重组体分子的选择与鉴定方法及鉴定

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重组体分子的选择与鉴定方法及鉴定

电泳后的图谱
挑三个菌落鉴定，图显示的是三个菌落中的质粒双酶切的结果
依赖于重组子结构特征分析的筛选方法三 PCR方法筛选鉴定重组子
• 基本原理： • 在载体DNA分子中，外源DNA插入位点两侧的序列多为已知，通过与插入位点两侧已知序列互补的引物，从单克隆中提取少量质粒DNA作为模板进行PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳分析确定是否为重组子。
抗药性标记法示意图
b类插入失活筛选
• 从原理上讲，当外源基因(或DNA片段)插入到某一基因内的位点后, 使这个基因丧失了原有的功能叫插入失活 (insertional inactivation) 。插入失活法是从不同的重组 DNA分子获得的转化子中鉴定出含有目的基因的转化子（筛选）的主要方法。
常用的抗药性选择标记
抗药性氨苄青霉素（Amp）溶解剂虑过除菌是贮存温度贮存浓度终浓度
水
-20℃
50mg/ml
50~100µ g/ml
氯霉素（Cm）卡那霉素（Ka或Kan）
四环素（Tet 或Tc）链霉素（Sm 或Str）
乙醇
否
-20℃
34mg/ml
20~17交液中，在60℃下放置6h；把同位素标记的DNA探针于100℃变性后加入杂交溶液中，然后放入滤膜，60℃杂交16－24h。探针的用量一般为105 －106cpm/ml。用2×SSC洗脱3次，每次30min。 • 7 放射自显影：将洗好的滤膜用吸水纸吸干，夹于两层保鲜膜中，在暗室内放进暗盒，放好X线片，并于X线片上作好标记，置于－70℃冰箱暴光48－72h。 • 8 洗片：在暗室内取出X线片，进行显影和定影，分析杂交结果。
RNA水平
蛋白质水平
免疫化学检测法（放射性抗体检测法、免疫沉淀检测法） Westhern印迹杂交法

何水林版基因工程第五章基因的转移与重组体的筛选和鉴定

带酶切位点的PCR产物 5’- GCAGAATTC
PCR产物 PCR产物
GGATCCGCG CCTAGGCGC BamH I位点
-3’
-5’
3’- CGTCTTAAG
EcoR I位点
EcoR I BamH I 5’AATTC 3’- G PCR产物 PCR产物 G -3’ CCTAG -5’
两头各有一个粘性末端！
4. DEAE-葡萄糖转染法二乙氨乙基（DEAE）葡聚糖为多聚阳离子试剂，能促进哺乳动物细胞摄入外源DNA。
葡聚糖
++ ++++++ ++ + + + 二乙氨乙基 + + （DEAE） ++ ++ ++++
++ ++++++ ++ + + + 二乙氨乙基 + + （DEAE） ++ ++ ++++ - - - -- - DNA - - --- -
4、在培养基中生长数小时之后，球形细胞复原并增殖。
操作步骤： 10ng 载体DNA 100L 感受态细胞 10-100L转化液涂Amp＋平板
（p140）
吸附DNA 冰浴30min
摄入DNA 42℃ 1~2min
37℃ 振荡培养1h
加入1mL LB培养基（Amp-）
转化率：106-108/g DNA
（一）转化率的计算：
转化率＝产生菌落的总数 / DNA的加入量

重组子筛选与鉴定

即重组子只能在Ap板上形成菌落，而不能在Tc板上形成菌落，而非重组子在这两种平板上都能形成菌落，比较两种平板上对应的转化子的生长状况，即可Ap板上挑出重组子。
（3）插入表达筛选法——利用目的基因插入载体后能激活标记基因而筛选
与（2）法相反，该法是利用外源目的基因插入特定载体后能激活筛选标记基因的表达，由此进行转化子的筛选。
蓝－白筛选示意图
蓝-白筛选
利用蓝色化合物的形成作为指示剂，筛选带重组质粒的细菌。
载体：编码β-半乳糖苷酶N端序列
（IPTG 存在下）
宿主：编码β-半乳糖苷酶C端序列
α-互补
细菌表达： β-半乳糖苷酶活性↑
5-溴-4-氯-3-吲哚（ X-gal） → 形成蓝色菌落
当在质粒中插入外源DNA→β-半乳糖苷酶的N端基因失活→
Luc基因在植物细胞内正常表达，可用于监测各种启动子活性，测定与Luc基因嵌合的目的基因的表达情况，也用于调控序列和基因的组织特异性表达。
③ 荧光素酶（LUC）基因
特点：迅速，灵敏，成本低，不存在放射性同位素对人体健康和环境生态危害，也无内源荧光产生的背景干扰，故Luc是一种理想的报告基因。
① β-葡萄糖酸苷酶（Gus）基因
Gus基因最早是从E.coli 12中克隆出来的，能编码稳定的 Gus产物。与抗生素抗性基因不同的是Gus基因并非正选择标记。
作为报告基因的重要依据：作为一种水解酶，转化植物细胞所产生的β-葡萄糖酸苷酶，能够催化某些特殊反应的进行，通过荧光、分光光度和组织化学的方法对这些特殊反应产物的检测，即可确定gus报告基因的表达情况，从而区分是否是转化子。
②二氢叶酸还原酶(DHFR)基因
DHFR催化二氢叶酸还原成四氢叶酸，dhfr突变体细胞不能够合成四氢叶酸，阻断了正常核酸代谢途径，故不能在常规培养基上生长。

