细胞形态结构观察技术
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细胞器培养皿内铺盖片单层培养 细胞悬液 离心沉淀 涂片 染色 观察 拍照 取盖片
固定
（固定剂，染色剂知识介绍） 固定剂的作用：穿透，固定，保形，防腐 固定剂的选择：P83
细胞内组分的差异染色。 染色剂的选择： Giemsa—染色体桃红色。 本书P84 Feulgen—DNA紫红色，细胞质绿色。鄂P141 吖啶橙—RNA红色，DNA亮绿色。本书P86 苏木精-伊红（HE)—细胞核蓝色，细胞质红色 本书P85 过碘酸席夫—细胞内含糖原区—紫红色。章P58 苏丹红III—细胞内含脂肪区—橘红色。章P59 鬼笔环肽—溦丝染色。章P59 免疫荧光法—溦管染色。章P60 联苯胺+H2O2—过氧化氢体染色。小章P37 詹纳斯绿B—活体细胞线粒体。小章P43
4.暗视野显微镜 P64图3-5 适用：观察记录活细胞或细胞器的运动轨迹， 提高分辨率 构造特点：只有聚光器不同于普通显微镜，设 有一个中央遮光板使照明光线不能直射。 标本进入目镜，只许标本散射光进入目 镜 技巧：物镜的数值孔径必小于聚光器的数值孔 径；盖玻片，载玻片应清洁无痕；聚光 镜和载玻片之间加香柏油，保证效果。
2.相差显微镜 P62图3-4 适用：可增强活细胞同背底反差，帮助看清 细胞的轮廓和细胞内细微结构，如： 核仁、染色质、线粒体等。 构造特点：有两个附加构件： 相差接物镜：其光学系统中有一个光环透镜 相差聚光器：内有数个相位板，使用时与物 镜倍数一致 技巧：细胞培养瓶质地均匀透明较好，最好用塑 料瓶；观察摄影时，瓶壁要擦净；光轴对 正，照明度适宜，摸索试调至最佳
=。显微摄影术p68
1.概念：显微摄影术是利用显微摄影装置拍摄 显微镜视野中的物象的技术。 2.技术类型： 胶卷相机摄像 （感光底片） 数码相机摄像 （电子数码设备） CCD图像采集 （同上） 三者前期操作一致，ຫໍສະໝຸດ Baidu期图像存储形式不 同。
3.感光原理： 1）胶片相机：显微摄影时，光线自标本片的 微小物件射入物镜后，造成一个倒立的放大实 像，经目镜进一步放大后，投射在底片上，使 底片感光而记录下显微镜视野中的物象。 2）数码相机与CCD图像采集原理相同，是以 数字形式用电子设备储存图像，通过数据线将 所拍摄图像传输到电脑上，也可将相机的存储 卡取出，通过读卡器将图像数据传输到电脑上。
CCD 的三层结构：上：增光镜片、中：色块网格 下： 感应线路
由微型镜头、马赛克分色网格，及垫于最底层的电子 线路矩阵所组成
5.摄影操作： 胶片相机：p69-74(生物教研室，李相伟） 数码相机：p74-75(同上） CCD图像采集：（病理教研室，姚海涛 实验中心，刘君星）
二、缩时显微摄影术
2.LSCM的主要组成部分及工作原理 ①激光光源:氢离子激光,能同时 / 顺序 / 分别输出紫 外光和可见光
②照明针孔:使激光通过照明针孔后形成点光源, 点光源具有方向性强,发散小、亮度高等优点 ③光束分离器：可将样品经点光源照射所激发的 荧光与其它非信号光线分开，排除非信号光线 干扰，提高分辨率和清晰度。 ④物镜 ⑤焦平面：激光点光源照射标本样品，激发样品 发射荧光，形成焦点光斑，在焦平面处聚焦成 像。
CCD工作方式之一： 当数字相机的快门开启，来自影像的光线 穿过这些马赛克，色块会让感光点的二氧化硅 材料释放电子（负电）与电洞（正电）。经由 外部加入电压，这些电子和电洞会被转移到另 一硅区暂存起来。电子数的多寡和曝光过程光 点所接受的光量成正比。
CCD IMAGE SENSOR外形
彩色CCD的组成结构分图
四、激光扫描共聚焦显微镜技术（实验中心）
1.概念和原理 P76
laster scanning confocal microscope LSCM 激光共聚焦显微镜是20世纪80年代以来发展起来的 一项细胞生物学和高分子材料科学领域的高科技分 析仪器。
