枯草杆菌生产_淀粉酶的研究

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枯草芽孢杆菌降解淀粉的原理

枯草芽孢杆菌降解淀粉的原理
枯草芽孢杆菌降解淀粉的原理是通过分泌胞外淀粉酶将淀粉分解为小分子有机物，进而被吸收到细胞内。

在细胞内，这些小分子有机物通过呼吸作用被彻底分解为无机物。

具体来说，枯草芽孢杆菌能够产生一种生理性细菌，这种细菌能够直接发酵淀粉，将其分解为短链脂肪酸和气体。

这个过程中，淀粉被分解为一种类似于营养细胞壁的纤维，这些纤维将淀粉营养物质包围在细胞壁内。

部分纤维可溶解于水并产生粘性物质，这些粘性物质抑制动物的正常消化功能，妨碍动物吸收营养。

然而，当这些纤维被去除后，营养物质就能从细胞壁里释放出来，从而提高代谢能和蛋白质的利用率。

此外，酵母作为单细胞生物，在操作和生产上具有细菌表达系统的特点，同时也具有真核细胞对翻译后蛋白的加工及修饰过程。

酵母细胞壁中的β-葡聚糖和甘露糖醇可以与淀粉分子中的葡萄糖基团结合，使其酶解，从而进一步促进淀粉的降解。

总之，枯草芽孢杆菌降解淀粉的过程是一个复杂的生物化学过程，涉及到多种酶和代谢途径的协同作用。

枯草芽孢杆菌产淀粉酶基因的克隆与表达

枯草芽孢杆菌产淀粉酶基因的克隆与表达枯草芽孢杆菌（Bacillussubtilis）是一种在垃圾堆、陆地和淡水中常见的细菌，它可以合成淀粉酶，参与食品加工和制药等领域。

为了深入研究芽孢杆菌产淀粉酶的机制，本文旨在克隆和表达枯草芽孢杆菌的淀粉酶基因，为今后的更深入研究奠定基础。

研究中，我们首先从枯草芽孢杆菌的形态学特性中确定菌株，然后利用定点突变技术，以外源基因引入枯草芽孢杆菌，以达到调控基因表达的目的。

实验中，通过对枯草芽孢杆菌分离介质DNA的提取、限制性内切酶扩增以及后续的PCR扩增，我们能够从大量杂合DNA中克隆出淀粉酶基因的片段，然后进行终止密码子转录、酶切以及连接方面的实验，最终可以将淀粉酶基因克隆入宿主细菌质粒中，从而表达淀粉酶蛋白。

经过蛋白质免疫印迹分析，可以看到从枯草芽孢杆菌中克隆和表达的具有淀粉酶功能的蛋白质，在不同pH条件下具有较强的淀粉水解能力，与未经克隆表达的芽孢杆菌菌株相比，淀粉酶产量有了显著提高。

基于以上结果，我们总结出了枯草芽孢杆菌产淀粉酶基因的克隆与表达的技术方案，为今后的深入研究提供基础，也为特定乳酸菌淀粉酶防护剂的研发提供参考价值。

本文通过介绍枯草芽孢杆菌产淀粉酶基因的克隆与表达，探索了枯草芽孢杆菌淀粉酶的分子机制，证明了定点突变技术对淀粉水解能力的增强作用，为淀粉酶的进一步研究提供了可靠的技术手段。

未来，
我们将借助于新的基因技术等技术平台，进一步深入研究芽孢杆菌淀粉酶的功能、结构和稳定性，以期能更好地利用该酶的乳化作用，为食品加工和药物制造等领域提供支持。

从枯草杆菌发酵液中提取a淀粉酶的流程

从枯草杆菌发酵液中提取a淀粉酶的流程下载温馨提示:该文档是我店铺精心编制而成，希望大家下载以后，能够帮助大家解决实际的问题。

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实验六紫外线对枯草芽孢杆菌产淀粉酶的诱变效应

实验六紫外线对枯草芽孢杆菌产淀粉酶的诱变效应、抗菌素生物效价的评价及裂解性噬菌体效价测定（-----结果分析）•实验目的与要求：•1、学习并掌握物理诱变——紫外射线诱变育种的方法。

学习并掌握计算诱变后存活率及致死率的计算。

学习透明圈和菌落直径大小及HC比值计算。

•2、学会裂解性噬菌体效价测定方法。

•3、学会抗生素效价测定方法及利用检定菌检测微生物代谢产物的抗菌性。

一、紫外诱变枯草芽胞杆菌效应• 1.紫外诱变过程：•紫外线诱变采用15W紫外线杀菌灯；在正式照射前，应先开紫外线10min，让紫外灯预热；灯与处理物的距离为30cm；无菌取菌悬液使其厚度为0.5～1.0cm，放在紫外灯的照射台上，开启电磁搅拌器开关。

