DNA实验

《分子生物学技术在中医药研究中的应用》教案（4）课程名称分子生物学技术在中医药研究中的应用总学时数48

《分子生物学技术在中医药研究中的应用》教案（5）课程名称分子生物学技术在中医药研究中的应用总学时数48

上海中医药大学

《分子生物学技术在中医药研究中的应用》教案（6）课程名称分子生物学技术在中医药研究中的应用总学时数48

实验6 组织总RNA提取

实验目的

1．了解某一特定组织或细胞某一特定mRNA转录量的变化，如RT-PCR、Northern blot 等。

2．了解某一特定组织或细胞全部mRNA转录量的变化，如DD-PCR、基因芯片等。

3．获得某一特定组织或细胞全部mRNA，以便建立cDNA库等。

4．获得某一特定组织或细胞全部RNA。

以上工作的前提是制备纯净且完整的RNA。

现代医学研究表明，人类的绝大多数疾病都是由若干基因表达的改变所引起的。根据生物学“中心法则”原理，基因的表达包括转录与翻译两个阶段。其中，由DNA到RNA的转录过程受到各种因素的调节，其调节水平反映出某种或某些特定的因素对相关基因表达的调节能力。已有的研究一再表明，中医药所发挥的治疗与预防作用是直接或间接调整了基因的转录而实现的。

RNA主要由rRNA（占总量的80-85％），tRNA和核内小分子RNA（占总量的10-15％）以及mRNA（占总量的1-5％）所构成。理论上认为每克组织（或108个培养细胞）可提取5-10mg RNA。

提取总RNA的方法有多种，比如：

1）本实验介绍的方法，类似于本实验的Trizol方法（今天我们会介绍这样的方法），均称为一步法，方便而快捷。缺点是RNA的获得量偏低，质量不够纯净。

2）超离心方法，可以获得丰富且质量高的RNA。缺点是实验时间比较长，要求离心过夜。

3）其它一些试剂盒，主要是利用某些特定的介质吸附RNA，驱除其它杂质，以后洗脱纯净的RNA。可以在短时间内获得纯净的RNA。但是价格比较昂贵。

原理

本实验又称异硫氰酸胍-酚-氯仿一步法。方法采用强RNA酶抑制剂异硫氰酸胍，抑制RNA酶的活性，防止RNA的降解；酚/氯仿使蛋白质变性。离心后，RNA选择性地进入无DNA和蛋白质的水相。之后通过异丙醇沉淀，75%乙醇洗涤等，便可得到较为完整与纯洁的总RNA。

实验准备（略）

实验步骤

（参照GIBCO BRC公司有Trizol试剂盒）

1．引颈处死小鼠，剖腹切取肝脏组织50mg（或106-107个细胞），加入1ml Trizol液，剪碎，快速匀浆。

2．22℃，静置5min。

3．加入氯仿0.2ml，颠倒15s。

4．22℃，静置3min。

5．离心：4℃×15000转/分×15min。

6．取上清液0.5ml。

7．加入0.5ml异丙醇，混匀。

8．22℃，静置10min。

9．离心：4℃×15000转/分×10min。

10．弃上液。

11．加入1ml 4℃ 75%乙醇。

12．离心：4℃×10000转/分×5min。

13．弃上液，真空干燥5min。

14．用高压消毒过的去离子水25ul水冰上溶解，-70℃保存。

15．紫外分光光度计测定RNA的含量：

取样本5ul加入石英比色杯内，加入蒸水0.8ml，充分混匀。与蒸水对照。读260nm、280nm两个测得值，记录。计算：

OD260为1时，为40ug RNA，所以计算如下：

样本RNA含量（ug/ul）= OD260*160*40/1000

当OD值260/280<1.8时，提示有蛋白或酚的污染。

实验结果

得到比较纯净的肝组织总RNA。

据参考文献，分光光度计读数260/280 值为 1.85±0.04。

注意事项

1．实验过程中要求创造一个无RNA酶污染的环境。主要包括两个方面的工作，其一，极力避免来源于操作者的手及实验的器皿和试剂等外源性RNA酶的污染；其二，尽力抑制组织细胞中内源性RNA酶的活力，并尽可能地去除。

2．由于RNA酶到处存在，不易失活，极易造成污染而导致RNA的降解，造成实验失败。因此建议所有用品均应严格按要求消毒，注明RNA专用。严格按无菌操作要求操作。通常用于RNA抽提与保存的塑料制品用DEPC水室温下浸泡过夜，再高压消毒。注意，DEPC 处理的水和容器，必须高温灭活DEPC，以免其日后抑制其它酶的活性，导致实验失败。玻璃制品泡酸反复冲洗后，250℃干烤3小时以上。

3．去除内源性RNA酶的方法可用酚/氯仿反复抽提几次，直至中间的蛋白层基本消失。我们的经验是至少抽提3次以上。

4．实验过程中应将组织充分匀浆，一般可先将组织块用剪刀剪碎，以利于快速匀浆。

5．在酚/氯仿抽提过程中，一定要颠倒混匀充分，这样才能使蛋白质充分变性，才能充分去除蛋白质与RNA酶。为了提高RNA的纯度，该步骤可以重复若干次。

6．抽提过程中，由于异硫氰酸胍是RNA酶的强抑制剂，在整个实验过程中不会产生RNA的降解。但在加入75%乙醇洗涤时，以及RNA干燥和加水溶解时须防止RNA酶的污染。

7．在吸取上清时，切不可将上清与酚交界处的蛋白及下面的酚吸起，造成RNA的污染。因此，通常轻轻吸取上清，且留有部分上清，以免搅起紧邻着的酚。

8．若需抽提大量RNA时，以上试剂、试管可按比例放大。所获RNA建议分装，以免使用过程中反复冻融。

9．如果是培养细胞，先收集细胞，用PBS缓冲液反复漂洗3次，再加D溶液混匀细胞，后面的实验过程一致。

实验8

Northern blot

实验目的

1．定量分析某一特定基因mRNA的转录与否，以及转录的水平。

2．比较两个或两个以上不同组织某一已知基因转录的差异。

3．比较两个或两个以上不同组织某一未知基因转录的差异。