元基因组学技术-CAS
CRISPR-Cas系统在细菌基因组编辑中的应用和挑战
CRISPR/Cas系统在细菌基因组编辑中的应用和挑战摘要CRISPR/Cas系统是一种广泛存在于细菌和古菌中的自适应免疫系统，它可以识别和切割外源DNA，从而防止病毒或质粒的感染。
近年来，CRISPR/Cas系统被开发为一种高效、精确和通用的基因组编辑工具，可以在多种生物体中实现目标基因的敲除、插入、替换或调控。
在细菌领域，CRISPR/Cas系统不仅可以用于研究细菌的基因功能、代谢途径和信号转导，还可以用于构建细菌的生物合成平台、生物传感器和生物材料。
然而，CRISPR/Cas系统在细菌基因组编辑中也面临着一些挑战，主要包括细菌的修复机制、同源重组能力、靶向效率和特异性、抗性和耐受性等。
本文将综述CRISPR/Cas系统在细菌基因组编辑中的应用和挑战，并展望其未来的发展方向。
引言细菌是地球上最丰富和多样的生物之一，它们在自然界中发挥着重要的生态功能，同时也是人类健康、农业、工业和环境的重要影响因素。
为了揭示细菌的生理特性、代谢调控和适应机制，以及为了利用细菌的生物合成能力、生物降解能力和生物传感能力，对细菌的基因组进行精确和高效的编辑是必不可少的。
传统的细菌基因组编辑方法主要依赖于同源重组和反向遗传学，但这些方法通常需要多步操作、耗时耗力、效率低下、特异性差、可操作性有限。
因此，开发一种简单、快速、精确和通用的细菌基因组编辑方法是迫切需要的。
CRISPR/Cas系统是一种广泛存在于细菌和古菌中的自适应免疫系统，它可以识别和切割外源DNA，从而防止病毒或质粒的感染。
CRISPR/Cas 系统由两个主要组成部分构成：一是CRISPR（Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats）位点，它是由一系列重复序列和间隔序列组成的DNA片段，间隔序列来源于外源DNA的切割片段，可以作为记忆库存储外源DNA的信息；二是Cas（CRISPR-associated）基因，它们编码一系列核酸酶或辅助蛋白，可以参与CRISPR位点的转录、加工和干扰。
基因编辑技术CRISPRCas的原理与应用
基因编辑技术CRISPRCas的原理与应用基因编辑技术CRISPR-Cas的原理与应用在该题目中，我们将探讨基因编辑技术CRISPR-Cas的原理和应用。
以下是对CRISPR-Cas的解释以及该技术在生物学和医学领域的广泛应用。
一、CRISPR-Cas的概述CRISPR（Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats）是一种存在于细菌和古菌中的宿主免疫系统。
CRISPR-Cas系统通过储存和利用外源DNA序列信息来识别和破坏入侵的病毒和噬菌体。
二、CRISPR-Cas的工作原理1. CRISPR-Cas9系统CRISPR-Cas9是其中最常用的一种CRISPR系统。
它基于Cas9酶与CRISPR RNA（crRNA）和转录单元的连接，使Cas9能够识别和切割目标DNA序列。
crRNA通过配对目标DNA上的特定序列，引导Cas9到目标位点。
Cas9酶通过其核酸酶活性切割DNA，引发细胞自然的DNA修复机制。
2. CRISPR-Cas12和CRISPR-Cas13系统除了Cas9，CRISPR-Cas系统中还有其他酶如Cas12和Cas13。
CRISPR-Cas12使用crRNA和转录单元来导向Cas12酶切割DNA，而CRISPR-Cas13则使用crRNA来导向Cas13酶切割RNA。
三、CRISPR-Cas的应用领域1. 基因组编辑CRISPR-Cas系统可以被用来编辑生物体的基因组。
通过设计合适的引导RNA序列，可以将Cas酶定点引导到目标基因组位点，并进行切割或修改特定的DNA序列。
这为基因功能研究和疾病相关基因的研究提供了高效率和精准性的工具。
2. 基因治疗CRISPR-Cas系统在基因治疗中具有巨大潜力。
通过将CRISPR-Cas 工具引导到有缺陷的基因区域，可以修复或替换不正常的基因序列。
这为一些遗传性疾病的治疗提供了新的可能性。
cas9技术实验流程