操作均应在红灯下进行，或用黑纸包住，避免白炽光。

•照射时间：未照射前（0时），照射1min，照射2min，照射3min时分别取样0.5ml；每照射到时间马上无菌取样，加到已经编号的第1个试管，为10-1，共有4个时间的10-1 ，分别将其稀释至：•0min 1min 2min 3min•稀释度10-610-710-8 10-610-710-8 10-510-610-7 10-410-510-6•每个稀释度各取0.2ml涂平板，共涂12块平板，做好标记，37℃培养48hr。

• 2.计算致死率•（1）对照样品中活菌数：将培养至48h后对照古板取出进行细胞计数，根据平板上菌勤务员落数，计算出对照样品1ml菌液中的活菌数。

同样方法数出紫外线处理1、2、3min后的细菌数。

•（2）致死率计算：（3）画出致死率曲线：横坐标为照射时间，纵坐标为致死率。

• 3.观察诱变效应•在平板菌落计数后，分别向菌落数在5个左右的平板内加碘液数滴，在菌落周围将出现透明圈。

•分别测量透明圈菌落计算比值（HC值），与对照平板进行比较。

二、抗菌素滤纸片法测定生物效价• 1.实验操作过程：•（1）将牛肉膏蛋白胨琼脂培养基灭菌融化，倒平板凝固后，用无菌吸管吸取培养好的试验菌液0.2ml，采用涂布法均匀涂于平皿表面。

枯草杆菌生产α-淀粉酶的研究 -回复

枯草杆菌生产α-淀粉酶的研究-回复枯草杆菌生产α淀粉酶的研究引言：淀粉是一种由葡萄糖分子组成的多聚体，是植物细胞中最重要的储能物质。

为了有效地利用淀粉，许多微生物产生了淀粉酶。

淀粉酶能够水解淀粉成为可被微生物利用的单糖，其中α淀粉酶是将淀粉水解成麦芽糖或是葡萄糖的主要酶类之一。

而枯草杆菌是一种广泛存在于土壤中的细菌，在许多领域都具有潜在应用价值。

本文将探讨枯草杆菌生产α淀粉酶的研究目的、方法、结果和展望。

目的：本研究的目的是通过培养枯草杆菌，使其表达α淀粉酶，以探索其在产业应用上的潜力。

方法：1. 枯草杆菌菌种的筛选：从不同的土壤样本中筛选出具有较高淀粉酶产量的枯草杆菌菌株；2. 培养基的优化：对枯草杆菌菌株进行不同培养基的筛选和优化，以提高淀粉酶产量；3. 发酵条件的优化：调节发酵条件，包括温度、初始pH、培养时间和淀粉浓度，进一步提高淀粉酶活性；4. α淀粉酶的提取和纯化：通过离心、过滤、浓缩和柱层析等技术，将淀粉酶从菌体中分离提取，并进行纯化。

结果：通过以上的实验步骤和优化条件，我们成功获得了一株高产α淀粉酶的枯草杆菌菌株，并获得了较高的淀粉酶产量。

实验结果表明，枯草杆菌在适宜的发酵条件下能够表达和产生大量的α淀粉酶。

展望：虽然本研究已经取得了一定的成果，但仍然存在一些挑战和改进的空间。

首先，我们可以进一步优化发酵条件，以提高淀粉酶产量。

其次，可以通过基因工程手段改良枯草杆菌的基因组，提高其淀粉酶产量和活性。

此外，可以进一步研究α淀粉酶的性质和机制，以在其应用领域发挥更大的作用。

结论：本研究通过对枯草杆菌的研究，成功实现了α淀粉酶的生产。

这为淀粉酶的产业化应用提供了新的途径和可能性。

枯草杆菌生产α淀粉酶具有较高的生物安全性和可行性，且可以通过合理优化发酵条件和基因工程手段，进一步提高产量和活性。

通过深入研究淀粉酶的性质和机制，有望在食品加工、饲料行业和生物能源领域等方面发挥重要作用。

总结：枯草杆菌是一种潜在的产α淀粉酶的微生物菌株。

产淀粉酶枯草芽孢杆菌

“生物制药技术实训”课程研究报告项目一：产淀粉酶枯草芽孢杆菌一实验原理枯草芽孢杆菌的多数中都能产生大量的淀粉酶，较易得到分离。

由于芽孢具有较强的抗热能力，分离纯化时可采用热处理的方法，高温加热处理，杀死样品中所有不含芽孢的菌类，在培养过程中使芽孢杆菌得到很好的富集。

利用该菌产淀粉酶的特性，选择以淀粉为碳源的分离培养基，菌体分泌的淀粉酶会使菌落周围的淀粉水解，滴加碘液即可在菌落周围出现清晰的透明圈。

根据透明圈的直径（C）与菌落直径（H）之比（C/H）可初步鉴定酶活力的高低，即比值越大酶活力越高，进而筛选出优良的生产用菌。

二材料灭过菌的种子培养基无菌生理盐水（杀了菌的生理盐水，盐浓度0.9％）培养基配方：蛋白胨10g，酵母浸膏5g，NaCl10g，水1L，淀粉，1. 8%的琼脂PH7.2-7.4，121℃灭菌20min（各量取其三分之一）。