基因工程重组体克隆的筛选和鉴定

基因功能的正向遗传筛选技术
突变体库的构建
通过化学诱变、同源重组等技术构建大规模突变体库。
表型筛选
通过特定表型筛选出具有特定功能的突变体。
突变基因的鉴定
通过测序等技术鉴定出突变基因，并研究其功能。
05
克隆基因的应用前景
克隆基因在医学上的应用
疾病诊断与治疗
利用克隆技术获取特定基因，可用于疾病诊断、药物研发和个性化治疗。
基因敲入
将特定基因敲入生物体基因组，观察生物体表型变化，以确定该基因的功能。
基因表达干扰
通过转录因子或RNAi技术干扰特定基因的表达，观察生物体表型变化，以确定该基因的功能。
正向遗传筛选
通过突变体库筛选具有特定表型的突变体，鉴定突变基因，以研究该基因的功能。
基因敲除和敲入技术
基因敲除技术
基于测序的筛选
对转化子进行全基因组测序或目的基因片段测序，与已知序列进行比对，判断是否含有目的基因。
蓝白筛选法
原理
步骤
利用载体上标记基因的表达产物对转化子进行筛选，通过菌落颜色的变化判断是否含有目的基因。
将转化子涂布在含有抗生素的培养基上，培养后观察菌落颜色变化，蓝色菌落为阳性克隆，白色菌落为阴性克隆。
基因表达的蛋白质印迹分析
原理
利用特异性抗体检测样品中特定蛋白质的表达情况，通过显色反应或荧光信号对蛋白质进行定性或定量分析。
用等方面的研究。
04
克隆基因的功能研究
基因功能研究的方法
基因敲除
通过基因工程技术将特定基因敲除，观察生物体表型变化，以确定该基因的功能。
Northern印迹杂交
原理
基于RNA的电泳分离和转移，将RNA 片段与标记的探针进行杂交，以检测特异的RNA转录本。

转化子的筛选和重组子的鉴定

转化子的筛选和重组子的鉴定在重组DNA分子的转化、转染或转导过程中，并非所有的受体细胞都能被导入重组DNA 分子，一般仅有少数重组DNA分子能进入受体细胞。

再者，在这些被转化的受体细胞中，除部分含有我们期待的DNA分子外，另外一些还可能是由于载体自身或一个载体与多个外源DNA片段形成的非期待重组DNA分子导入所致。

因此，需要采取必要的方法将重组子从大量的受体细胞中筛选出来。

一、基本定义：1、转化子：导入外源DNA分子后能稳定存在的受体细胞称为转化子。

2、重组子：含有重组DNA分子的转化子称为重组子。

3、阳性克隆子（期望重组子）：含有外源目的基因的重组子称为阳性克隆子或期望重组子。

4、筛选（选择）：经过各种方法将外源DNA分子导入受体细胞后，获得所需阳性克隆子的过程称为克隆子的筛选或选择。

二、将目的基因克隆到大肠杆菌细胞中的操作步骤：1．获得目的基因和质粒载体；2．形成重组质粒；3．制备感受态细胞，用重组质粒转化大肠杆菌细胞；4．培养大肠杆菌，让重组质粒及外源目的基因形成大量拷贝；5三、转化子的筛选1、根据载体标记基因筛选转化子。

（1）方法：将转化处理后的受体细胞接种在含适量选择药物的培养基上，在最适生长温度条件下培养一段时间，根据菌落生长情况挑选出转化子。

（2）举例：抗药性标记插入失活选择法、根据载体除草剂抗性基因、β-半乳糖苷酶显色反应选择法、根据生长调节剂非依赖型筛选转化子、根据核苷酸合成代谢相关酶基因的缺失互补筛选。

