重组体分子的选择与鉴定方法及鉴定

蓝白斑筛选
X-gal(5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷)，IPTG (异丙基硫代-β-D-半乳糖苷) X-gal被没分解后的产物为5-溴-4-氯-靛蓝
无质粒的 受体菌
b-半乳糖苷酶 部分缺失，不 能分解Xgal； 无抗菌素抗性
不能 正常 生长
无菌斑 生长
质粒转化 的受体菌
b-半乳糖苷酶 的缺失被载体 产物a互补，能 分解Xgal。且 有抗菌素抗性
重组体分子的选择与鉴定方法及原理
重组体分子的选择与鉴定方法
我们把外源基因导入受体细胞的目的是获得带有目的基因 阳性重组体，因而重组体的筛选是体外重组技术的一个 重 要环节。
涂布菌液，观察平板是无法判断重组子是否是我们所需的。 因此，我们需要进一步进行筛选。
常用的筛选方法概括起来有两大类：①直接筛选法；②间 接筛选法。
或Tc）
乙醇
否
-20℃ 12.5mg/ml 12.5µg/ml
（固）
链霉素（Sm
或Str）
水
是
-20℃ 20mg/ml
25µg/ml
A 如果外源基因片段插入载体的位点在抗药性基之外， 不导致抗药性基因的失活，仍能编码抗药性基因产物。 含有这种重组子的转化细胞可以在含有相应抗生素的琼 脂平板上生长成菌落，未能接受载体DNA的细胞因不能 生长而被排除。
间接选择法
遗传学表型筛选的方法之一——抗药性筛选
• 基本原理
• 抗药性筛选主要用于重组质粒DNA分子的转化子的筛选。 因为质粒DNA携带有特定的抗药性选择标记基因，与目的 基因重组后，转入受体菌，能使受体菌带有相应抗药性， 另一种情况是虽然质粒中原来有相应抗性，但插入外源片 段后重组质粒失去抗药性，据此我们也可以进行抗药性筛 选。
直接筛选法
• 直接筛选法是借助遗传学表型来进行筛选的方法。
• 重组子转化宿主细胞后，载体上的一些筛选标志基因表 达，会导致宿主的某些表型的改变，通过琼脂平板中添加 相应筛选物质，可以直接筛选含重组子的菌落。如果质粒 上有两种抗性，因为外源基因的插入，导致其中一个不 能 表达，那么也可以通过抗药性将重组子筛选出来。
重
酶切片段分析法
组
子
筛
RNA水平
选
检测特定外源基因是否转录及转录的强度 （Northern杂交印迹法)
蛋白质水平
免疫化学检测法（放射性抗体检测法、 免疫沉淀检测法）
Westhern印迹杂交法
重点介绍的筛选方法
抗药性筛选 a互补
遗传表型直接选择法
快速裂解菌落鉴定分子大小
限制性内切酶酶切法 PCR方法筛选鉴定重组子 菌落杂交筛选
常用的抗药性选择标记
抗药性
氨苄青霉素 （Amp）
溶解剂 虑过 贮存温度 除菌
水
是
-20℃
贮存浓度
终浓度
50mgHale Waihona Puke Baiduml 50~100µg/ml
氯霉素（Cm） 乙醇
否
-20℃ 34mg/ml 20~170µg/ml
卡那霉素 （Ka或Kan） 水
是
-20℃ 10mg/ml
50µg/ml
四环素（Tet
10µg/ml（液）
间接筛选法
• 间接筛选法是检测重组体克隆中是否含有目的基因的核苷 酸序列或是否产生目的基因所编码的产物。
• 一般来说，先用直接筛选法进行初步筛选后，再用间接检 测法进行鉴定，直至获得我们所需要的阳性重组体。
重组子筛选的方法
遗传表型直接筛选法
核酸分子杂交法
DNA水平
PCR法 DNA序列分析法 直接凝胶电泳法
B类插入失活筛选步骤
• 注意事项：
• （1）以Amp、Tc等抗生素作为选择药物，37℃培养时间 约12~16h，超过时间视为杂菌（假转化子菌落）。
• （2）挑选单菌落作为转化子以便进一步实验验证。挑的 菌落在LB培养基中震荡培养。
遗传学表型筛选的方法二—a互补
• 基本原理：
• 这种筛选方法适用于含b-半乳糖苷酶基因的载体。载体在 b-半乳糖苷酶的a-肽编码区具有多克隆区域。重组质粒中 的插入片段使a-肽失活，可在指示平板上通过颜色筛选鉴 别。不带有插入片段的载体表达有活力的b-半乳糖苷酶， 所用的宿主菌在染色体或附加体上缺失掉LacZM15基因， 导致内源a-肽失活。载体或其他含LacZ基因的a-肽互补 细菌，具有b-半乳糖苷酶的w片段。
b：如果外源基因片段插入载体的位点在抗药性基因中 间，导致抗药性基因失活，这个抗药性标志就会失活。 检测外源DNA插入作用的一种通用的方法是插人失活 效应 。
a类筛选
• 基本原理
• 抗药性筛选主要用于重组质粒DNA分子的转化子的筛选。 因为重组质粒DNA携带有特定的抗药性选择标记基因，转 化受体菌后能使后者在含有相应选择药物的选择培养基上 生长，而不含重组质粒DNA分子的受体菌则不能存活。
a类筛选的实验方法
• LB固体培养基中加入千分之一的抗性药物，再倒平板； • 将转化后的菌液均匀涂布在平板上； • 放在37℃培养箱培养12~16小时； • 观察菌落生长情况。
抗药性标记法示意图
b类插入失活筛选
• 从原理上讲，当外源基因(或DNA片段)插入到某一基因内 的位点后, 使这个基因丧失了原有的功能叫插入失活 (insertional inactivation) 。插入失活法是从不同的重组 DNA分子获得的转化子中鉴定出含有目的基因的转化子
（筛选）的主要方法。
• 例如：
• 非重组的pBR322质粒DNA上的四环素和氨苄青霉素抗性 基因都是正常的, 表型为AprTcr。带有这种质粒的受体菌 可以在加有四环素和氨苄青霉素的双抗性平板上生长。但 是, 如果在该质粒的氨苄青霉素抗性基因内插入外源片段, 就会造成氨苄青霉素抗性基因失活, 变成ApsTcr, 携带这 种 质粒的宿主菌可以在四环素的平板上生长, 而不能在氨苄 青霉素抗性平板上生长。
所得到的活力b-半乳糖苷酶（ a-肽加w片段）将底物XGal转化为有颜色的产物，得到蓝色菌落。在载体多克隆 区域，克隆上插入片段导致a-肽编码区的破坏，使b-半 乳 糖苷酶失活，得到白色菌落。 a-肽编码区读码框内小的 插入片段产生浅蓝色菌落，因b-半乳糖苷酶只是部分失活。
• 通常蓝白筛选是与抗性筛选一同使用的 。这样 一次筛选 可以判断出：未转化的菌不具有抗性，不生长；转化了空 载体，即未重组质粒的菌，长成蓝色菌落；转化了重组 质粒的菌，即目的重组菌，长成白色菌落。