三操作步骤1.包平板2.配生理盐水3.根据培养基配方配置培养基，并取出45ml用于液体培养基，其余作为固体培养基4.取1，2，3中配成的平板，生理盐水，大型三角瓶在121℃中灭菌20min5．称取土壤10g与 90mL无菌水中，振荡20分，使土壤中菌体或孢子均匀分散，取其悬浮液于80℃下保持10min,以杀死非芽孢的菌体。

取5ml悬浮液接入到装有45 ml种子培养基的三角瓶内，（于37℃、200 r/min摇床中）培养20 h6.灭完菌后倒平板，自然冷却凝固后放入恒温培养箱中静致一夜，观察其是否染菌7.将用于做梯度试验的试管8个，每个加9ml蒸馏水，移液管8个，塞棉花拿去灭菌121℃，20min8. 取培养后的菌液，用无菌生理盐水适当稀释，取一定量涂布于平板，做梯度试验分别标记为100，10-1，10-2，10-3，10-4，10-5，10-6，10-7，10-8，10-9，10-10。

9.将标记的的试管，移取1ml与培养基中涂布并进行标记，于37℃，培养20h10.将灭菌好的平板拿出，进行无菌划线，在培养基中观察到10-8，10-9，10-10，有单一菌落，而10-6，10-7并不明显，．对10-8，10-9，10-10的培养基中的菌落加碘液进行观察，发现有透明圈。

枯草杆菌摇瓶发酵生产α-淀粉酶实验方案

枯草芽孢杆菌产α-淀粉酶发酵试验一、实验原理以枯草芽孢杆菌（BacilusSubtilisBF—7658）为实验菌株，通过种子扩大培养，选出生长力旺盛的菌株进行液体摇瓶发酵。

通过测定不同发酵时间生产的酶活，来初步估计发酵最佳时期和终点。

淀粉酶是能够分解淀粉糖苷键的一类酶的总称，包括α-淀粉酶、β-淀粉酶、糖化酶和异淀粉酶。

芽孢杆菌主要用来产生α-淀粉酶和异淀粉酶，其中α-淀粉酶又称淀粉1，4-糊精酶，能够切开淀粉链内部的α-1，4-糖苷键，将淀粉水解为麦芽糖、含有 6 个葡萄糖单位的寡糖和带有支链的寡糖；而异淀粉酶又称淀粉α-1，6-葡萄糖苷酶、分枝酶，此酶作用于支链淀粉分子分枝点处的α-1，6-糖苷键，将支链淀粉的整个侧链切下变成直链淀粉。

通过发酵实验，我们可以以酶活为依据，初步估计发酵的最佳时期和发酵终点。

二、实验材料（一）实验菌株：以枯草芽孢杆菌（二）培养基：1、种子培养液：葡萄糖1% 、胰蛋白胨：1%, 、酵母提取物：0.5%、NaCl(氯化钠)：1%调pH7.2 ，若配置固体培养基，则再加入1.5% 琼脂。

2、产淀粉酶发酵培养液：玉米粉 2 .0 % 、蛋白胨1 .5% 、CaCl20 .02 % 、MgSO40 .02% 、NaCl 0 .25% 、K2HPO40 .2% 、柠檬酸钠0 .2% 、硫酸铵0 .075% 、Na2HPO40 .2 %调节pH 值7 .0（三）0.02M磷酸缓冲液（pH6.0）（四）实验仪器离心机、水浴锅、250mL三角瓶、试管三、实验过程1、分别按培养基配方配制种子培养基和发酵培养基。