其在传统光学显微镜基础上，利用激光作 为光源，经照明针孔可形成点光源照射荧光样品， 所产生的激发光斑被探测器针孔以共轭的形式接收 于同一焦平面上，可通过计算机控制显微镜移动， 以实现在同一焦平面（x-y)上的逐点扫描。计算机 以像点的方式在计算机屏幕上形成图像。 同时，也可沿z轴方向逐渐改变焦平面，完 成对样品厚片不同层面的扫描，进行类似CT断 层扫描的无损伤连续光学切片，经计算机三维重 建处理，可形成观察标本的三维结构图形。
适用：记录细胞或细胞器连续动态变化过程 正常时态连续拍照 缩时逐格拍照 主要装备：倒置显微镜，16mm摄影机，自控 缩时启动拍摄装置。 原理：缩时间隔时间：目标物实际活动时间 X 1/24
影片排成后要求放镜时间
=3600秒 ／10秒
x 1／24=15秒
所以，每隔15秒摄取1张照片。
三、光镜下的固定细胞观察法（组胚，病理）
第三章
细胞形态结构观察技术
一、活体细胞的观察和摄影技术
1.倒置显微镜：P60图3-3（提问光镜使用注意） 适用：观察贴壁生长的培养中细胞 构造特点：因物镜置于观察标本下方而得名 技巧：调弱光亮度，集光器稍远些， 增大光线反差，对正光轴； 摄影时，使观察物稍偏远离焦点，照片 会更清晰。 底片选用正片，反差大
3.荧光显微镜 P67图3-6 适用：观察细胞内天然的荧光物质，如维生 素、脂褐素、核黄素等，也可观察可与 荧光染料结合的细胞组分。 构造特点：与普通光镜比，区别在于用高压汞灯光 源，波长可激发荧光物质产生荧光；滤光片不同。 技巧：观察必须是自发荧光或经荧光染色的标本； 选用效果最好的滤光片；荧光标本易褪色，不能长 期保存，观察操作要迅速，作好记录；仪器的高压 汞灯光源启动后15分钟内不得关闭，关闭后，灯冷 却后方可再起动，否则寿命大减，长时间观察标本 时，需带护目镜。
4.CCD图像传感器： CCD(charge copled device,感光耦合组件， 类似动物眼睛视网膜。 CCD的组成结构：可分成三部分 上层，聚光镜片（增光镜片） 中层，一个类似马赛克的网络（分色网络） 下层，一层电子线路矩阵（感应线路，是 可记录光线变化的半导体）
固定
（固定剂，染色剂知识介绍） 固定剂的作用：穿透，固定，保形，防腐 固定剂的选择：P83
细胞内组分的差异染色。 染色剂的选择： Giemsa—染色体桃红色。 本书P84 Feulgen—DNA紫红色，细胞质绿色。鄂P141 吖啶橙—RNA红色，DNA亮绿色。本书P86 苏木精-伊红（HE)—细胞核蓝色，细胞质红色 本书P85 过碘酸席夫—细胞内含糖原区—紫红色。章P58 苏丹红III—细胞内含脂肪区—橘红色。章P59 鬼笔环肽—溦丝染色。章P59 免疫荧光法—溦管染色。章P60 联苯胺+H2O2—过氧化氢体染色。小章P37 詹纳斯绿B—活体细胞线粒体。小章P43
4.暗视野显微镜 P64图3-5 适用：观察记录活细胞或细胞器的运动轨迹， 提高分辨率 构造特点：只有聚光器不同于普通显微镜，设 有一个中央遮光板使照明光线不能直射。 标本进入目镜，只许标本散射光进入目 镜 技巧：物镜的数值孔径必小于聚光器的数值孔 径；盖玻片，载玻片应清洁无痕；聚光 镜和载玻片之间加香柏油，保证效果。
2.相差显微镜 P62图3-4 适用：可增强活细胞同背底反差，帮助看清 细胞的轮廓和细胞内细微结构，如： 核仁、染色质、线粒体等。 构造特点：有两个附加构件： 相差接物镜：其光学系统中有一个光环透镜 相差聚光器：内有数个相位板，使用时与物 镜倍数一致 技巧：细胞培养瓶质地均匀透明较好，最好用塑 料瓶；观察摄影时，瓶壁要擦净；光轴对 正，照明度适宜，摸索试调至最佳
=。显微摄影术p68
1.概念：显微摄影术是利用显微摄影装置拍摄 显微镜视野中的物象的技术。 2.技术类型： 胶卷相机摄像 （感光底片） 数码相机摄像 （电子数码设备） CCD图像采集 （同上） 三者前期操作一致，ຫໍສະໝຸດ Baidu期图像存储形式不 同。
