 B 染液。 • 3. 0.25mol/L 蔗糖缓冲液 • 4. 0.34mol/L 蔗糖缓冲液 • 5.固定液：甲醇：冰醋酸(9：1) • 6.姬姆萨染液
• 六、注意事项
• 1. 注意尽可能先充分剪碎肝组织，缩短匀浆时间， 整个分离过程不宜过长，以保持组分的生理活性。 最好在在 0～4℃或冰浴中进行。
• 2. 将匀浆液置于蔗糖溶液上层时要沿管壁小心加 入，同时及时离心，以防匀浆液中的颗粒自然下 沉过快，影响后面的离心分层效果。 • 3. 姬姆萨染液应用液要在实验时临时配制，效果 较好。
• 七、作业
• 1. 线粒体提取分离过程中，为什么要在 0～4℃ 进行？
• 2. 将线粒体沉淀作一涂片，用姬姆萨染色，检查 是否混杂细胞核和胞质碎片，估计分离所得线粒 体的纯度。要获得高活性的线粒体，在线粒体提 取、分离和活性鉴定的过程中需注意哪些问题？ 根据你的实际体会，写出操作注意事项及改进方 法。
• 四、实验操作 • 1. 制备肝细胞匀浆： • 称取肝组织 20g，剪碎，用预冷到 0～ 4℃的0.25mol/L 缓冲蔗糖溶液洗涤数次。 然后在 0～4℃条件下，按每克肝加 5ml 冷 的0.25mol/L 蔗糖缓冲溶液将肝组织匀浆化， 蔗糖溶液应分数次添加。匀浆液用 两层纱 布过滤备用。
• 2. 离心：先将 5ml 0.34mol/L 缓冲蔗糖溶
• •
•
依次增加离心力和离心时间，就能够使这些颗 粒按其大小、轻重分批沉降在离心管底部，从而 分批收集。细胞器中最先沉淀的是细胞核，其次 是线粒体。
实验五线粒体的分离与观察
2023
对分离得到的线粒体进行活性鉴定。
01
掌握用差速离心技术分离制备线粒体的方法。
02
一、实验目的
细胞器是细胞中维持细胞复杂生命活动的功能性器官，为了研究各种细胞器的功能，首先就要将这些细胞器从细胞中分离出来。利用各种物理方法（研磨、超声波振荡、低渗等将组织制成匀浆，细胞中的个中亚组分即从细胞中释放出来。
01
细胞内不同结构的细胞器大小密度存在差异，因此不同细胞器在介质中的沉降系数各不相同。根据这一原理，常用不同转速的离心法来分离不同的细胞器。分级分离的方法有差速离心和密度梯度离心两种。
02
二、实验原理
分离细胞器最常用的方法是将组织制成匀浆，在均匀的悬浮介质中用差速离心法进行分离，其过程包括组织细胞匀浆、分级分离和分析三步，这种方法已成为研究亚细胞成分的化学组成、理化特性及其功能的主要手段。
匀浆(Homogenization)低温条件下，将组织放在匀浆器中，加入等渗匀浆介质(即0.25mol／L蔗糖)进行破碎细胞使之成为各种细胞器及其包含物的匀浆。
分级分离(Fractionation)由低速到高速离心逐渐沉降。先用低速使较大的颗粒沉淀，再用较高的转速，将浮在上清液中的颗粒沉淀下来，从而使各种细胞结构，如细胞核、线粒体等得以分离。由于样品中各种大小和密度不同的颗粒在离心开始时均匀分布在整个离心管中，所以每级离心得到的第一次沉淀必然不是纯的最重的颗粒，须经反复悬浮和离心加以纯化.