Cas9技术介导单基因细胞系敲除的实验流程一. CRISPR/cas9技术简介及原理2013年1月份，美国两个实验室在《Science》杂志发表了基于CRISPR-Cas 技术在细胞系中进行基因敲除的新方法，该技术与以往的技术不同，是利用靶点特异性的RNA将Cas9核酸酶带到基因组上的具体靶点，从而对特定基因位点进行切割导致突变。
CRISPR/Cas9是最新出现的一种山RNA指导Cas核酸酶对靶向基因进行特定DNA修饰的技术。
CRISPR是细菌和古细菌为应对病毒和质粒不断攻击而演化来的获得性免疫防御机制。
在这一系统中，crRNA (CRISPR-derived RNA) 通过碱基配对与tracrRNA (trans-activating RNA )结合形成双链RNA,此tracrRNA/crRNA二元复合体指导Cas9蛋口在crRNA引导序列靶定位点剪切双链DNA达到对基因组DNA进行修饰的H的。
CRISPR/Cas9系统能够对小鼠和大鼠基因组特定基因位点进行精确编辑，U前已经成功应用于大小鼠基因的KO/KI模型制备。
通过基因工程手段对crRNA和tracrRNA进行改造，将其连接在一起得到sgRNA (singleguideRNA)。
融合的RNA具有与野生型RNA类似的活力，但因为结构得到了简化更方便硏究者使用。
通过将表达sgRNA的原件与表达Cas9 的原件相连接，得到可以同时表达两者的质粒，将其转染细胞，便能够对LI的基因进行操作二、C as9技术介导单基因细胞系敲除的实验流程1、设计识别靶位点的一对DNA Oligos选择PAM (NGG) 5 '端的一段碱基序列20nt作为原间隔序列，即敲除的靶位点。
(PAM, Protospacer adjacent motifs原间隔序列临近基疗：。
一般形式为NGG,其作用是将间隔序列定位于入侵的噬菌体或质粒的DNA序列中)原则：选择的序列必须在全基因组中进行比对，原间隔序列必须唯一，否则会对其他基因进行敲除而出现错误的实验结果。
基因编辑技术CRISPRCas的原理与应用
基因编辑技术CRISPRCas的原理与应用基因编辑技术CRISPR-Cas的原理与应用基因编辑技术是一项革命性的科学技术，被广泛应用于生物学、医学及农业领域。
而CRISPR-Cas系统作为当前最被关注的基因编辑技术之一，引发了广泛讨论和研究。
本文将介绍CRISPR-Cas系统的原理，并探讨其在基因编辑和其他领域的应用。
一、CRISPR-Cas系统的原理CRISPR-Cas系统是一种原本存在于细菌和古细菌中的天然免疫系统。
它能检测到外源DNA，并将其与细菌基因组中的CRISPR序列进行匹配，进而实现基因序列的特异性识别和剪切。
CRISPR代表“簇规律间隔短回文重复”，主要由一系列短回文重复序列和间隔序列组成。
而Cas蛋白则是CRISPR-Cas系统的核心组成部分，它起到对外源DNA进行识别和切割的作用。
具体而言，CRISPR-Cas系统分为两个主要阶段：适应性和干预性。
适应性阶段：在细菌感染外源DNA时，一种特殊的酶将外源DNA片段插入到细菌基因组中的CRISPR序列中，形成“spacer”。
这一过程类似于免疫的“记忆”，使细菌“学会”了识别并攻击同种类的病毒或外源DNA。
干预性阶段：当同一种病毒再次感染细菌时，CRISPR序列中的spacer将被转录成RNA，并与Cas蛋白形成复合物。
这个复合物能够识别并结合目标DNA，在Cas蛋白的介导下，外源DNA将被剪切并失去功能。
二、CRISPR-Cas系统的应用1. 基因编辑CRISPR-Cas系统在基因编辑领域有着广泛的应用。
通过改变spacer 的序列，科学家可以设计指定的RNA引导序列，使CRISPR-Cas系统能够准确识别和切割特定的基因。
这样，人们可以实现对基因的精确编辑和修复。
基因编辑技术通过CRISPR-Cas系统的应用，带来了无数的可能性，包括遗传病的治疗、农作物的改良以及生物燃料的生产等。
2. 遗传学研究CRISPR-Cas系统也被广泛用于研究基因的功能与调控机制。
CRISPR-Cas系统的分类及其特点
CRISPR-Cas系统的分类及其特点什么是CRISPR-Cas系统•CRISPR-Cas系统是一种在细菌和古菌中广泛存在的一种特殊的DNA 序列，它是一种自然的免疫系统，可以帮助细菌抵抗外来的病毒或质粒的侵入。