2、根据报告基因筛选转化子。

（1）报告基因的定义：一个编码可被检测的蛋白质或酶的基因，即表达产物易被鉴定的基因。

由于受体细胞内报告基因的表达，出现新的遗传性状，以此来识别被转化的细胞或未被转化的细胞。

（2）成为报告基因的条件：报告基因的表达产物应是便于检测、定量和灵敏毒高的基因。

如：gus葡醛糖酸酶基因、Lus荧光虫荧光素酶基因、Gfp绿色荧光蛋白基因。

3、根据形成噬菌斑筛选转化子。

基因工程第七章重组子的筛选和鉴定

等。常见的污染来源包括实验室环境、加样器、操作中形成的喷雾、试剂及任何与扩增产物接触的东西。
菌落PCR出现假阴性避免将琼脂培养基挑到PCR管中及其他原因:
酶失活；引物质量不好（设计、合成、保存）；物理原因（变性、退火的温度、时间）。
一般重组子克隆的PCR反应条带比较亮且宽, 形状较规则,而假阳性和假阴性的PCR条带，多数不太亮,条带细而且不规则，有时拖尾。
4、Broome-Gilbert双位点检测法可用于检测融合蛋白。既检测外源基因产物又检测载体基因产物。质粒基因A 插入基因B
重组质粒
表达融合蛋白质粒蛋白A 外源蛋白B
固相支持滤膜
抗A抗体质粒蛋白A 外源蛋白B
固相支持滤膜
125I标记的抗A抗体质粒蛋白A 外源蛋白B 抗B抗体
发光，底片曝光
硝酸银：灵敏度高、可检出2-5ng/带。
② 转到膜上进行染色。
直接染色电泳结果
2、Western blotting
（1）Western（转膜）电泳胶里的蛋白质带可以用电转的方法，转到膜上（硝酸纤维素膜、中性尼龙膜等）。
胶里的蛋白质带在电场的作用下横向转移到正
94℃ 10min
94℃ 5min
94℃ 40s 62℃ 30s 72℃ 90s 25～30 cycle
94℃ 40s 58℃ 30s 72℃ 90s 35～40 cycle
72℃ 7min 4℃ for ever
72℃ 7min 4℃ for ever
预变性时间延长为10 min, 使得细菌能够充分破裂，DNA 大量释放并充分变性。
菌落），用无菌牙签挑选单菌落，将菌落转至 PCR管中（牙签在无菌水中洗一下），然后将牙签点在LB（+Amp）平板，记录号码。在PCR管中加其他成分（最后加酶）设定PCR程序，开始PCR。电泳检测。 LB平板过夜培养，选取正确的菌落。

基因工程简答题总结

基因工程原理复习题思考题5、简单叙述同尾酶和同裂酶的差别。

同尾酶：来源不同，识别的序列不同，但能切出相同的粘性末端，连接后不能被相关的酶同时切割。

同裂酶：识别序列相同，切割位点有些相同，有些不同。

分完全同裂酶和不完全同裂酶（PS：完全同裂酶：识别位点和切点完全相同。

不完全同裂酶：识别位点相同，但切点不同。

）6、连接酶主要有哪些类型？有何异同点？影响连接酶连接效果的因素主要有哪些？类型：DNA连接酶和RNA连接酶异同点：相同点：都能以DNA为模板，从5'向3'进行核苷酸或脱氧核苷酸的聚合反应。

不同点：DNA聚合酶识别脱氧核糖核苷酸，在DNA复制中起作用；而RNA聚合酶聚合的是核糖核苷酸，在转录中起作用。

7、试分析提高平端DNA连接效率的可能方法。

（传说中的网上答案）1、低温下长时间的连接效率比室温下短时间连接的好。

2、在体系中加一点切载体的酶，只要连接后原来的酶切位点消失。

这样可避免载体自连，应该可以大大提高平端连接的效率。

3、足够多的载体和插入片段是最重要的。

4、平端的连接对于离子浓度很敏感5、尽可能缩小连接反应的体积6、建议放在四度冰箱连接两天效率更高比14度好8、基因工程中常用的DNA聚合酶主要有哪些？1）大肠杆菌DNA聚合酶2）Klenow fragment3）T7 DNA聚合酶4）T4 DNA聚合酶5）修饰过的T7 DNA聚合酶6）逆转录酶7）Taq DNA聚合酶第四章基因克隆的载体系统1、作为基因工程载体，其应具备哪些条件？具有针对受体细胞的亲缘性或亲和性（可转移性）；具有合适的筛选标记；具有较高的外源DNA的载装能力；具有多克隆位点（MCS）；具有与特定受体细胞相适应的复制位点或整合位点。

3、载体的类型主要有哪些？在基因工程操作中如何选择载体？基因工程中常用的载体(vector)主要包括质粒(plasmid)、噬菌体(phage)和病毒(virus)三大类。