1
离心技术是根据颗粒在作匀速圆周运动时都会受到一个向外的力这一原理而发展起来的一种分离技术。
2
离心力是颗粒在一定角度速度下作圆周运动受到一个向外的力。与角速度和旋转半径有关。
3
相对离心力又称相对离心加速度，是指离心力相当于重力加速度的倍数，表示“数字×g”。
分离线粒体
从组织培养细胞中分离线粒体原理：细胞在低渗缓冲液中会膨胀，这是在Dounce匀浆器中用与匀浆器紧密吻合的研杵研磨几下就会破裂。
然后即可在差速离心线分离线粒体。
需注意：溶液、试管、匀浆器都应在冰上预冷。
所有离心步骤要在4°C进行。
所需物品：10ml玻璃离心管，冰冷的PBS，Dounce匀浆器，1.5ml离心管，4°C离心机。
RSB低渗缓冲液:10 mmol/L NaCl2.5 mmol/L MgCl210 mmol/L Tris-Hcl, pH7.52.5X MS缓冲液525 mmol/L甘露醇175 mmol/L蔗糖12.5 mmol/L Tris-Hcl, pH7.52.5 mmol/L EDTA，pH7.51X MS缓冲液210 mmol/L甘露醇70 mmol/L蔗糖5 mmol/L Tris-Hcl, pH7.51 mmol/L EDTA，pH7.5实验步骤：实验开始前，准备足够的RSB缓冲液（1 ml/次）：每毫升RSB、MS缓冲液中加入2μl蛋白酶抑制剂和1μl DTT。
1.用10ml玻璃离心管收集5 x 107个细胞。
2.PBS洗细胞一次，将细胞在4°C 下，600 g x 5 min 离心一次；3.弃上清，细胞沉淀重悬于1ml冰冷的PBS；4.细胞在4°C 下，600 g x 5 min 离心一次；5.弃上清，细胞沉淀重悬于1ml 冰冷的RSB缓冲液，冰上孵育10 min；6.将细胞重悬液全部转移到合适的已预冷的Dounce匀浆器中，用研杵上下研磨30～50次左右。
注：可在显微镜下检测匀浆的效果。
取2～3μl匀浆液滴在载玻片上，显微镜下观察，若70～80％的细胞核周围不存在一圈亮环，则说明匀浆效果较好，否则再研磨10次。
7.立刻加入0.8ml 2.5 X MS缓冲液至终浓度为1XMS，用封口膜封住匀浆器顶端，混匀；8.将匀浆液转移到1.5ml离心管中，4°C ，1000 g x10 min 离心一次；9.将上清液转移到另一干净的1.5ml离心管中，4°C ，17，000 g x20 min 离心一次；10.收集上清液（即细胞浆部分），将离心后的细胞沉淀重悬于0.1ml MS缓冲液；11.Bradford法测定蛋白浓度。
线粒体的分离与鉴定
线粒体的分离与鉴定
实验简介
线粒体是真核细胞内一种重要和独特的细胞器，人体内95%
的ATP是由线粒体中的呼吸链所产生的，因此线粒体是细胞
内的“能量加工厂”，线粒体通过氧化磷酸化作用，进行能量 转换，为细胞进行各种生命活动提供能量。
本实验以小鼠肝组织为实验材料，通过对肝组织匀浆液悬浮
在蔗糖介质中进行差速离心法制备线粒体样本，然后通过詹 纳斯绿活染法进行显微镜观察线粒体的形态。 实验学时3个。
四、实验操作
速用生理盐水洗净血水，用滤纸吸干。称取肝组织2g，剪碎，用预冷 到0～4℃的0.25mol/L缓冲蔗糖溶液洗涤数次。然后在0～4℃条件下，
制备小鼠肝细胞匀浆：实验前小鼠空腹12h，拉颈处死，剖腹取肝，迅
按每克肝加9ml冷的0.25mol/L缓冲蔗糖溶液将肝组织匀浆化，蔗糖溶液 应分数次添加。匀浆液用200目铜筛过滤备用。 离心：先将9ml 0.34mol/L缓冲蔗糖溶液放入离心管，然后沿管壁小心
六、注意事项
注意尽可能先充分剪碎肝组织，缩短匀浆时间，整个分离过程 不宜过长，以保持组分的生理活性。最好在在0～4℃或冰浴中 进行。 将匀浆液置于蔗糖溶液上层时要沿管壁小心加入，同时及时离 心，以防匀浆液中的颗粒自然下沉过快，影响后面的离心分层 效果。 姬姆萨染液应用液要在实验时临时配制，效果较好。过期的应 用液不可使用。
地加入9ml肝匀浆使其覆盖于上层。用冷冻高速离心机按下图顺序进行 差速离心。 差速离心提取鼠肝线粒体流程见下图。
差 速 离 心 提 取 鼠 肝 线 粒 体 流 程 图
沉淀 （细胞核及质膜碎 片） 沉淀
取5g 鼠肝
先用生理盐水洗净血水，滤纸吸干，然后 用预冷的0.25M蔗糖溶液洗3次。
洁净的肝组织
线粒体提取
.