•CRISPR-Cas系统由两个主要部分组成，一个是CRISPR基因座，一个是Cas基因。
CRISPR基因座由多个重复序列和间隔序列组成，重复序列是相同或相似的短DNA片段，间隔序列是不同的短DNA片段，它们是细菌从入侵的病毒或质粒中获得的外源DNA片段，相当于细菌的免疫记忆。
Cas基因是指与CRISPR基因座相邻或附近的一组编码Cas 蛋白（CRISPR相关蛋白）的基因，它们是CRISPR系统的执行者，可以识别和切割外源DNA 。
CRISPR-Cas系统的分类•CRISPR-Cas系统根据其效应子模块（负责识别和切割外源DNA的部分）的组成和功能，可以分为两大类。
•第一类CRISPR-Cas系统的效应子模块由多个亚基组成的复合物，通常包括Cas5、Cas6、Cas7等蛋白，以及crRNA（CRISPR RNA）和tracrRNA （反式激活CRISPR RNA）等RNA分子。
第一类CRISPR-Cas系统可以靶向DNA和RNA，根据不同的效应复合物又分为三种类型和十六种亚型。
•第二类CRISPR-Cas系统的效应子模块由单个大的多结构域蛋白组成，通常包括Cas9、Cas12、Cas13等蛋白，以及crRNA或sgRNA（单链引导RNA）等RNA分子。
第二类CRISPR-Cas系统主要靶向DNA，根据不同的效应蛋白又分为三种类型和十七种亚型。
CRISPR-Cas系统的特点•CRISPR-Cas系统具有以下几个特点：o适应性：CRISPR-Cas系统可以根据外来DNA的入侵而更新自身的免疫记忆，即将外来DNA片段整合到CRISPR基因座中作为间隔序列，从而提高对同一或相似入侵者的防御能力。
基因组编辑技术CRISPRCas的原理与应用
基因组编辑技术CRISPRCas的原理与应用基因组编辑技术CRISPR-Cas的原理与应用基因组编辑技术是一项引人瞩目的科学突破，在医学和生物学领域引起了广泛关注。
其中，CRISPR-Cas系统作为一种灵活、高效的基因组编辑工具，已经成为当前研究的热点。
本文将详细介绍CRISPR-Cas 的原理与应用，帮助读者了解这一前沿技术的具体内容。
一、CRISPR-Cas系统的原理CRISPR-Cas系统是一种天然存在于细菌和古菌中的防御机制，用于对抗外源入侵的病毒和质粒。
它由两个主要组分组成：CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats)和Cas (CRISPR-associated) 蛋白。
CRISPR是由一系列重复和间隔的DNA序列组成的，这些序列被称为“回文重复序列”，并与来自入侵者的DNA片段相匹配。
Cas蛋白则可以通过与CRISPR特定DNA序列的配对，识别和剪切外源DNA。
当细菌或古菌感染外源DNA时，CRISPR-Cas系统将这些外源DNA片段的一部分整合到自己的基因组中，构成一个新的CRISPR序列。
这样的记录使得该细菌或古菌能够更好地抵抗之后同样的外源入侵。
当在细菌或古菌中再次遇到同一入侵者时，CRISPR序列将通过CRISPR RNA (crRNA) 与Cas蛋白结合，形成复合物，通过碱基互补配对，进一步识别和剪切外源DNA。
这种清除外源入侵的机制是CRISPR-Cas系统的重要特性。
二、CRISPR-Cas系统的应用CRISPR-Cas系统的原理启发了研究人员将其应用于基因组编辑，以改变活体生物的基因组结构。
以下是CRISPR-Cas系统在医学和生物学领域的一些常见应用：1. 基因组修饰和基因敲除CRISPR-Cas技术可以通过设计特定的引导RNA (sgRNA) 来识别和剪切目标DNA序列。
通过这种方式，研究人员可以精确地修饰和敲除特定基因，从而揭示基因的功能以及与疾病相关的机制。
CRISPRCas9
CRISPR-Cas系统靶向要求
• 最主要的要求： • PAM（protospacer-adjacent motif）为NGG。
• Cas9蛋白来源于细菌，因此要让Cas9蛋白高 • 效地转运到哺乳动物细胞核内，需要在Cas9 蛋白的N端或是C端加上真核细胞的核定位 信号。从目前发表的论文来看，在Cas9蛋白 的C端添加核定位信号，似乎是提高Cas9蛋 白的核转运最有效的方法。
外源遗传物质的干扰