这些载体均需经人工构建，除去致病基因，并赋予一些新的功能，如有利于进行筛选的标志基因、单一的限制酶切点等。

基因工程第七章重组子的筛选和鉴定

1、抗体与产物的结合方式根据第一抗体（一抗）和第二抗体（二抗）的性质可分为几种作用方式：
固相支持滤膜
一抗
待测基因产物蛋白
125I标记的二抗
固相支持滤膜
一抗
待测基因产物蛋白
二抗
125I 标记的二抗结合蛋白
固相支持滤膜
待测基因产物蛋白
一抗 125I标记的二抗
固相支持滤膜
待测基因产物蛋白
二抗上连着一种酶（辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、过氧化物酶、脲酶等）。
（4）显色反应
加入无色的底物，被二抗上所带的酶催化反应转变成有色物质（或发光）。
（5）比色
在特殊的分光光度仪（酶标仪）上比色，打印出结果。
3、ELISA的局限性有效，但敏感性、特异性稍差（主要取决于一抗的特异性）。必须与其他方法一起综合考虑。
将外源DNA片段插在EcoRI
位点，则：非重组子呈Ampr、Tetr 重组子呈Ampr、Tetr
Apr
将外源DNA片段插在BamHI 位点，则：
非重组子呈Ampr、Tetr 重组子呈Ampr、Tets
（二）、显色筛选法
1、基本原理
显色筛选法可以区分转化子与非转化子，也可区分重组子与非重组子。其原理是：载体分子上携带某种显色酶基因，其表达产物能使细胞产生颜色反应，从而易于辨认和挑选，如大肠杆菌质粒pUC18携带的lacZ’基因（蓝色反应）、链霉菌质粒pIJ702携带的melC基因（黑色反应）等。
离质粒DNA并对其进行电泳，带有外源基因的重组DNA分子的迁移率要低于无外源基因的质粒分子。 2、操作：
将含有质粒的单重菌落细胞破碎，提取其质粒 D断N含A有，插用入分琼序子脂列量糖的凝重胶组组克电质泳粒，空。观载察体其电泳图谱，判

重组克隆的筛选与鉴定

4、选择得过程
(1)四环素抗性插入失活
如果在Tetr上插入外源DNA,导致四环素抗性基因失活,可用四环素﹢环丝氨酸得平板,选择重组克隆。
Tetr插入失活得细菌,其生长可被四环素抑制,不被环丝氨酸杀死,保留下来;
Tetr不失活得细菌,能抗四环素,正常生长, 但可被环丝氨酸杀死。
图四环素抗性插入失活
二、利用抗生素抗性基因:pBR322
以pBR322为例,说明利用抗生素抗性基因得插入失活得原理。
1、原理
在pBR322上有多个单一得限制酶位点,如 BamH I位点,恰好在一个四环素抗性基因内。如果有外源DNA插入BamH I位点,那么涉及四环素抗性得基因就损坏,因此,带有重组 pBR322质粒得细胞,仍对氨苄青霉素有抗性, 但对四环素得抗性消失(敏感)。
pUC18/19得结构图
氨苄青霉素抗性基因 Lac Z基因:编码-半乳糖苷酶得部分肽
段。 Lac Z上有插入外源DNA得MCS位点。
4、筛选得方法:蓝白斑法
利用蓝白斑法筛选pUC8/9重组子,就是一种直接检测-半乳糖苷酶活性得方法。
①先将转化子涂于含有氨苄青霉素得培养基,能合成-半乳糖苷酶。
该技术已广泛应用于基因得表达、基因定位、克隆基因得筛选、酶切图谱得制
作、基因组中特定基因序列检测、遗传病疾病得诊断及生物分类等方面。
一、核酸分子杂交得基础
1、变性与退火 DNA以双链形式存在,在进行分子杂交
时,先将双链DNA分子解聚为单链,这一过程称为变性。
两条单链通过碱基互补,聚合成稳定得双链区得过程称为退火或复性。
图表型筛选加酶切筛选
０
A
A
T T
TA AT