样品
2
管号
1
2
操 作
混合液（ml）
3.4
3.4
步 骤
琥珀酸钠（ml） 0.8
0.8
延胡索酸（ml） —
—
CK
3
4
3.4
3.4
— 37C恒温水浴3 min
酶液（溶胀液） （ml）
0.2
0.2
0.2
0.2
（立即记时）
每管反应15min
HCl(ml)
0.6
0.6
思考题： 1.通过线粒体制备实验，谈谈你对分离细胞器的体会 2.说出琥珀酸脱氢酶活性测定时，各种试剂的作用。关键步
骤有哪些？ 3.蛋白质含量测定有哪些方法，各有何有优缺点？
0-4℃（2—4 ℃）以减少 自溶变化。这些变化是由 于把正常区隔开来的酶和 底物混合到一起的结果。
匀浆液用4层纱布过滤
残渣 弃 （部分未破碎的组分）
上清液 12000g 离心15min
上清液 弃
加3ml悬浮液，悬浮线粒体
滤液 3000g 离心10min
沉淀 弃
（细胞碎片、细胞核等） 沉淀 留 （线粒体）
4.注意事项 制备植物线粒体最大的困难是随着组织的破坏 ，常伴随有线粒体膨胀和由于内源脂肪酸、酚类 、醌类物质所引起正常线粒体机能的抑制。所以 制备时要求： （1）溶剂系统必须要维持一定的渗透压。一 般使用的是甘露醇或蔗糖。 （2）加螯合剂或巯基化合物去除酚类化合物 的毒害。 （3）加入牛血清抑制游离脂肪酸或其它脂类 物质的毒害。 （4）根据不同材料确定不同的缓冲系统。
介质中，常含有： ① 0.25-0.4mol/L蔗糖或甘露醇，使与细胞溶液成等渗的； ② 50mmol/L的pH7-8缓冲液（通常用tris),以中和酸性的
细胞核与线粒体的分离
细胞器鉴定
细胞破碎的注意事项：
1、匀浆介质：常用介质是缓冲的蔗糖水溶液 （0.25mol/L ）。它比较接近细胞质的分散相，具有 足够渗透压，防止颗粒膨胀破裂，对酶活性干扰小， 在pH7.2-7.4的条件下细胞器不易发生聚集。
2、尽可能在低温条件下进行，避免酶失活。 3、若是采用低渗方式破碎细胞，匀浆物在低渗溶液中
去血蛙肝2克+10ml匀浆液
剪碎+组织匀浆
匀浆液 1500rpm 离心 1min (2次 去除大组织块）
每人1个1.5ml离心管（ 0.5ml匀浆缓冲液+ 0.5ml肝组织匀浆液）
2700rpm离心10min
注意：沉淀与上清液从离 心机取出后均需置于冰上。
沉淀（细胞核及碎片）
重悬沉淀,2700rpm离心10min 吸取1小滴沉淀制一张涂片
(2) 线粒体：取线粒体沉淀涂片，注意勿太浓密，不待干即 滴加1/5000稀释的詹纳斯绿B染液染色20min，盖上盖玻片，镜检。
结果：线粒体蓝绿色，呈小棒状或哑铃状。
2.作业 1）分别绘图描绘你所观察到的典型细胞核和线粒体的形态。 2）比较差速离心与密度梯度离心方法分离出的线粒体的差异.