2、种子斜面及种子液准备A.挑取单菌落从平板转接于新鲜种子斜面培养基，37℃，24h作菌种（3支/组）。

B.将配好的种子培养液按每瓶50mL分装于250mL三角瓶中灭菌（ 100KPa 20min ）。

C.在无菌操作条件下，将活化的菌株接种于以上培养液中（每支斜面接两瓶），37℃ 120r／min振荡培养16h作种子液。

枯草杆菌生产α-淀粉酶的研究

为主进行大规模生产ａ一淀粉酶。国从我
淀粉酶活力。果示干表１菌体生长和结。
产酶的最适温度均在３７℃。度高于４温４℃
１１１菌种枯草芽孢杆菌（ａｉｕ菌体生长和酶活力迅速下降。．．Ｂｃｌｓｌ（）２培养基对菌体生长和产酶的影响，同在最适温度３ ℃下，同的接种量、同７相相
枯草芽孢杆菌在马铃 பைடு நூலகம்
薯固体培养基（简称ＰＡ）７Ｄ上３ ℃培养１ｈ２后３结论１２２液体种子的制备．．１０三角瓶０ｍＬ０一淀粉酶是产量在，【用途广的酶制剂品种之一，国目前枯草杆菌ａ一粉酶是我淀
一
实际的指导意义。
津产Ｓ００Ｈ６０Ａ型）３在２ ℃至４ ℃范围内培养４枯草芽孢杆菌（ａｉｕｕｔｉ，６后测定Ｂｃｌｓｓｂｉｓ３ｈｌｌ）
一
般可由微生物发酵产生，可由植物和也动物提取。１材料和方法目前，业生产上都以微生物发酵法１１实验材料工．
１ｈｎｆｒｓ）ｉｅｉｏｍｕ等中分离得到了耐高温的１２实验方法ｃ．ａ一粉酶菌种。就国内而言，己开展淀但虽
了耐高温ａ一淀粉酶的研究工作，目前仍以１２．．１菌种激活
使用
适培养时间为３ｈ。６