• 干扰是CRISPR/Cas9发挥抵御外源遗传物质 入侵最关键的步骤，成熟的crRNA与特异的 Cas蛋白形成核糖核蛋白复合物，再与外源 DNA结合并扫描到外源DNA，寻找其上的靶 序列，crRNA的间隔序列与靶序列互补配对， 外源DNA在配对的特定位置被核糖核蛋白复 合物切割。
作用机理
CRISPR/Cas9作用机制
• • • • 对于CRISPR/Cas9的作用机理可以分为三个阶 段来理解： 第一是CRISPR的高度可变的间隔区的获得。 第二是CRISPR基因座的表达(包括转录和转录后的 成熟加工)。 • 第三是CRISPR/Cas9系统活性的发挥或者是对外源 遗传物质的干扰。
局限性
• 脱靶效应 • Cas9蛋白对于目标序列的切割不仅仅依靠 crRNA序列的匹配，在目标序列(protospacer) 附近必须存在PAM。 • CRISPR/Cas9系统所靶向的序列仅需十余个 碱基对精确配对，这可能会降低 CRISPR/Cas9系统切割的特异性。 • CRISPR/Cas9系统也面临着如何控制双链断 裂之后的非同源末端连接修复可能随机产 生细胞毒性的问题。
TypeⅢ
• TypeⅢ系统包含特征性的Cas10蛋白，主要 参与crRNA的成熟和剪切入侵外源DNA 。
基因编辑技术CRISPRCas的原理和应用
基因编辑技术CRISPRCas的原理和应用基因编辑技术CRISPR-Cas的原理和应用基因编辑技术CRISPR-Cas（簡稱CRISPR）是一项近年来备受关注的基因工程技术。
CRISPR-Cas系统是一种能够实现精确编辑基因组的革命性工具，可用于修改遗传疾病、改进作物和治疗人类疾病等领域。
本文将介绍CRISPR-Cas的原理和应用。
一、CRISPR-Cas的原理CRISPR是"Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats"（簡稱CRISPR）的缩写，意为“聚集间隔短回文重复序列”。
Cas则代表与CRISPR相关的蛋白质。
CRISPR-Cas系统是一种起源于细菌和古菌的防御机制，用于对抗病毒等入侵。
CRISPR-Cas系统由两个主要组成部分组成：CRISPR序列和Cas蛋白。
CRISPR序列包含一系列重复和间隔序列，而Cas蛋白则具有催化酶活性。
当CRISPR序列与Cas蛋白表达时，系统能够识别外来DNA，并通过将其剪接或修复来实现基因组的编辑。
二、CRISPR-Cas的应用1.基因组编辑CRISPR-Cas可以用于精确编辑基因组，具有非常广泛的应用潜力。
科学家们可以利用CRISPR-Cas系统来剪接、插入或修复特定的基因序列，以实现对遗传性疾病的治疗、改进农作物的品种和提高动物的抗性等。
这项技术的出现，为遗传学研究提供了前所未有的便利和效率。
2.遗传疾病治疗CRISPR-Cas可用于修复或删除携带遗传疾病的基因序列。
通过精确编辑患者基因组中存在问题的位点，科学家们可以更准确地治疗遗传疾病，比如囊肿纤维化等。
这为患者提供了一种全新且有效的治疗选择。
3.农作物改良利用CRISPR-Cas技术，植物科学家可以精确编辑农作物基因组中的特定位点，以提高农作物的产量、耐旱性、抗病性等。
这项技术为传统的育种方法注入了新的活力，加快了农作物改良的进程。
CRISPRCas技术在基因组编辑中的应用
CRISPRCas技术在基因组编辑中的应用CRISPR-Cas技术在基因组编辑中的应用引言随着基因组学的迅速发展，人们对基因组编辑技术的需求也不断增长。
CRISPR-Cas（簇状间隔短回文重复序列与相关蛋白质）技术作为一种革命性的基因组编辑工具，引起了广泛的关注。
本文将介绍CRISPR-Cas技术的原理及其在基因组编辑中的应用。
一、CRISPR-Cas技术的原理CRISPR-Cas技术是一种通过人工设计的RNA导向的DNA切割系统，它利用了细菌和古菌天然免疫系统中的一部分组成。
它主要由两个核心组成部分组成：CRISPR序列和Cas蛋白。
CRISPR序列是一段由重复间隔和间隔序列组成的DNA序列，存在于许多细菌和古菌的基因组中。
这些序列起到记录基因组中曾遭遇的病毒或其他外源性核酸的功能。
Cas蛋白是一组与CRISPR序列相关的蛋白质，它们能够识别并切割这些记录的外源性核酸。