的时间要越短越好，通常从开始收获细胞到匀浆结束 不要超过5分钟。否则匀浆物在低渗溶液中时间太长， 导致细胞器破裂，溶酶体酶泄漏，各种物质降解。
二、实验原理
（二）分离纯化的方法 根据细胞器的大小、形状、密度等物理特性差异，离心
成为亚细胞组分分离过程中最广泛应用的技术。 离心是利用旋转运动的离心力以及物质的沉降系数或浮
密度梯度离心分离线粒体（一位同学完成） (4) 去一支1.5ml离心管，先加入0.4ml 1.5 mol/L 的蔗糖溶液， 然后小心地在 1.5 mol/L 的蔗糖溶液上加0.4ml 1.0 mol/L 的蔗 糖溶液，随后将(2)中获得的上清液0.5ml轻轻地加在蔗糖溶液 上，60000 g（21000 r/min左右，五楼实验室）离心 20 分钟。 线粒体会在 1 mol/L 和 1.5 mol/L 蔗糖界面处形成一薄层。
实验四 线粒体的分离与观察
实验八线粒体的分离与观察实验目的用差速离心法分离动、植物细胞线粒体。
实验原理线粒体(mitochondria)是真核细胞特有的，使能量转换的重要细胞器。
细胞中的能源物质——脂肪、糖、部分氨基酸在此进行最终的氧化，并通过耦联磷酸化生成ATP，供给细胞生理活动之需。
对线粒体结构与功能的研究通常是在离体的线粒体上进行的。
制备线粒体采用组织匀浆在悬浮介质中进行差速离心的方法。
在一给定的离心场中(对于所使用的离心机，就是选用一定的转速)，球形颗粒的沉降速度取决于它的密度、半径和悬浮介质的粘度。
在一均匀悬浮介质中离心一定时间内，组织匀浆中的各种细胞器及其它内含物由于沉降速度不同将停留在高低不同的位置。
依次增加离心力和离心时间，就能够使这些颗粒按其大小、轻重分批沉降在离心管底部，从而分批收集。
细胞器中最先沉淀的是细胞核，其次是线粒体，其它更轻的细胞器和大分子可依次再分离。
悬浮介质通常用缓冲的蔗糖溶液，它比较接近细胞质的分散相，在一定程度上能保持细胞器的结构和酶的活性，在pH7.2的条件下，亚细胞组分不容易重新聚集，有利于分离。
整个操作过程应注意使样品保持4℃，避免酶失活。
线粒体的鉴定用詹纳斯绿活染法。
詹纳斯绿B(Janus green B)是对线粒体专一的活细胞染料，毒性很小，属于碱性染料，解离后带正电，由电性吸引堆积在线粒体膜上。
线粒体的细胞色素氧化酶使该染料保持在氧化状态呈现蓝绿色从而使线粒体显色，而胞质中的染料被还原成无色。
I．鸡肝线粒体的分离实验用品一、材料鸡肝脏二、试剂1. 生理盐水2．1％詹纳斯绿B染液，用生理盐水配制。
3. 0. 25 mol／L蔗糖+0.01mol／L Tris-盐酸缓冲液（ph7.4）：0.1 mol／L三羟甲基氨基甲烷(Tris) 10 ml0.1 mol／L盐酸8.4 ml加重蒸水到100 ml加蔗糖到0.25 mol／L。
蔗糖为密度梯度离心用D(+)蔗糖4. 0.34 mol／L蔗糖＋0.01mol／L Tris-盐酸缓冲液（ph 7.4）5. 固定液：甲醇-冰醋酸(9：1)6. 姬姆萨染液：Giemsai粉0.5g，甘油33 ml，纯甲醇33 ml。
线粒体的提取与纯化
mt DNA的分离及纯化按戴建华等报道的方法，就具体情况稍加改进，步骤如下（除特别说明，均在4℃下完成）：1.1 取新鲜肝组织，放在缓冲液A（0.25M 蔗糖，0.01M Tris·Hcl，0.001M Na2-EDTA，pH8.0）中漂洗2~3次，尽可能去除表面血污、结缔组织及脂肪组织后剪碎。
按组织重﹕缓冲液A=1﹕5~10加入缓冲液A，用玻璃匀浆器冰浴匀浆。
1.2 1000 g•min-1离心15min；取上清液；15000 g•min-1离心20min，弃上清，沉淀用缓冲液B （0.25M 蔗糖，0.05M Tris·Hcl，0.007M Mg Cl2，p H7.5）洗涤，按0.5m L•g-1肝的比例加入缓冲液B 悬浮沉淀后加入DNase I 至终浓度为100 µg•m L-1，30℃下作用30min。