枯草芽孢杆菌淀粉酶定向进化及对玉米粉水解效果的研究

枯草芽孢杆菌淀粉酶定向进化及对玉米粉水解效果的研究摘要：淀粉是一种广泛存在于植物细胞中的高分子碳水化合物，具有丰富的能量和营养。

枯草芽孢杆菌是一种在自然界中广泛存在的产气厌氧菌，可以分解多种有机物质，包括淀粉。

本研究旨在通过淀粉酶的定向进化，提高枯草芽孢杆菌对玉米粉的水解效果。

1. 引言随着人口的增长和生活水平的提高，对粮食的需求也在不断增加。

利用高效的淀粉水解酶进行玉米粉加工，可以提高淀粉的利用率和食品生产的效益。

2. 方法与材料2.1 枯草芽孢杆菌的培养与体外筛选首先，从自然环境中分离枯草芽孢杆菌，并通过连续传代培养。

然后，制备含有淀粉的琼脂培养基，通过扩展成分筛选培养出具有较高淀粉酶活性的菌株。

2.2 淀粉酶基因的筛选与克隆采用PCR技术，从高淀粉酶活性菌株中扩增出淀粉酶基因。

将扩增的目的基因与表达载体质粒进行连接，并转化到大肠杆菌中进行蓝白斑筛选。

2.3 淀粉酶的定向进化策略通过PCR技术，在淀粉酶基因的特定区域引入随机突变。

然后，选取淀粉酶活性较高的突变体，并继续进行下一轮突变和筛选工作，最终得到活性更高的定向进化淀粉酶。

2.4 玉米粉的水解实验将定向进化淀粉酶转化到枯草芽孢杆菌中，并对其进行培养。

然后，将玉米粉加入到培养基中，利用玉米粉的水解情况评估定向进化淀粉酶对玉米粉的水解能力。

3. 结果与讨论通过筛选和定向进化，我们获得了一株具有较高淀粉酶活性的定向进化淀粉酶。

将该基因转化到枯草芽孢杆菌中，成功提高了枯草芽孢杆菌对玉米粉的水解效果。

4. 结论本研究通过淀粉酶的定向进化，成功提高了枯草芽孢杆菌对玉米粉的水解效果。

这为进一步提高玉米粉的利用率和淀粉的加工效益提供了新思路。

5.通过连续传代培养和扩展成分筛选，我们成功获取了具有较高淀粉酶活性的菌株。

通过PCR技术，我们扩增出了淀粉酶基因，并成功将其连接到表达载体质粒上，并进行了蓝白斑筛选。

通过淀粉酶的定向进化策略，我们引入了随机突变，并筛选出了活性更高的突变体。

淀粉酶实验方案

淀粉酶发酵制备一、实验目的1.学习并掌握从大曲中分离产淀粉酶菌种的方法1．学习并掌握液体摇瓶发酵法制备α-淀粉酶的工艺；2．掌握α-淀粉酶酶活测定原理及方法。

二、实验原理α-淀粉酶生产菌主要有芽孢杆菌和霉菌等。

芽孢杆菌所产α-淀粉酶由于活性高，发酵周期短，酶的耐热件高，尤其是枯草杆菌为大多数工厂所采用。

α-淀粉酶比较耐热但不耐酸，pH 3.6 以下可使其钝化。

β-淀粉酶与α-淀粉酶相反，它不耐热但耐酸，70℃保温 15 min 可使其钝化。

通常提取液中α-淀粉酶和β-淀粉酶同时存在。

可以先测定（α+β）淀粉酶总活力，然后在70℃加热15 min，钝化β-淀粉酶，测出α-淀粉酶活力，用总活力减去α-淀粉酶活力，就可求出β-淀粉酶活力。

另外，β-淀粉酶活力大小可用其作用于淀粉生成的还原糖与3,5-二硝基水杨酸的显色反应来测定。

还原糖作用于黄色的3,5-二硝基水杨酸生成棕红色的3-氨基-5-硝基水杨酸，生成物颜色的深浅与还原糖的量成正比。

以每克样品在一定时间内生成的还原糖（麦芽糖）量表示酶活大小。

三、实验器材与试剂1．实验器材（1）烧杯，三角瓶，玻璃棒，试管，容量瓶、离心管、移液管。

（2）电炉（加热板）、高压灭菌锅、恒温水浴锅、摇床、离心机、电子天平。

2．材料与试剂（1）菌种：大曲粉中产淀粉酶的菌种（经查资料为枯草杆菌）（2）培养基：1）斜面培养基：可溶性淀粉2%，牛肉膏1%，蛋白胨1%，氯化钠0.5%，琼脂2%，pH 7.0-7.2。