3.感光原理： 1）胶片相机：显微摄影时，光线自标本片的 微小物件射入物镜后，造成一个倒立的放大实 像，经目镜进一步放大后，投射在底片上，使 底片感光而记录下显微镜视野中的物象。 2）数码相机与CCD图像采集原理相同，是以 数字形式用电子设备储存图像，通过数据线将 所拍摄图像传输到电脑上，也可将相机的存储 卡取出，通过读卡器将图像数据传输到电脑上。
CCD 的三层结构：上：增光镜片、中：色块网格 下： 感应线路
由微型镜头、马赛克分色网格，及垫于最底层的电子 线路矩阵所组成
5.摄影操作： 胶片相机：p69-74(生物教研室，李相伟） 数码相机：p74-75(同上） CCD图像采集：（病理教研室，姚海涛 实验中心，刘君星）
二、缩时显微摄影术
2.LSCM的主要组成部分及工作原理 ①激光光源:氢离子激光,能同时 / 顺序 / 分别输出紫 外光和可见光
②照明针孔:使激光通过照明针孔后形成点光源, 点光源具有方向性强,发散小、亮度高等优点 ③光束分离器：可将样品经点光源照射所激发的 荧光与其它非信号光线分开，排除非信号光线 干扰，提高分辨率和清晰度。 ④物镜 ⑤焦平面：激光点光源照射标本样品，激发样品 发射荧光，形成焦点光斑，在焦平面处聚焦成 像。
CCD工作方式之一： 当数字相机的快门开启，来自影像的光线 穿过这些马赛克，色块会让感光点的二氧化硅 材料释放电子（负电）与电洞（正电）。经由 外部加入电压，这些电子和电洞会被转移到另 一硅区暂存起来。电子数的多寡和曝光过程光 点所接受的光量成正比。
CCD IMAGE SENSOR外形
彩色CCD的组成结构分图
四、激光扫描共聚焦显微镜技术（实验中心）
1.概念和原理 P76
laster scanning confocal microscope LSCM 激光共聚焦显微镜是20世纪80年代以来发展起来的 一项细胞生物学和高分子材料科学领域的高科技分 析仪器。
其在传统光学显微镜基础上，利用激光作 为光源，经照明针孔可形成点光源照射荧光样品， 所产生的激发光斑被探测器针孔以共轭的形式接收 于同一焦平面上，可通过计算机控制显微镜移动， 以实现在同一焦平面（x-y)上的逐点扫描。计算机 以像点的方式在计算机屏幕上形成图像。 同时，也可沿z轴方向逐渐改变焦平面，完 成对样品厚片不同层面的扫描，进行类似CT断 层扫描的无损伤连续光学切片，经计算机三维重 建处理，可形成观察标本的三维结构图形。
适用：记录细胞或细胞器连续动态变化过程 正常时态连续拍照 缩时逐格拍照 主要装备：倒置显微镜，16mm摄影机，自控 缩时启动拍摄装置。 原理：缩时间隔时间：目标物实际活动时间 X 1/24
影片排成后要求放镜时间
=3600秒 ／10秒
x 1／24=15秒
所以，每隔15秒摄取1张照片。
三、光镜下的固定细胞观察法（组胚，病理）
第三章
细胞形态结构观察技术
一、活体细胞的观察和摄影技术
1.倒置显微镜：P60图3-3（提问光镜使用注意） 适用：观察贴壁生长的培养中细胞 构造特点：因物镜置于观察标本下方而得名 技巧：调弱光亮度，集光器稍远些， 增大光线反差，对正光轴； 摄影时，使观察物稍偏远离焦点，照片 会更清晰。 底片选用正片，反差大
3.荧光显微镜 P67图3-6 适用：观察细胞内天然的荧光物质，如维生 素、脂褐素、核黄素等，也可观察可与 荧光染料结合的细胞组分。 构造特点：与普通光镜比，区别在于用高压汞灯光 源，波长可激发荧光物质产生荧光；滤光片不同。 技巧：观察必须是自发荧光或经荧光染色的标本； 选用效果最好的滤光片；荧光标本易褪色，不能长 期保存，观察操作要迅速，作好记录；仪器的高压 汞灯光源启动后15分钟内不得关闭，关闭后，灯冷 却后方可再起动，否则寿命大减，长时间观察标本 时，需带护目镜。
4.CCD图像传感器： CCD(charge copled device,感光耦合组件， 类似动物眼睛视网膜。 CCD的组成结构：可分成三部分 上层，聚光镜片（增光镜片） 中层，一个类似马赛克的网络（分色网络） 下层，一层电子线路矩阵（感应线路，是 可记录光线变化的半导体）