在基因组编辑中的应用1. 基因组修复CRISPR-Cas技术在基因组修复中发挥了重要作用。
人类基因组中的突变常常导致遗传性疾病的发生。
通过利用CRISPR-Cas技术，研究人员可以准确地删除、修复或替换受损的基因序列，从而恢复正常的基因功能。
2. 基因敲除和基因敲入CRISPR-Cas技术可用于基因敲除和基因敲入。
基因敲除是指通过定点编写CRISPR-Cas系统来剔除基因组中的特定基因，从而观察失去该基因的生物体的表型变化。
基因敲入则是指通过引入外源性DNA序列到目标基因组中，来增加或修改生物体的基因组。
3. 组织和发育研究CRISPR-Cas技术还可用于组织和发育研究。
通过利用CRISPR-Cas技术，研究人员可以在动物模型中选择性地敲除或突变特定基因，从而研究这些基因在发育过程和组织发育中的功能。
4. 农作物改良CRISPR-Cas技术在农业领域也有着广泛的应用前景。
通过利用CRISPR-Cas技术，研究人员可以实现对农作物的基因组编辑，例如提高农作物的抗病性、耐旱性以及品质改良等。
crisprcas基因编辑技术原理与应用 ppt课件
模式
动物 关的基因来用小鼠或其他模型动物建立
相应的疾病模型。研究者可以应用这些
疾病模型研究疾病的发病机制,再现疾病
发生过程;也可用于筛选有效治疗药物,
或通过研究特异的表面分子、信号通路
等开发新的靶向治疗药物等。
17
传统方式
用特定的手段将目的DNA片段插入到小鼠胚胎干细 胞中,筛选出成功修饰的胚胎干细胞,应用显微操 作技术将其移入到早期胚胎(即囊庇)中,将改造后 的脏胎移植到假孕母鼠中,再自生出的小鼠筛选疾 病模型。
利用CRISPRCas进行基因组工程，图中不同颜色的剪刀
代表着不同的Cas9酶
13
应用
用CRISPR/Cas技术绕过了胚胎干细胞操作过程,可快速而有效地建立 携带多个基因突变的小鼠。因其不依赖在胚胎干细胞上操作,可用于多生物 细胞的基因操作。模型生物的建立也不再局限于小鼠及少数大鼠中,任何可 进行胚胎操作的物种都能成为基因组工程的目标。
好 相比其它编辑技术CRISPR/Cas基因编辑技术好用吗？
怎
怎么用CRISPR/Cas基因编辑技术？
7
目录
CRISPR/Cas基因编辑技术
发现 原理 应用 优点 缺点 发展
前景
8
发现
在1987年的一篇论文中，日本大阪大学的研究人员报告了一项表面上微不 足道的研究发现。他们在调查一种编码碱性磷酸酶的细菌基因序列时，发现 了邻近的一个不同寻常的DNA片段，这一DNA片段中间是一段短直接重复 核苷酸序列，两侧为短特异片段。他们当时指出“这些序列的生物学意义尚 不清楚”。在几乎过去快30年后，这一最初看起来不起眼的研究发现，现在 为简易操控大量生物体的基因组打开了大门。2000年，相似的重复序列在其 它真细菌和古细菌中被发现并被命名为短间隔重复序列（Short Regularly
基因编辑技术CRISPRCas的原理与应用
基因编辑技术CRISPRCas的原理与应用基因编辑技术CRISPR-Cas的原理与应用基因编辑技术CRISPR-Cas（Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats-CRISPR associated）是一项革命性的生物技术，它引发了医学、农业等领域的巨大变革。
本文将介绍CRISPR-Cas的原理以及它在各个领域的应用。
一、原理CRISPR-Cas系统是一种免疫系统，起源于细菌和古细菌。
它能够识别和摧毁细菌感染的病毒基因组片段，从而保护宿主细菌免受感染。
该系统包括两个核心组成部分：CRISPR序列和Cas蛋白。
1. CRISPR序列CRISPR序列是一段由多个重复序列和间隔序列组成的DNA片段。
这些重复序列和间隔序列是宿主细菌嵌入到基因组中的病毒基因组片段。
CRISPR序列的特点是高度保守，可以通过PCR扩增和测序分析。
2. Cas蛋白Cas蛋白是CRISPR-Cas系统的核心执行器。
Cas蛋白可以切割DNA，修复断裂的DNA链，并起到导向CRISPR序列的作用。
不同类型的Cas蛋白具有特异性，能够识别和结合特定的CRISPR序列。
基于CRISPR-Cas系统的基因编辑技术，主要利用Cas9蛋白。