重组dna的筛选和鉴定方法

重组dna的筛选和鉴定方法《重组DNA的筛选和鉴定：一场微观世界的“寻宝”之旅》嘿，你知道吗？重组DNA这玩意儿可太神奇了。

就像是在微观世界里搞一场超级特别的“拼接游戏”。

你把不同来源的DNA片段给组合到一块儿，就像搭积木一样，搭出一个全新的DNA组合。

可这搭完了，你怎么知道你搭得对不对呢？这就轮到筛选和鉴定方法上场啦。

我就有一次特别有趣的经历，和找东西有点像。

我有一个超级乱的抽屉，里面啥都有，小珠子、笔芯、还有各种小贴纸啥的。

我想在里面找一颗特定的珠子，那颗珠子是我朋友送我的，上面有个特别小的标记。

这就跟在一堆重组DNA里找我们想要的那个重组体差不多。

咱先说筛选方法哈。

有一种方法叫抗性筛选。

这就好比我在那堆抽屉杂物里，按照有没有某种特殊属性来挑东西。

在重组DNA的世界里呢，科学家会给载体加上抗性基因，就像给我们要找的那个特殊东西贴上一个特别的标签。

比如说，在含有氨苄青霉素的培养基里培养那些接受了重组DNA的细菌。

如果细菌能在这培养基里活下来，那就很有可能是我们想要的重组体啦。

为啥呢？因为这个重组体里带着抗性基因呢，就像那些带着特殊本领（能抵抗氨苄青霉素）的细菌，才能在这个“危险”的环境里生存。

还有一种筛选方法是蓝白斑筛选。

这就更有趣了。

想象一下啊，那些接受了重组DNA的细菌在培养皿里就像一群小居民。

正常情况下，有一种酶叫β - 半乳糖苷酶，它能让一种物质变色。

如果DNA重组成功了，这个酶的基因被破坏了，就不会变色。

就像我抽屉里有些东西，原本是亮闪闪的，要是被破坏了某个部分，就不再亮闪闪了。

在培养皿里，没重组成功的会变成蓝色的菌斑，而重组成功的就是白色的菌斑。

我当时在找那颗珠子的时候，也会根据一些类似的特征来区分东西。

比如说，我知道那颗珠子是不透明的，而其他一些珠子是透明的，我就可以根据这个来缩小寻找的范围。

那鉴定方法呢？PCR（聚合酶链式反应）就是个很厉害的鉴定手段。

这就像是拿着一个超级放大镜，去看那些特别特别小的细节。

第六章重组体的筛选与鉴定

一、根据载体表型特征的筛选（一）抗药性标记插入失活筛选法检测外源DNA插入作用的一种通用方法是插入失活效应。检测外源DNA插入作用的一种通用方法是插入失活效应。 DNA插入作用的一种通用方法是插入失活效应
1.以 1.以pBR322质粒为例质粒为例
（1）pBR322质粒的一般特性质粒的一般特性在pBR322质粒上有两个抗生素基因，Ampr基因内有 pBR322质粒上有两个抗生素基因，质粒上有两个抗生素基因一个PstⅠ限制性核酸内切酶的唯一识别位点， PstⅠ限制性核酸内切酶的唯一识别位点一个PstⅠ限制性核酸内切酶的唯一识别位点，Tetr基因内有BamHⅠ和SalⅠ两种限制性核酸内切酶单一识别因内有BamHⅠ和SalⅠ两种限制性核酸内切酶单一识别 BamHⅠ 两种限制性核酸内切酶单一位点。位点。
如下图所示
一、根据载体表特征的筛选（一）抗药性标记插入失活筛选法
Ampr pBR322 Tetr AmprTetr
菌落原位影印
pBR322
+
pBR322
AmprTets
Amp琼脂平板琼脂平板
Tet琼脂平板琼脂平板
图应用抗生素抗性基因插入失活筛选重组体
一、根据载体表特征的筛选（二）β-半乳糖苷酶显色反应筛选法 1.乳糖操纵子的结构 1.乳糖操纵子的结构
二、根据插入基因遗传性状的筛选 (一)原理重组体DNA分子转化到大肠杆菌受体细胞后, DNA分子转化到大肠杆菌受体细胞后重组体DNA分子转化到大肠杆菌受体细胞后,如果插入在载体分子上的外源基因能够实现其功能性的表插入在载体分子上的外源基因能够实现其功能性的表达,而且表达的产物能与大肠杆菌菌株的营养缺陷突变形成互补,那么就可以利用营养突变株进行筛选. 形成互补,那么就可以利用营养突变株进行筛选. 互补 (二)举例当外源目的基因为合成亮氨酸的基因时当外源目的基因为合成亮氨酸的基因时,将该基因亮氨酸的基因重组后转入缺少亮氨酸合成酶基因的菌株中,在仅仅缺缺少亮氨酸合成酶基因的菌株中重组后转入缺少亮氨酸合成酶基因的菌株中,在仅仅缺亮氨酸的基本培养基上筛选,只有能利用能利用表达产物亮少亮氨酸的基本培养基上筛选,只有能利用表达产物亮氨酸的细菌才能生长因此,获得的转化子都是重组子生长, 转化子都是重组子. 氨酸的细菌才能生长,因此,获得的转化子都是重组子.

8第八章重组体的筛选ppt课件

④结果单抗blotting 结果
多克隆抗体 Blotting的结果
五、DNaseⅠ足迹实验〔footprinting assay）
检测与特定蛋白质结合的DNA序列的部位及特性
优点：可形象地展示出特殊的蛋白质因子同特定DNA片段之间的结合区域
1
10
(a)
32p
*
1 10
(b) *
(c)
1. 抗体与产物的结合方式根据第一抗体〔一抗〕和第二抗体〔二抗〕的性质可分为几种作用方式：
固相支持滤膜
一抗
待测基因产物蛋白
125I标记的二抗
固相支持滤膜
一抗
待测基因产物蛋白
二抗
125I 标记的二抗结合蛋白
固相支持滤膜
待测基因产物蛋白
一抗
125I标记的二抗
固相支持滤膜
待测基因产物蛋白
重组子的筛选直接筛选间接筛选dna鉴定载体筛选翻译产物转录产物其他方法报告基因等northernblottingwesternblotting标记补救筛选质粒载体的互补筛选蓝白色斑筛选法噬菌体包装容量的正性筛选质粒载体的抗性标记筛选同源性分析鉴定原位杂交dna序列分析重组子酶切图谱鉴定重组子大小鉴定一遗传学检测法1根据载体表型特征的筛选1抗药性标记插入失活筛选法第一节核酸分子的遗传学与物理检测法半乳糖苷酶显色反应筛选法蓝蓝白白落落蓝白菌落蓝白菌落筛选白色菌落2根据插入基因遗传性状的筛选重组体dna分子转化到大肠杆菌受体细胞之后如果插入在载体分子上的外源基因能够实现其功能性的表达而且表达的产物能与大肠杆菌菌株的营养缺陷突变形成互补那么就可以利用营养突变株进行筛选
4、直接凝胶电泳检测法
利用有插入片段的重组载体的分子量比野生型载体分子量大。