1.3 冰浴冷却，加入2倍体积的DNase I反应终止液（0.25M蔗糖，0.1M Na2-EDTA，pH8.0）。
15000g•min-1离心20min。
沉淀用DNaseI反应终止液洗涤一次，重复离心。
1.4 按0.5 m L•g-1肝加入缓冲液C（0.1M Nacl，0.05M Tris·Hcl，0.01M Na2-EDTA，p H8.5）悬浮沉淀，加入SDS至终浓度为1%~1.5%，吸打混匀后37℃保温15min。
1.5 用等体积的苯酚，苯酚/氯仿（1:1），氯仿/异戊醇（24:1）各抽提一次。
取水相，加0.2 倍体积1M Na Ac和2倍体积的预冷无水乙醇，混匀后放在4℃冰箱中过夜。
1.6 15000g•min-1离心30min后去上清；沉淀用70%乙醇洗涤2次，干燥，TE（0.01M Tris·Hcl，0.001M Na2-EDTA，pH8.0）溶解。
1.7 加入预处理的RNase I 至终浓度为50µg•m L-1，37℃保温1h。
实验二细胞核与线粒体的分离与观察
实验二细胞核与线粒体的分离与观察实验二细胞核与线粒体的分离与观察一、实验目的1．了解差速离心法分离细胞核与线粒体的原理。
2．掌握差速离心法分离动物与植物细胞的细胞核与线粒体的方法。
二、实验原理细胞核（nucleus）是细胞中重要的细胞器，细胞的控制中心，在细胞的代谢、生长、分化中起着重要作用，是遗传物质的主要存在部位。
线粒体（mitochondria）是真核细胞特有的能量转换的重要细胞器，是细胞进行有氧呼吸的主要场所。
细胞中的能源物质—脂肪、糖、部分氨基酸在此进行最终的氧化，并通过偶联磷酸化生成ATP，供给细胞生理活动需要。
对细胞核和线粒体结构与功能的研究通常是在离体进行的，因而分离细胞核和线粒体是必须的。
差速离心主要是采取逐渐提高离心速度的方法分离不同大小的细胞器。
采用组织匀浆在悬浮介质中进行差速离心分离细胞核和线粒体。
在确定的离心场中，球形颗粒的沉降速度取决于它的密度、半径和悬浮介质的黏度。
在一均匀悬浮介质中离心一定时间内，组织匀浆中的各种细胞器及其它内含物由于沉降速度不同将停留在高低不同的位置。
依次增加离心力和离心时间，就能够使这些颗粒按其大小、轻重分批沉降在离心管底部，从而分批收集。
细胞器中最先沉淀的是细胞核，其次是线粒体，其它更轻的细胞器和大分子可依次再分离。
缓冲的蔗糖溶液是常用的悬浮介质，它属于等渗溶液，比较接近细胞质的分散相，在一定程度上能保持细胞器的结构和酶的活性，在pH7.2的条件下，亚细胞组分不容易重新聚集，有利于分离。
整个操作过程应注意使样品保持4℃，避免酶失活。
线粒体的鉴定用詹纳斯绿B（Janus green B）活染法，对线粒体专一的活细胞染料，毒性很小，线粒体的细胞色素氧化酶使该染料保持在氧化状态呈现蓝绿色从而使线粒体显色，而胞质中染料被还原成无色。
从植物细胞分离线粒体除了作线粒体功能测定外，在植物细胞遗传工程中，常用于分离核外基因——线粒体DNA等目的。
分离线粒体的方法仍采用均匀介质中的差速离心。
细胞线粒体分离
细胞线粒体分离在进行细胞线粒体分离实验时，确保实验步骤的准确性和实验环境的无菌性是至关重要的。
以下是一个基本的线粒体分离流程，以及一些重要的注意事项。
实验材料：1. 新鲜的组织或细胞样品2. 预冷的线粒体缓冲液（MB）3. 预冷的分离介质（例如Percoll或Nycodenz）4. 离心管和离心机5. 显微镜和细胞计数器实验步骤：1. 收集新鲜的组织或细胞样品，并用预冷的MB缓冲液冲洗以去除任何残留物。
2. 将组织或细胞样品放入离心管中，并加入足够的预冷MB缓冲液以覆盖样品。
3. 用锋利的刀片将组织或细胞样品切成小块，然后使用研磨器将其研磨成匀浆。
