链霉素效价测定方案

链霉素效价测定方案

试验目的： 1、设计链霉素效价测定方案

2、 熟悉并掌握抗生素效价测定方法

试验器材：

双碟 陶瓦盖 钢管、钢管放置器、玻璃容器 、毛细滴管 、灭菌刻度吸管 、称量瓶 、恒温培养箱 、万分之一天平、干燥箱、恒温水浴箱 、显微镜、抑菌圈测量仪或游标卡尺 、超净工作台 、冰箱、酒精灯、接种环

供试品称量量：50mg

缓冲液：

磷酸盐缓冲液（ph7.8）取磷酸氢二钾5.59g 与磷酸氢二钾0.41g,加水使成1000ml,摇匀滤过。121℃蒸汽灭菌30min 备用。 培养基制备数量

营养琼脂培养基：100ml,作为菌种活化用。

双碟数量：8套（供试品效价测定）+8套（预试验）。共16副

小钢管：32个（供试品效价测定）+32个（预试验），共64个，每个双碟中放置4个。

1个 供试品效价测定 4个 用于预试验

5个每瓶100ml

1个 用于预试验 1个供试品效价测定

2个 每瓶250ml

7个三角瓶

操作步骤

菌种

1）枯燥芽孢杆菌【Bacillus subtilis CMCC(B) 63 501】

2）枯燥芽孢杆菌菌悬液的制备

菌液制备

取枯燥芽孢杆菌的营养琼脂斜面培养物，加灭菌水2ml冲下菌苔，制成悬液，用吸管将此悬液接种于营养琼脂培养基上，均匀摊布，在37℃培养7天，取菌苔少许涂片，用革兰染色镜检，应有芽孢85%以上。用灭菌水将芽孢洗下，制成芽孢悬液，合并至灭菌大试管内，65℃水浴内加热30min，将菌体杀死，待冷后放冰箱储藏为浓菌液。

供试品溶液的制备

供试品估计效价1000000U/g.精密称取样品50.0mg，加水50ml，稀释制成1000U/ml溶液，吸取2ml加入100ml容量瓶中，加pH7.8磷酸盐缓冲液稀释至刻度，制成20U/ml溶液，吸取7ml加入100ml 容量瓶中，制成1.4U/ml溶液, 吸取25ml加入50ml容量瓶中，制成0.7U/ml溶液,作为滴碟用供试品及标准品溶液。

培养基Ⅰ

胨5g 牛肉浸出粉3g

磷酸氢二钾3g 琼脂20g 水1000ml

除琼脂外，混合上述成分，调节ph值使比最总的ph值略高0.2，加入琼脂，加热溶化后滤过，调ph值使灭菌后为7.8～8.0，在115℃灭菌30min。

检菌为枯燥芽孢杆菌【Bacillus subtilis CMCC(B) 63 501 】双碟的制备

预实验

将培养基用微波炉融化，保温使温度降至60℃左右，取8套已灭菌双碟，每套中加20mlⅠ培养基，作为底层。将另外四个装量为100ml的培养基，于58℃保温，30min底层凝固后，往100ml培养基中分别加入菌悬液2.0ml,1.5ml,1.0ml，0.5ml,摇匀，于每套双碟中分别加5ml,并迅速摇匀，作为菌层。30min菌层凝固后，用钢管放置器，每套双碟中放入4只小钢管。将滴好的双碟放入37℃恒温室中培养18h。取出双碟，将钢管倒入消毒液中，盖上玻璃盖，用效价抑菌圈测量仪测量抑菌圈大小。

高剂量和低剂量的抑菌圈直径相差大于等于2mm的为最适加菌量。

供试品

将培养基用微波炉融化，保温使温度降至60℃左右，取8套已灭菌双碟，每套中加20mlⅠ培养基，作为底层，另一个100ml培养基，要于58℃保温，30min底层凝固后，往100ml培养基中加入菌悬液1.0ml(由预试验得到)，摇匀，于每套双碟中分别加5ml,并迅速摇匀，作为菌层。30min菌层凝固后，用钢管放置器，每套双碟中放入4只小钢管。

滴碟培养

取上述供试品溶液滴入钢管内，滴加顺序为：顺时

针,SH-TH-SL-TL。将滴好的双碟放入37℃恒温室中培养18h。取出双碟，将钢管倒入消毒液中，盖上玻璃盖，用效价抑菌圈测量仪测量结果。