重组子鉴定的方法

重组子鉴定的方法重组子鉴定（Restriction Fragment Length Polymorphism，简称RFLP）是一种用于确定DNA分子的特定区域中是否存在多态性的方法。

该方法基于DNA 序列中存在的限制性内切酶切位点差异，通过对DNA片段进行限制性内切酶切割并进行凝胶电泳分离，最终得到一系列特定长度的DNA片段模式。

重组子鉴定的基本步骤如下：1. DNA提取：从待测样本（如血液、口腔黏膜等）中提取总DNA。

2. DNA限制性内切酶切割：选择适当的限制性内切酶，将DNA样本切割成多个片段。

限制性内切酶通常会识别并切割具有特定序列的DNA片段。

切割位点的选择非常重要，因为它决定了所产生的DNA片段的长度差异。

3. 凝胶电泳分离：将切割后的DNA片段加入到凝胶中进行电泳分离。

电泳过程中，DNA片段会根据其大小在凝胶上移动，从而形成不同的DNA片段模式。

通过与分子量标尺进行比较，可以确定电泳图谱上的每个片段的大小。

4. 转移和杂交：将凝胶中分离出的DNA片段转移到一个固体支持物（如尼龙膜）上，然后进行杂交。

杂交是将具有已知序列的DNA探针与待测样本中的DNA 片段进行结合的过程。

探针是通过特殊标记的DNA片段，可以与待测样本中的特定片段互补结合。

通过杂交过程，可以确定某个特定的DNA片段是否存在于待测样本中。

5. 清洗和检测：将未与待测样本中的DNA结合的探针洗去，并采用合适的检测方法检测探针与待测样本中的DNA结合情况。

常用的检测方法包括放射性标记、荧光标记和酶标记等。

重组子鉴定的优点在于其较高的分辨率和多态性。

然而，该方法在实践中也存在一些限制因素。

其中包括限制性内切酶的选择性受限、需大量DNA样本和耗时等。

此外，在进行杂交过程中，还需要具备足够的探针密度和适当的杂交条件，以确保准确性和可靠性。

最近，随着分子生物学和遗传学领域的发展，重组子鉴定已经逐渐被其他更高效、更灵敏的技术所取代。

基因工程-第8章-重组子的筛选与鉴定

2、根据插入序列的表型特征选择重
组体分子的直接选择法
转化进来的外源DNA编码的基因，能够对大肠杆菌寄主菌株所具有的突变体发生体内抑制或互补效应，从而使被转化的寄主细胞表现出外源基因编码的表型特征。
Example:
λ gt.λ B噬菌体（由于C片断的缺失而造成重组缺陷的λ red－噬菌体），在大肠杆菌lig ts菌株上生长不能形成噬菌斑，在有连接酶功能的大肠杆菌lig＋菌株上形成噬菌斑。将具有连接酶基因的重组体噬菌体λ gt. λ B，涂布在大肠杆菌lig ts菌株上时，通过寄主细胞的互补作用，能够形成噬菌斑。根据形成噬菌斑这种表型特征，直接选择具野生功能的重组体噬菌体。
缺点：不单要求克隆的DNA片断必须大到足以包含一个完整的基因，而且还要求所编码的基因能够在大肠杆菌中实现功能表达。（对于真核基因很难达到要求）
二、物理检测法
1、凝胶电泳检测法从宿主细胞中提取重组子分子，利用凝胶电泳的方法，鉴定外源片断是否插入及其长度。优点：简便、快速。缺点：只能提供克隆片段大小的信息。
抗药性标记插入失活
Amp r
1)限制酶切 2)DNA重组无DNA插入
Tc
有DNA插入
Amp r
Tcr
转化
Amp r Tc s
外源DNA
Amp r பைடு நூலகம்cr
无菌落筛选重组子阳性菌落
Amp r Tc s
提取DNA 电泳
筛选重组子的示意图
Amp r Tc s
重组DNA
（2）β-半乳糖苷酶显色反应选择法
外源DNA 有DNA插入
Apr
转化
Ap r
Ap r
筛选重组子白色菌落

重组体的筛选和鉴定

二、利用插入序列提供的表型特征筛选
利用插入的外源基因的表达产物特性进行直接选择。（只在特定条件下）。一、原理： 1.弥补缺陷转化进来的外源基因产物能够弥补受体菌株的突变型缺陷。受体菌： his外源基因： his+
在不含组氨酸的培养基中生长
2. 增加新性状使被转化的受体菌表现出外源基因的表型。
GFP 老鼠
GFP- Kac的狗
GFP Alba 發青綠光芒的兔子