4. 将匀浆通过纱布或棉签过滤，以去除大的颗粒和细胞残骸。
5. 将过滤后的匀浆转移到离心管中，并加入足够的预冷分离介质。
6. 以适当的离心速度离心样品，以分离出线粒体。
7. 使用显微镜和细胞计数器对离心后的样品进行观察和计数，以确保获得了足够的线粒体数量。
8. 将分离出的线粒体用于后续的实验或保存以备后用。
注意事项：1. 在整个实验过程中，要确保使用的所有溶液都是预冷的，以避免线粒体的热损伤。
2. 在切割、研磨和过滤组织样品时，要尽量减少对线粒体的机械损伤。
3. 离心速度和时间要根据实验条件进行调整，以确保最佳的线粒体分离效果。
4. 在使用显微镜和细胞计数器进行观察和计数时，要确保样品的代表性，并避免误差的产生。
5. 实验过程中要避免污染，包括对溶液、器具和操作者的污染。
所有使用的器具都应经过消毒处理，并在无菌环境下操作。
6. 线粒体是细胞内的亚细胞结构，其功能与细胞的能量代谢密切相关。
因此，线粒体分离实验的结果可以反映细胞的生理状态，对于研究细胞的能量代谢、疾病机制等方面具有重要的意义。
7. 线粒体分离实验的难度较大，需要操作者具备较高的实验技能和经验。
因此，在进行实验前，应充分了解实验原理、熟悉操作流程，并严格按照实验步骤进行操作。
8. 在实验过程中，应注意安全问题。
实验五 线粒体的分离与观察共27页文档
56、死去何所道，托体同山阿。 57、春秋多佳日，登高赋新诗。 58、种豆南山下，草盛豆苗稀。晨兴 理荒秽 ，带月 荷锄归 。道狭 草木长 ，夕露 沾我衣 。衣沾 不足惜 ，但使 愿无违 。 59、相见无杂言，但道桑麻长。 60、迢迢新秋夕，亭亭月将圆。
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71、既然我已经踏上这条道路，那么，任何东西都不应妨碍我沿着这条路走下去。——康德 72、家庭成为快乐的种子在外也不致成为障碍物但在旅行之际却是夜间的伴侣。——西塞罗 73、坚持意志伟大的事业需要始终不渝的精神。——伏尔泰 74、路漫漫其修道远，吾将上下而求索。——屈原 75、内外相应，言行相称。——韩非
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（二）玉米线粒体的分离
分离线粒体
混合上清液 10000×g 离心 10 ↓
↓
沉淀（线粒体） 上清液（弃去）
洗涤，加 0.25mol/L 预冷
蔗糖溶液 6mL ,10000×g 离心
10min,重复洗涤两次
↓
↓
↓
沉淀（线粒体） 上清液（制一张涂片，后弃去）
1、玉米种子用 20%次氯酸钠溶液浸泡 10min 消毒，清水冲洗 30Байду номын сангаасin，再浸泡清水
5、沉淀为线粒体，可存于 0.3mol/L 甘露醇中，注意以上匀浆化及离心均控制在
0－4℃进行。
6、线粒体的观察：取线粒体沉淀涂在清洁的载玻片上，不待干立即滴加 1%詹纳斯绿
B 染色 20min，放上盖玻片，用显微镜观察，线粒体是蓝绿色圆形颗粒。
（三）人口腔粘膜上皮细胞线粒体的超活染色观察
1、取清洁载玻片放在 37℃恒温水浴锅的金属板上，滴 2 滴 1/5000 詹纳斯绿 B 染液。
分离细胞核
鼠肝 1 克 匀浆 ↓
匀浆过滤 ↓
滤液（制涂片一张 ①） ↓
将滤液 3mL 覆盖于相同容积的 0.34mol/L 蔗糖溶液上 ↓
700×g 离心 10min ↓
↓
沉淀（细胞核及碎片） 上清液 1(制一张涂片②,自然干燥)
↓
洗涤（0.25mol/L 预冷蔗糖溶
液 3mL 洗涤两次）每次 1000×g
2、实验者用牙签钝端在自己口腔颊粘膜处稍用力刮取上皮细胞，将刮下的粘液状物放
入载玻片的染液滴中，染色 10－15min（注意不可使染液干燥，必要时可再加滴染液），盖
上盖玻片，用吸水纸吸去四周溢出的染液，置显微镜下观察。