Cas9蛋白能够与CRISPR序列结合，使得CRISPR序列能够识别和结合靶基因的DNA序列。
二、应用CRISPR-Cas技术的应用非常广泛，涵盖了农业、医学、环境等多个领域。
以下是其中的几个典型应用。
1. 基因治疗CRISPR-Cas技术可用于修复人类基因组中的异常基因，治疗一些遗传性疾病。
通过将CRISPR-Cas系统导入病人的细胞中，可针对性地编辑患者的异常基因，恢复正常的基因功能。
2. 农业改良CRISPR-Cas技术在农业领域具有巨大的潜力。
通过编辑植物、动物基因组，可以使作物具备抗病性、耐旱性和耐盐性等特征。
这将提高农作物的产量和品质，有助于解决全球粮食安全问题。
CRISPR Cas技术
CRISPR/Cas9系统是一特殊的DNA重复序列家族，又命名为成簇的、规
律间隔的、短回文、重复序列，是目前用于基因敲除、点突变、基因插入、 基因修复等基因编辑方面的新方法。
CRISPR/Cass系统是从细菌和古生菌内发现的，它参与细菌的免疫过程， 抵挡外源遗传物质的侵袭，是一种后天获得的防御系统。
CONTENTS
一、CRISPR-Cas系统的简介
1，CRISPR/Cas系统的由来 2，CRISPR/Cas系统的分类 3，CRISPR/Cas系统的结构
二、CRISPR-Cas系统的作用机理
1，CRISPR间隔区的获得 2，crRNA的表达和成熟 3，外源基因的切割
三、DSB的修复 四、CRISPR-Cas系统的应用 五、CRISPR技术的脱靶问题 六、实验设计
2 经核酸酶切割成熟，与tracr RNA结合成sgRNA，sgRNA具
有特异性，作用于特定的基因序列。
3
实验时只需要改造CRISPR的部分序列，就可以得到针对特 定基因的CRISPR/Cas系统。
crRNA与tracrRNA碱基互补配对结合成gRNA，此 复合物能引导核酸酶Cas9 蛋白切割与crRNA配对 的双链DNA。
基因组双链发生断裂，形成双链缺口 （DSB）。
在真核生物中DSB （DNA双链切口）可被两种不同的机体自身 修复机制修复DSB——非同源性末端连接（NHEJ）和同源重组 （ HDR）进行修复。NHEJ能够高效地引入不同长度的插入或 缺失突变（indel），产生由于移码突变而导致的基因功能受 损，多用于细胞或动物模型中的基因敲除、功能基因组的筛 查、转录调控和基因沉默的研究；HDR以DNA结构的同源性为 基础，修复会带入特定位点的突变或在外源DNA供体模板存在 下对靶点形成可预测的插入.此外还有一种微生物学介导的末 端连接，这种在实验中比较少应用。
CRISPR_Cas技术
噬菌体或质粒上与CRISPR－Cas9系 统中间隔序列对应的序列被称为 protospacer（PAM），一般为５‘－ ＮＧＧ－３’。
当外源基因入侵时，宿主识别PAM， 以PAM附近的序列作为protospacer； 把protospacer整合到CRISPR基因座 的5’端的两个重复序列之间，从而获得 相应的间隔区。
前导区调控细菌CRISPR之间的间隔 区转录为前体crRNA，反式激活 cr RNA（tracr RNA）与 pre-cr RNA 重 复序列互补介导核酸酶 Rnase III 对 pre-cr RNA 进行加工处理，切割成 成熟crRNA。
crRNA 和tracrRNA结合成sgRNA，指 导Cas9对外源基因进行切割。Cas9识 别目的基因中的PAM片段，而crRNA识 别ＰＡＭ 的５′端互补的20bp的DNA序 列片段（外源DNA），使基因组与 Cas9稳定结合，从而对靶位点进行切割，
基因表达调控：改造成转录激活因子、转录抑制因 子等调节蛋白对基因表达进行调控。如使Cas9两个 活性位点突变形成dCas9，dCas9不切割DNA，而 是引导抑制因子或转录因子的结合到靶位点上，从 而达到抑制基因的表达或激活基因的表达。目标位 置可以是启动子区域、调控区域或早期编基因。
Repeaeas两端序列是严格保守的分别为ＧＴＴＴ／
2 Ｇ和ＧＡＡＡＣ／Ｇ，能使转录岀的RNA二级结构
保持稳定。 Spacers均为外源的DNA插入。前导序 列可能在插入新的Spacers时起到识别作用或者作为 转录CRISPR的启动子。
Cas蛋白是一种双链DNA核酸酶，能在guide RNA的引导下切割 靶位点， Cas9 具有 HNH 和 Ruv C 两结构域，都可以切割