①新霉素磷酸转移酶基因（NPTⅡ）抗新霉素、卡那霉素、庆大霉素和G418等抗生素，成为筛选动植物转化子的选择标记基因。 ②潮霉素磷酸转移酶基因（HPT）赋予转化子能抗潮霉素，作为选择标记基因主要用于筛选动植物转化子。潮霉素是致癌物质，操作时应慎重。 ③氯霉素乙酰转移酶基因（CAT）也被用于筛选动植物转化子的标记基因。
PstI酶切
外源DNA 黏性末端连接酶 PstI酶切
pBR322 4363
重组子(ampstetr) 空载体(amprtetr) 插入子(ampstets)
导入
黏性末端
重组子转化子(ampstetr) 空载体转化子(amprtetr)
影印在含Ap的平板上
涂布在含Tc的平板上
野生型的E.coli (ampstets)
缺点：需要电镜！
2. Northern blotting
用DNA（或RNA）探针检测RNA样品。主要检测插入片断是否被转录。从宿主细胞中提取RNA，再用探针杂交。
Northern Blotting
Western Blotting
Southern和Western印迹法
32P-labled

重组子的筛选与鉴定

丝氨酸杀死。
一、遗传学检测法
无环丝氨酸培养基
一、遗传学检测法
(一)载体表型选择法 1.抗药性标记及其插入失活选择法 pBR322 选择过程（2）氨苄青霉素抗性插入失活选择过程
如果Ampr上插入外源DNA，导致氨苄青霉素抗性基
因失活，可用碘-青霉素指示液选择。
一、遗传学检测法
(一)载体表型选择法 2. -半乳糖苷酶显色反应选择法
一、遗传学检测法
(一)载体表型选择法 2. -半乳糖苷酶显色反应选择法（2）选择过程
假阳性：如果插入的外源DNA正好是3的倍数并且没有终止密码子；
（不破坏肽）。
一、遗传学检测法
(一)载体表型选择法 2. -半乳糖苷酶显色反应选择法
-半乳糖苷酶使Xgal分解成兰色产物。
一、遗传学检测法
(二)根据插入基因的遗传性状的选择利用插入的外源基因的表达产物特性进行直接选择。
（只在特定条件下）。 1.原理（1）弥补缺陷转化进来的外源基因产物能够弥补受体菌株的突变型
缺陷。
受体菌： his
-
外源基因： his
+
阳性克隆才能在不含组氨酸的培养基中生长
一、遗传学检测法
(二)根据插入基因的遗传性状的选择 1.原理
（2）增加新性状使被转化的受体菌表现出外源基因的表型。例：小鼠的二轻叶酸还原酶（DHFR）对三甲氧苄二
优点：简便、快速，结果较可靠。
缺点：基因必须表达并具有合适的受体细胞。（一）根据载体表型特征选择重组体分子的直接选择法
1. 抗药性标记插入失活选择法 2. β-半乳糖苷酶显色反应选择法（二）根据插入序列的表型特征选择重组体分子的直接选择法转化进来的外源DNA编码的基因，能够对大肠杆菌寄主菌株所具有的突变体发生体内抑制或互补效应，从而使被转化的寄主细胞表现出外源基因编码的表型特征。

《基因工程》第七章重组子选择筛选与分析

利用这一原理，就可以使用已知序列的单链核酸片段作为探针，去查找各种不同来源的基因组DNA分子中的同源基因或同源序列。
第十八页，共四十四页。
③ 卡那霉素 (kanamycin, Kn或 Kan): 含Kan抗性基因菌体转译一种能修饰Kn的酶，阻碍Kn对核糖体的干扰(gānrǎo)。四环素(tetracymic, Tc或 Tet): 含Tc抗性基因的菌体转译一种能改变细菌膜的蛋白，防止Tc 进入细胞后干扰细菌蛋白质的合成。
⑥ 链霉素(strentomycin, Sm或 Str): 含Str 抗性基因的菌体转译一种能修饰Sm的酶，抑制Sm与核糖体结合。
第三页，共四十四页。
1．根据载体选择标记初步筛选转化子
载体DNA分子上通常携带了一定的选择遗传标记基因，可进行转化子或重组子初步筛选。做法(zuòfǎ)是将转化处理后的菌液（包括对照处理）适量涂布在选择培养基上，在最适生长温度条件下培养一定时间，观察菌落生长情况，即可挑选出转化子。
对于受体细胞而言，通常用LB培养基，在LB 培养基中加入适量的某种选择物，即为选择培养基。选择物是由载体DNA分子上携带的选择标记基因所决定。
3) Immunological screening for expressed genes (Western blotting)
4) Analysis of cloned genes (Restriction mapping, DNA sequencing)
2
第二页，共四十四页。
第一节转基因筛选(shāixuǎn)和选择的方法
（1）抗药性筛选法（2）插入失活筛选法（3）插入表达筛选法
第四页，共四十四页。
（1）抗药性筛选
这是利用载体DNA分子上的抗药性筛选标记进行筛选的方法。主要用于重组质粒DNA分子的转化子筛选。重组质粒DNA分子携带特定的抗药性选择标记基因，在含有相应选择药物的选择培养基上正常生长。 ① 氨苄青霉素（ampicillin，Ap 或Amp）: 含bla基因的菌体能转译 -丙酰胺酶 (-lactarnase)，可降解Ap。 ② 氯霉素 (chloramphenicol, Cm 或 Cmp): 含 cat基因的菌体能转译氯霉素乙酰转酰酶 (chloramphenicol acetyltransferase)，使Cm乙酰化而失效。