3、在低倍镜下，选择平展的口腔上皮细胞，换高倍镜或油镜进行观察。可见扁平状上
皮细胞的核周围胞质中，分布着一些被染成蓝绿色的颗粒状或短棒状的结构，即是线粒体。
↓ 沉淀（细胞核）
离心 15min
↓
↓
↓ 上清液 2(与上清液 1 合并)
2
对全部高中资料试卷电气设备，在安装过程中以及安装结束后进行高中资料试卷调整试验；通电检查所有设备高中资料电试力卷保相护互装作置用调与试相技互术关，系电，力根通保据过护生管高产线中工敷资艺设料高技试中术卷资，配料不置试仅技卷可术要以是求解指，决机对吊组电顶在气层进设配行备置继进不电行规保空范护载高与中带资负料荷试下卷高问总中题体资，配料而置试且时卷可，调保需控障要试各在验类最；管大对路限设习度备题内进到来行位确调。保整在机使管组其路高在敷中正设资常过料工程试况中卷下，安与要全过加，度强并工看且作护尽下关可都于能可管地以路缩正高小常中故工资障作料高；试中对卷资于连料继接试电管卷保口破护处坏进理范行高围整中，核资或对料者定试对值卷某，弯些审扁异核度常与固高校定中对盒资图位料纸置试，.卷保编工护写况层复进防杂行腐设自跨备动接与处地装理线置，弯高尤曲中其半资要径料避标试免高卷错等调误，试高要方中求案资技，料术编试交写5、卷底重电保。要气护管设设装线备备置敷4高、调动设中电试作技资气高，术料课中并3中试、件资且包卷管中料拒含试路调试绝线验敷试卷动槽方设技作、案技术，管以术来架及避等系免多统不项启必方动要式方高，案中为；资解对料决整试高套卷中启突语动然文过停电程机气中。课高因件中此中资，管料电壁试力薄卷高、电中接气资口设料不备试严进卷等行保问调护题试装，工置合作调理并试利且技用进术管行，线过要敷关求设运电技行力术高保。中护线资装缆料置敷试做设卷到原技准则术确：指灵在导活分。。线对对盒于于处调差，试动当过保不程护同中装电高置压中高回资中路料资交试料叉卷试时技卷，术调应问试采题技用，术金作是属为指隔调发板试电进人机行员一隔，变开需压处要器理在组；事在同前发一掌生线握内槽图部内 纸故，资障强料时电、，回设需路备要须制进同造行时厂外切家部断出电习具源题高高电中中源资资，料料线试试缆卷卷敷试切设验除完报从毕告而，与采要相用进关高行技中检术资查资料和料试检，卷测并主处且要理了保。解护现装场置设。备高中资料试卷布置情况与有关高中资料试卷电气系统接线等情况，然后根据规范与规程规定，制定设备调试高中资料试卷方案。
线粒体的鉴定用詹纳斯绿活染法。詹纳斯绿 B（Janus green B）是对线粒体专一的活 细胞染料，毒性很小，属于碱性染料，解离后带正电，由电性吸引堆积在线粒体膜上。线 粒体的细胞色素氧化酶使该染料保持在氧化状态呈现蓝绿色从而使线粒体显色，而胞质中 的染料被还原成无色。 三、实验材料与方法
1、材料：人口腔上皮细胞、大鼠肝脏、玉米黄化幼苗（水稻、高粱等幼苗均可）、洋 葱鳞茎内表皮细胞。
2、主要试剂和仪器：Ringer 溶液，10%、1/3000 中性红溶液，1%、1/5000 詹纳斯绿 B 溶液；分离介质：0.25mol/L 蔗糖、50mmol/L 的 Tris-盐酸缓冲液（pH7.4），3mmol/L EDTA，0.75mg/ml 牛血清白蛋白（BSA），50mmol/L 的 Tris-HCl 缓冲液(pH7.4)，0.3mol/L 甘露醇（pH7.4）、20%次氯酸钠（NaClO）溶液、1%詹纳斯绿 B 染液，生理盐水， 0.25mol/L 蔗糖＋0.01mol/L Tris-盐酸缓冲液(pH7.4)，0.34mol/L 蔗糖＋0.01mol/L Tris-盐酸 缓冲液(pH7.4)，固定液，姬姆萨染液，1/15mol/L 磷酸盐缓冲液（pH6.8）。温箱，冰箱， 冷冻控温高速离心机（或普通高速离心机），高速离心机，显微镜，恒温水浴锅，解剖盘， 玻璃匀浆器，剪刀、镊子，双面刀片，载玻片，凹面载玻片，盖玻片，漏斗，小烧杯，表 面皿，吸管，牙签，吸水纸，纱布，瓷研钵，尼龙织物。 四、实验方法