3
CRISPRCas 基因编辑技术简介
1987年，日本大阪大学（Osaka University） 在对一种细菌编码
的碱性磷酸酶基因进行研究时，发现在这个基因编码区域的附近存在一小段
不同寻常的DNA片段，但一直不清楚功能。后来的研究发现，这种重 复序列广泛存在于细菌和古细菌中。
2002年才正式命名为成簇的规律间隔性短回文重复序列 CRISPR(Clustered regulatory interspaced short palindromic repeat2s0).13年之后，研究者们在《science 》和《nature》等国际著名杂 志上发表多篇文章介绍CRISPR/Cas9系统，并且已成功在人类、小鼠
、斑马鱼等物种上实现精准的基因修饰。
第1页，共22页。
1.CRISPR/Cas系统概述
1.1CRISPR的分布与分类：
已测序的接近90%的古细菌和40%的细菌的基因组或是质粒中至 少存在CRISPR 基因座。
根据Cas 基因核心元件序列的不用，CRISPR/Cas 免疫体统分为3 中类型：Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型。Ⅰ型和Ⅲ型CRISPR/Cas免疫系统需要多 个Cas蛋白形成复合体切割DNA双链，而Ⅱ型CRISPR/Cas9免疫系统只 需要一个Cas9蛋白来切割DNA双链，目前Ⅱ型系统是被改造的最成功的
第9页，共22ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ。
4.CRISPR/Cas9 系统
Jinek等创造性的把crRNA和部分tracrRNA融合成一条嵌合的RNA链, 使其同时具有crRNA和tracrRNA的特性,随后的切割实验表明,这条嵌 合的RNA同样可以引导Cas9切割目标DNA。现在普遍使用的都是 crRNA和全长tracrRNA 融合体,简称 sgRNA (single guide RNA)
CRISPRCas 基因编辑技术简介
需要RNaseIII的参与；
tracrRNA会与crRNA形成 二聚体指导Cas对双链 DNA的切割。
第八页，共22页。
4.CRISPR/Cas9系统
Cas9是一种核酸内切酶,其具有：RuvC和HNH两个内切酶活性中心 Jinek等发现Cas9在细菌和试管里对双链DNA具有强烈的切割能力,但 是这种切割能力需要的crRNA和tracrRNA介导。
ZiFiT: /
Cas9 Design: http://cas9 /index.jsp
Cas-OFFinder: /cas-offinder/ CCTop: http://crispr.cos.uni-heidelberg.de/
1.CRISPR/Cas系统概述
1987年，日本大阪大学（Osaka University） 在对一种细菌编码的碱
性磷酸酶基因进行研究时，发现在这个基因编码区域的附近存在一小段不同
寻常的DNA片段，但一直不清楚功能。后来的研究发现，这种重复序 列广泛存在于细菌和古细菌中。
2002年才正式命名为成簇的规律间隔性短回文重复序列
第七页，共22页。
4.CRISPR/Cas9系统
Type Ⅱ 因其简单性及可操作性，被改造成有力的基因工程工具--
CRISPR/Cas9。现在广泛使用的CRISPR/Cas9系统来源于酿脓链球菌。
Type II系统具有以下特点：
在CRISPR/Cas基因座上 游会表达tracrRNA;
tracrRNA会参与crRNA
第十三页，共22页。
4.CRISPR/Cas9系统
第十四页，共22页。
4.CRISPR/Cas9系统
CRISPR/Cas 作用：
(完整)CRISPRCas 基因编辑技术简介精品PPT资料精品PPT资料
除。
CRISPR/Cas系统结构
tracrRNA会与crRNA形成二聚体指导Cas对双链DNA的切割。
CRISPR/Cas系统结构
CRISPR/Cas系统结构
3.CRISPR/Cas9系统作用机制
CRISPR基因座的表达（包括转 录和转录后的成熟加工）
当该噬菌体再次入侵细菌时， CRISPR簇首先转录为长的 crRNA前体，然后逐步加工成 小的成熟的crRNA.