2）种子液体培养基：可溶性淀粉1%，牛肉膏1%，蛋白胨1%，氯化钠0.5%，pH 7.0-7.2。

3）发酵培养基：葡萄糖 5%，豆饼粉5%，磷酸氢二钠0.8%，硫酸铵0.4%，无水氯化钙0.2%，MgSO4·7H2O 0.02%，pH7.0-7.2。

（3）酶活测定：1）称取碘11 g，碘化钾22 g，加水溶解，稀释至500 mL。

2）标准稀碘液：取碘原液15 mL，加碘化钾8 g，定容至500 mL。

枯草杆菌α-淀粉酶的生产 -回复

枯草杆菌α-淀粉酶的生产-回复枯草杆菌是一种常见的土壤细菌，它具有广泛的生态功能和应用潜力。

其中，枯草杆菌所产生的α淀粉酶具有重要的工业应用价值。

本文将重点介绍枯草杆菌α淀粉酶的生产过程，并一步一步回答相关问题。

第一步：枯草杆菌的筛选和培养枯草杆菌存在于自然环境中，但数量相对较少。

因此，首先需要对土壤、水体等样品进行筛选，以获得富集了枯草杆菌的样品。

一般来说，筛选方法包括稀释平板法、滤膜法等。

将样品分别稀释后接种到富含淀粉的培养基上，通过观察形状、颜色等特征，选择出生长较好的菌落。

筛选获得枯草杆菌后，需要进行培养。

枯草杆菌的培养基一般包括有机氮源、无机盐和适度的碳源。

常用的培养基主要有液体培养基和固体培养基。

液体培养基的优点是便于大规模生产，而固体培养基适用于纯化和保存菌株。

第二步：对枯草杆菌的生理特性进行研究在获得培养好的枯草杆菌后，需要进一步研究其生理特性，了解其适宜生长条件和产酶规律。

主要考察的因素包括温度、pH、碳源和氮源等。

通过调整这些因素，可以获得最佳的生长条件，提高α淀粉酶的产量。

第三步：淀粉诱导条件的优化淀粉是枯草杆菌产生α淀粉酶的主要诱导物。

在培养基中添加适量的淀粉，并对其浓度、添加时间和添加方式等进行优化。

一般来说，较高的淀粉浓度和适当的诱导时间可以促进α淀粉酶的合成和分泌。

第四步：分离和纯化α淀粉酶枯草杆菌培养物中产生了大量的α淀粉酶，但还同时存在其他杂质和细胞碎片等。

因此，需要对培养物进行分离和纯化，以得到纯度较高的α淀粉酶。

分离和纯化方法主要有凝胶过滤、柱层析、凝胶电泳等。

其中，柱层析常用于大规模生产，通过调节柱层析的条件（例如树脂种类、流速等），可以将α淀粉酶与其他杂质分离。

第五步：对纯化后的α淀粉酶进行特性研究分离和纯化后的α淀粉酶需要进行特性研究，了解其催化特性、抗温性和酸碱稳定性等。

这些特性研究有助于评估α淀粉酶在不同工业应用中的潜力和适用性。

除了以上步骤，还可以利用遗传工程手段对枯草杆菌的基因进行改造，提高α淀粉酶的产量和活性。

碳源对枯草芽孢杆菌产_淀粉酶的影响

分别以葡萄糖、蔗糖、可溶性淀粉作为液体发酵培养基
0 0 6 12 18 24 30 36 42 48 54 60 66
的碳源，培养温度为３７ ℃，转速２１０ｒ／ｍｉｎ，培养６６ｈ，每隔
发酵时间 Fermentation time/h
３ｈ取样测定ｐＨ。结果见图３。 10
的酶制剂之一。特别是２０世纪６０年代以来，由于酶法生产
基金项目：河南省重点科技攻关项目（编号：１０２１０２２１０１９２）；河南省教育厅自然科学研究项目（编号：２０１０Ａ５５０００４）
作者简介：李刚（１９７６－），男，河南科技学院讲师，硕士。Ｅ－ｍａｉｌ：ｌｇ７６０９２５＠１６３．ｃｏｍ
图１碳源对Ｂ．ｓｕｂｉｌｉｓ产 α－淀
8
粉酶活力的影响（ｎ＝４）
6
pH
Ｆｉｇｕｒｅ１ＥｆｆｅｃｔｏｆｄｉｆｆｅｒｅｎｔＣａｒｂｏｎＳｏｕｒｃｅｓｏｎＡｃｔｉｖｉｔｙ
4
ｏｆα－ＡｍｙｌａｓｅｂｙＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ（ｎ＝４）
2
空白可溶性淀粉蔗糖葡萄糖
由图１可知，空白组发酵到１２ｈ时，酶活力达到最高
２结果与分析
２．１碳源对Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ产 α－淀粉酶活力的影响为了考察不同碳源对Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ产 α－淀粉酶活力的影
响，分别选用了葡萄糖、蔗糖、可溶性淀粉作为液体发酵培养
力分别为（１１４．５±２．３），（７５．６±２．１），（７２．２±１．２）Ｕ／ｍＬ，由此看来以可溶性淀粉为碳源最佳。２．２碳源对Ｂ．ｓｕｂｉｌｉｓ细胞增殖的影响

α淀粉酶的生产工艺

一,α-淀粉酶菌种的筛选枯草杆菌BF7658是我国应用广泛的液化型α-淀粉酶菌种，国内普遍采用深层发酵法生产工业粗酶。

我们从BF7658出发，用紫外光及化学药品反复交替诱变，选育适用于固体发酵的新菌体BF7658—1。

该菌为短杆状，革兰氏阳性，两端钝园，在肉汁表面可生成菌膜，在培养基上菌落呈乳白色，表面光滑、湿润、略有光泽，用碘液试之，菌落周围呈透明圈。

∙固体培养枯草杆菌BF7658—1生产α-淀粉酶将菌种接种于马铃薯琼脂斜面，37℃培养三天，然后转接到种子液体培养基上（豆饼粉、玉米粉、酵母膏、蛋白胨火碱、水等），摇瓶培养一定时间，当菌体进入对数生长期时，以0. 5%接种量接入固体培养基（麸皮、米糠、豆饼粉、火碱、水；ph=7左右，常压汽蒸一小时，冷却到38～40℃）在厚层通风制曲箱内，通风保持37～42℃，培养48小时出曲风干。

麸曲用1％食盐水3～4倍浸泡，3小时后过滤，调节滤液pH=8，加硫酸铵溶液沉淀酶，经离心，用浓酒精洗涤脱水，40℃烘干、磨粉即为成品。

∙深层发酵法生产α-淀粉酶斜面菌种制法同前。

将试管斜面菌种接种到马铃薯茄子饼斜面（培养基同前种子培养基），37℃培养三天，使之形成芽孢，以提高种子的稳定性。

然后接种到500升种子罐，37℃搅拌通风培养12～14小时。

当菌体进入对数生长期（镜检细胞密集、粗壮整齐、大多数细胞单独存在，少数呈链状，发酵液=6.3～6.8，酶活5～10单位∕毫升）时，乃转入10000升发酵罐，37℃，通风，搅拌，培养40～48小时。

中途三倍碳源的培养基补料，体积相当于基础料的1∕3，从培养12小时开始，每小时一次，分30余次添加完毕。

停止补料后6～8小时罐温不再上升，菌体衰老，80％形成空泡，每2～3小时取样分析一次，当酶活不再升高，可结束发酵。

而后向发酵液中添加2%CaCl2，0.8%Na2HPO4，50～55℃加热处理30分钟，以破坏共存的蛋白酶，促使胶体凝聚而易于过滤。

微生物学实验八硫酸二乙酯对枯草芽孢杆菌产生α-淀粉酶的诱变效应

实验八硫酸二乙酯对枯草芽孢杆菌产生α-淀粉酶的诱变效应（一）目的要求通过实验观察硫酸二乙酯对枯草芽孢杆菌的诱变效应。

初步掌握化学诱变育种的方法。

（二）基本原理许多化学因素如硫酸二乙酯、亚硝酸等，对微生物都有诱变作用。

硫酸二乙酯是一种烷化剂，能与DNA中碱基发生化学变化，从而引起DNA复制时碱基配对的转换或颠换。

一般化学诱变剂都有毒性，很多还具有致癌作用，故操作时切忌用口吸取，并防止与皮肤直接接触。

中止反应时，可以用大量稀释法或加入硫代硫酸钠。

本实验以产生蛋白酶的枯草芽孢杆菌为实验菌种，以硫酸二乙酯为诱变剂，根据枯草芽孢杆菌诱变后在培养基上出现的透明圈直径大小，来指示诱变效应。

（三）实验材料1. 菌种酶泥（菌悬液）2. 培养基肉膏蛋白胨培养基＋0.5％可溶性淀粉（牛肉膏0.5%，蛋白胨1％，NaCl 0.5%，可溶性淀粉0.5%，琼脂2%，pH7.0－7.2）。