对全部高中资料试卷电气设备，在安装过程中以及安装结束后进行高中资料试卷调整试验；通电检查所有设备高中资料电试力卷保相护互装作置用调与试相技互术关，系电，力根保通据护过生高管产中线工资敷艺料设高试技中卷术资配，料置不试技仅卷术可要是以求指解，机决对组吊电在顶气进层设行配备继置进电不行保规空护范载高与中带资负料荷试下卷高总问中体题资配，料置而试时且卷，可调需保控要障试在各验最类；大管对限路设度习备内题进来到行确位调保。整机在使组管其高路在中敷正资设常料过工试程况卷中下安，与全要过，加度并强工且看作尽护下可关都能于可地管以缩路正小高常故中工障资作高料；中试对资卷于料连继试接电卷管保破口护坏处进范理行围高整，中核或资对者料定对试值某卷，些弯审异扁核常度与高固校中定对资盒图料位纸试置，.卷编保工写护况复层进杂防行设腐自备跨动与接处装地理置线，高弯尤中曲其资半要料径避试标免卷高错调等误试，高方要中案求资，技料编术试5写交卷、重底保电要。护气设管装设备线置备4高敷动调、中设作试电资技，高气料术并中课3试中且资件、卷包拒料中管试含绝试调路验线动卷试敷方槽作技设案、，术技以管来术及架避系等免统多不启项必动方要方式高案，中；为资对解料整决试套高卷启中突动语然过文停程电机中气。高课因中件此资中，料管电试壁力卷薄高电、中气接资设口料备不试进严卷行等保调问护试题装工，置作合调并理试且利技进用术行管，过线要关敷求运设电行技力高术保中。护资线装料缆置试敷做卷设到技原准术则确指：灵导在活。分。对线对于盒于调处差试，动过当保程不护中同装高电置中压高资回中料路资试交料卷叉试技时卷术，调问应试题采技，用术作金是为属指调隔发试板电人进机员行一，隔变需开压要处器在理组事；在前同发掌一生握线内图槽部纸内故资，障料强时、电，设回需备路要制须进造同行厂时外家切部出断电具习源高题高中电中资源资料，料试线试卷缆卷试敷切验设除报完从告毕而与，采相要用关进高技行中术检资资查料料和试，检卷并测主且处要了理保解。护现装场置设。备高中资料试卷布置情况与有关高中资料试卷电气系统接线等情况，然后根据规范与规程规定，制定设备调试高中资料试卷方案。
（一）大鼠肝线粒体的分离 1、制备大鼠肝细胞匀浆。实验前大鼠空腹 12h，击头处死，剖腹取肝，迅速用生理盐
1
水洗净血水，用滤纸吸干。称取肝组织 2g，剪碎，用预冷到 0－4℃的 0.25mol/L 缓冲蔗糖 溶液洗涤数次。然后在 0－4℃条件下，按每克肝加 9ml 冷的 0.25mol/L 缓冲蔗糖溶液将肝 组织匀浆化，蔗糖溶液应分数次添加，匀浆用双层尼龙织物过滤备用。注意尽可能先充分 剪碎肝组织，缩短匀浆时间，整个分离过程不宜过长，以保持组分生理活性。
实验三 线粒体的分离、超活染色与观察
一、实验目的 1、学习差速离心法分离动、植物线粒体技术。 2、观察动、植物活细胞内线粒体的形态、数量与分布。 3、学习细胞器的超活染色技术。
二、实验原理 利用沉降系数不同的颗粒，在一定介质中沉降速度的差异，采取分级差速离心的方法，
将线粒体从细胞悬液中逐级分离出来。离心用的悬浮介质通常用缓冲的蔗糖溶液，它比较 接近细胞质的分散相，在一定程度上能保持细胞器的结构和酶的活性，在 pH7.2 的条件下， 亚细胞组分不容易重新聚集，有利于分离。整个操作过程应注意使样品保持 4℃，避免酶 失活。
15h。将种子平铺在放有湿纱布的盘内，保持湿度，置温箱 28℃于暗处培育 2－3d。待芽长
到 1－2cm 长时剪下下约 15g，放 0－4℃ 1h。
2、加 3 倍体积分离介质，在瓷研钵内快速研磨成匀浆。
3、用多层纱布过滤，滤液经 700×g 离心 10min。除去核和杂质沉淀。
4、取上清液 10000×g 离心 10min，沉淀为线粒体。再同上离心洗涤一次。