重组体的筛选和鉴定

1975年，英国Southern创建
针对DNA的杂交，即将DNA电泳、转印到固相支持物上，用探针进行检测的方法。
原理：将重组菌的基因组或质粒DNA提取出来，经合适的限制
性内切酶酶切后，进行琼脂糖凝胶电泳分离，把定位在凝胶中的DNA碱变性处理，使其双链DNA分开，再将凝胶中变性的 DNA转移到硝酸纤维素膜上，用制备的标记探针与其充分混合，进行同源性DNA杂交。
为Tcr表型．而质粒为Tcs表型。

转化菌涂在Tc平板上，只有含有外源DNA插入片段
的阳性重组子的转化菌能生长成菌落。
16
（3）显色反应筛选：蓝白斑筛选
乳糖 -半乳糖苷酶 X-gal 半乳糖 + 葡萄糖 + 5-溴-4-氯靛蓝 α-互补深蓝色（酶活）
半乳糖
β—半乳糖苷酶
α链（lacZα）：四聚体装配
A
T T
表型筛选加酶切筛选
T A A T
38
二、目的克隆的鉴定
（一）核酸分子杂交(nucleic acid hybridization) 原理

具有一定同源性的两条核酸单链在一定条件下(适宜的温度和离子强度)可按碱基互补的原则退火形成双链.
杂交分子可在DNA和DNA、DNA和RNA、RNA和RNA以及人工合
18

19
20
pUC18/19
5’
lacZ’
EcoRI SacI
EcoRI SacI
KpnI SmalI BamHI XbaI SalI
pUC18
PstI
SphI Hind III
ATGACCATGATTACGAATTCGAGCTCGGTACCCGGGGATCCTCTAGAGTCGACCTGCAGGCATGCAAGCTTGGCACTG

重组dna技术的步骤

重组dna技术的步骤重组DNA技术是一种在实验室中改变生物体遗传信息的方法。

它可以用于研究基因功能、生物制药和农业改良等领域。

下面将介绍重组DNA技术的步骤。

1. DNA提取重组DNA技术的第一步是从目标生物体中提取DNA。

这可以通过不同的方法来实现，例如使用细胞裂解液将细胞壁和细胞膜破坏，释放出DNA分子。

然后，通过离心等技术将DNA分离出来。

2. DNA切割切割DNA是重组DNA技术的关键步骤。

在这一步骤中，使用特定的酶，称为限制性内切酶，来切割DNA分子。

限制性内切酶能够识别特定的DNA序列，并在该序列上切割DNA分子。

通过选择不同的限制性内切酶，可以获得具有不同限制性内切位点的DNA片段。

3. DNA连接在DNA切割之后，需要将不同的DNA片段连接起来。

为了实现这一步骤，使用DNA连接酶将切割得到的DNA片段连接在一起。

DNA连接酶能够识别DNA片段的粘性末端，并在这些末端之间形成磷酸二酯键，将DNA片段连接在一起。

4. DNA转化DNA转化是将重组的DNA导入到宿主细胞中的过程。

这一步骤通常使用细菌作为宿主细胞。

首先，需要将DNA转化宿主细胞的能力引入到细菌中，这可以通过将宿主细胞暴露于高浓度的钙离子溶液中来实现。

然后，将重组的DNA与转化宿主细胞一起处理，使DNA能够进入细菌细胞内。

5. 筛选与鉴定在DNA转化之后，需要对转化的细菌进行筛选与鉴定。

为了实现这一步骤，可以通过选择性培养基，筛选出带有重组DNA的细菌。

此外，还可以使用PCR等方法来检测是否成功插入了目标DNA。

6. DNA复制在筛选与鉴定之后，需要进行DNA复制，以获得足够数量的重组DNA。

这可以通过培养细菌细胞并使其进行快速分裂来实现。

然后，通过离心等技术将细菌细胞分离出来，并提取其中的DNA。

7. 应用与分析重组DNA技术得到的重组DNA可以应用于不同的领域。

例如，在基因功能研究中，可以将重组DNA导入到相关细胞中，观察其对细胞功能的影响。

重组体分子的选择与鉴定方法及鉴定