3. 主要药品硫酸二乙酯(简写DES，(C2H5)2SO4)、25％硫代硫酸钠。

4. 器皿试管、移液管、锥形瓶、培养皿、离心管、玻璃涂棒、量筒、烧杯等。

（四）实验步骤1. 诱变前的准备工作1）菌种斜面的活化从冰箱取一支纯化后的枯草芽孢杆菌1.398斜面接种到新鲜肉膏蛋白胨斜面培养基上，置于30℃温箱培养24h进行活化。

2）枯草芽孢杆菌对数期培养液的制备取一环已活化的枯草芽孢杆菌接种到装有30 ml肉膏蛋白胨液体培养基的锥形瓶内(每组同学2瓶)，在30℃振荡培养16h，此时为该菌的对数期。

3）准备平板将装在锥形瓶内已灭菌的肉膏蛋白胨固体培养基融化，待冷至45℃左右倾注10个平板待用。

4）菌悬液的制备取上述对数期的枯草芽孢杆菌培养液10 m1，3000 r/min 离心15 min ，沉淀下的菌体用10 ml 0.1mo/LpH 7.0的磷酸缓冲液洗涤两次，最后用原体积的磷酸缓冲液制成菌悬液。

2. 硫酸二乙酯诱变处理 1）诱变吸取1 ml 菌悬液至盛有8ml 无菌水的试管内，再加硫酸二乙酯0.5 ml ，振荡处理5 min 。

枯草芽孢杆菌产淀粉酶条件的优化

据结果绘制图 4。可以看出，接种量不同，酶活力不同，不同接种量所产生淀粉酶的活力大小顺序为： 800 μL、600 μL、1 000 μL、400 μL，其中 800 μL 接种量产生的酶活力显著高于与其他 3 个接种量（P＜ 0．05）。
酶活力//mg/h
69 68 67 66 65 64.584 64 63 62 400
件，分别对碳源、氮源、发酵时间、接种量、培养基初始 pH 进行单因素试验，在此基础上对碳源浓度、氮源
浓度、接种量、培养基初始 pH 这 4 个因素进行了 L9（34）正交优化试验。结果表明，葡萄糖优于其他碳源，
尿素优于其他氮源，最佳培养时间为 30 h；最佳发酵参数组合为 pH 5．0，葡萄糖质量浓度 0．2％，尿素质
收稿日期：2010－12－03 基金项目：山东省优秀中青年科学家奖励基金项目（2008BS09011 ）；山东省自然科学基金项目（2009ZRB01461 ）作者简介：赵望锋（1981－），男，山东莱芜人，助教，硕士，主要从事微生物生态学教学和研究，（电话）0543－3191175 （电子信箱）
湖北农业科学 Hubei Agricultural Sciences
Vol． 50 No.11 Jun．，2011
枯草芽孢杆菌产淀粉酶条件的优化
赵望锋 1，周晶 2 （1．滨州学院经济与管理系，山东滨州 256600；2．曲阜师范大学生命科学学院，山东曲阜 273165）
摘要：以枯草芽孢杆菌为试验菌株，采用液态培养基发酵，探讨枯草芽孢杆菌产 α－淀粉酶的最佳发酵条

枯草杆菌在淀粉液态培养基中生产α-淀粉酶的研究

淀粉酶，当时仅无锡酶制剂厂独家生产，年产量为
收稿日期：２ｏ一Ｏ２Ｏ７ｌ一３
作者简介：徐顺利（９８）女，１５一，副主任医师，现主要从事中西医医学及食品营养学研究。
通讯作者：刘海因，，男副教授，主要从事生物化学教学与科研工作。
目前，工业生产上主要以微生物发酵法进行
到上千个，中约有４％一０其０５％的工厂生产一淀粉
酶。总产量上万吨。
近年来，国外生产耐热一淀粉酶发展较快，己
从嗜热真菌、高温放线菌、物特别是从嗜热细菌（嗜
热脂肪芽孢杆菌Ｂｓａｔｒｏｈｌｔ．ｅｒｈｍｐｉｓ和地衣芽孢ｔｏｅｕ杆菌Ｂ１ｈｎｏｍｌ等）．ｅｉｒｌｉｆ￣中分离得到了耐高温的一ｃ
酶。经实验表明：２在３℃ 至４４℃ 内，酶最适培养温度为３产７℃；草杆茵在淀粉液态培养基中３枯７℃条件下。过经振荡培养，产酶最适淀粉水组成为淀粉：＝５１ｏ在最适温度３其水７：０；７℃ 下，粉：＝５１ｏ时，适培养时阍为淀水７：０最
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第４卷（３总第１０）徐顺利等枯草杆菌在淀粉液态培养基中４期生产ｄ淀粉酶的一研究
本文就枯草杆菌在淀粉培养基上产Ｑ淀粉酶一做一下研究，其对在以玉米（粉含量为７％一５淀０７％）或大米（粉含量为８％一５主要原料的发酵酿淀０８％）

淀粉酶的发酵提取和

2. 在碱性溶液(NaOH)中，双缩脲 (H2NOC—NH—CONH2)能与Cu2+作用，
形成紫色或紫红色的络合物，这个反应
叫做双缩脲反应。由于蛋白质分子中含有很多与双缩脲结构相似的肽键（－CO －NH－），因此，蛋白质可与双缩脲试剂发生颜色反应。此络合物在540nm吸
收值在一定范围内与蛋白质的质量成正比.
一、实验目的
通过以α-淀粉酶的发酵生产为实例，学习和掌握酶的液体发酵和盐析沉淀法提取纯化的基本原理和过程，掌握α-淀粉酶分析方法、发酵和提取的评价标准。
二、实验原理
1、工业生产中酶的提取多数采用盐析沉淀法，即：通过加入不同的金属盐破坏酶的水化层同时中和酶的表面电荷，而使酶快速的形成沉淀，得到分离纯化。本实验通过向枯草杆菌发酵液中加入适量的硫酸铵，对发酵液中的胞外α-淀粉酶进行纯化提取。
2.0
3.0
4.0
5.0
?
震荡15分钟，室温静置30分钟后，540nm比色，以蛋白质含量（mg/ml）为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线。
2. 取发酵液5ml +5ml去离子水(即稀释一倍)
3. 分别测定酵液和提取液中的α-淀粉酶的酶活并计算它们各自的酶比活力
α-淀粉酶的酶活测定
具体操作:5ml发酵液,加1.87克硫酸铵细粉末,混匀, 静置30min.
两组配平,4000r.m.p离心10分钟, 离心去除上清液保留沉淀。测活前加入10ml去离子水溶解。(即稀释一倍)
注意:(剩下的溶液留下来用于下一次测蛋白含量)
2.双缩脲法绘制小牛血清白蛋白标准曲线
取7支试管，编号，按下表加入试剂：
背景知识
淀粉酶是水解淀粉和糖原酶类的总称，广泛存在于动植物和微生物中。α-淀粉酶作用于淀粉时，可从分子内部切开α-1，4键而生成糊精和还原糖。产物的末端葡萄糖残基C1碳原子为α-构型，故称α-淀粉酶。如枯草杆菌BF7658 α-淀粉酶，广泛应用于食品、酿造、制药、纺织以至石油开采等许多方面。

枯草芽孢杆菌HD132产生的α-淀粉酶性质的初步研究

杆菌（．ｕｔｉ）ａ淀粉酶主要的生产菌种之Ｂｓｂｉｓ是一ｌ
一
１１１菌种．．
［］２
。
我国普遍使用的Ｂ７５Ｆ６８便是由枯草杆菌
枯草芽孢杆菌：Ｆ６８（ａｉｕｕｔｌＢ７５Ｂｃｌｓｓｂｉ５ｌｉＢ７５）Ｆ６８黑龙江大学生命科学学院微生物黑龙江
ｕｆｃｎ）嗜碱芽孢杆菌（ａｋｌｐｉｃｐ）ｅａｉｓ、ｅＢ．ｌａｏｈｌＰ、ｉｓ
米曲霉（ｏｙａ）黑曲霉（ｎｇｒ、内孢酶Ａ．ｒｚｅ、Ａ．ｉｅ）拟
１材料与方法
１１实验材料．
（ｄｍｙｃｐｉｆｂｌｇｒ等ｎ。其中枯草芽孢Ｅｎｏｏｓｉｎｉｅ）］ｓ
ａ一
淀粉酶（Ｃ３２１１是目前世界上较早生Ｅ．．．）
和生产菌株都较单一，国外酶制剂行业相比尚与有一定的距离。因此加强ａ淀粉酶上游工程的一研究，加强菌种的筛选和诱变育种工作和基础理论的研究等仍是研究的重点。本文采用枯草芽孢
Ｃ抖、ｅｕＦ。和Ｆ件强烈抑制ａ淀粉酶的活性。ｅ一
关键词：草芽孢杆菌ＨＤＩ２ａ淀粉酶；质枯３；一性中图分类号：２１２ＴＳ０．５文献标识码：Ｂ文章编号：００９７（０８１—０５０１０ — ９３２０）００４— ３