2CRISPR系统获得：
已测序的接近90%的古细菌和40%的细菌的基因组或是质粒中至少存在CRISPR 基因座。
它与fokI酶功能类似，但是它并不需要形成二聚体才能发挥作用。
CRISPR/Cas系统是很多细菌和大部分古细菌的天然免疫系统，通过对入侵的病毒和核酸进行特异性的识别，利用Cas蛋白进行切割，从
2.CRISPR/Cas系统结构
2.3Cas家族： Cpf1以一种不同于Cas9的方式切割DNA。
通过点突变的方法，使Cas9只有单链切割活性，类似于切口酶
Cas(CRISPR 1CRISPR/Cas 主要由两部分组成：
1CRISPR的分布与分类：
associated)存在于CRISPR位点附近，是一种双链
2.2CRISPR结构：
CRISPR基因座的C表R达I（S包P括R转是录和一转录种后的特成熟殊加工的） DNA 重复序列家族，广泛分布于细菌 CtrRaIcSrPRR和N/AC会as古参作与用细c：rRN菌A的加基工，因这个组工程中亦需。要RCNRaseIISII的P参R与位； 点通常由短的高度保守的重复序 C1CRRISIPSPR列R是/C一a(s种r主e特要p殊由e的两aD部NtAs分重)组组复成序：成列家，族，重广泛复分布序于细列菌和的古细长菌基度因组通中。常为21--48bp，重复序列之 gCRpNf1A以间在一线种被设不计同2工于6具C-a：s-97的2方b式p切间割DN隔A。序列(spacer)隔开。CIRSPR通过这些间隔序列 (spacer)与靶基因进行识别。 Cpf1复合物生成的两条链切口是偏移的，在裸露端留下了短悬端（overhang）。
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人类元基因组：与人类共生的全部微生物的基因组总和。
元基因组学
元基因组学 又叫宏基因组学（ Metagenomics),Microbial Environmental Genomics,
背景资料
微生物是地球上生物量（约占总生物量的60%）最大的生物类群， The total number of microbial cells on Earth is estimated to be 1030 (Turnbaugh, P. J., 2008)
1985 年Staley, J. T.,等发现在实验室能够培养的微生物不
元基因组学研究的意义 活性物质－－－酶
元基因组学研究的意义
一些应用
Handelsman及其他研究人员无法在实验室中培育占绝大多数的微生物进行研 究，带回实验室能分离出的往往不是优势微生物，例如：在苹果园里，探明 苹果树中的抗生素失效的原因。
背景资料
基因组（genome）是生物体内遗传信息的集合，是某个特 定物种细胞内全部DNA分子的总和。
基因组学（genomics）是指研究并解析生物体整个基因组 的所有遗传信息的学科。
基因组计划（Genome Project）是指对人类以及其它生物 体全基因组的测序工作(sequencing)。
微生物通过群落而非单一个体来发挥这些重要功能。水体、土壤、肠道和很 多的人工生物环境（如废水处理、食品发酵、堆肥、沼气池，等等）都具有 很复杂的微生物群落，这些微生物相互作用、共同协作，一起完成复杂的代 谢功能及生命活动。
3:筛选获得新型活性物质
元基因组学方法已经应用在ocean surfaces, deep sea vents, hot springs, soil, animal rumen and gut, human oral cavity and intestine等领域。元基因组学在开 发微生物资源多样性、筛选获得新型活性物质、发掘与抗生素抗性、维生素 合成及污染物降解相关的蛋白质等方面展示了很大的潜力。为解决环境、能 源以及健康等几个重大课题提供了一系列的新研究技术和新思路。
本讲座结合微生物所现有相关的仪器设备及基因资源库，主要介绍元因资源库的选择与构建，开发与利用等。
内容提要
元基因的仪器介绍 微生物所现存元基因组库
其次是对于海洋生态与微生物基因组特征的关系，从多个方面已经证实 了微生物在进化中对于环境的适应性可以在基因组中找到印记，如同属 一个种的菌在不同的深度它的基因组有适应性变化（如光能自养菌 MIT9313，MED5，SS120之间对于氮利用基因的差别）；海岸线上的微 生物对于营养物质利用的多种适应性基因组。深海微生物基因组与透光 层对应数据的比较，有较多的趋化因子及主动运输的基因。而少有光合 成有关的基因。
/或测序分析为研究手段, 以微生物多样性、 种群结构、 进化关系、
功能活性、 相互协作关系及与环境之间的关系为研究目的的新的微生
物研究方法
元基因组学方法
环境样品中的微生物组成的群落构成了 一个巨大而复杂的基因库。通过直接从 环境样品中提取全部微生物的基因组 DNA, mRNA，克隆到已经培养驯化的宿 主样品所包含的全部微生 物的遗传组成及其群落功能。
元基因组学研究的意义
理论价值
在海洋微生物对于基于视紫质的光合细菌的发现，确认了微生物在海洋 碳代谢中的重要地位，从而改写了海洋能量循环的通路。（2000， Science)
海洋微生物中厌氧甲烷氧化细菌和硫酸盐还原菌间就存在共生的关系, 并 且它们的相互作用还大大减少了全球甲烷的排放量。（2009，PNAS)
能够代表全部的微生物世界.
1991 年Pace 等人首次提出环境基因组学(Environmental genomics)的概elsman 等首次将“特定小生境中全部微小生物遗 传物质的总和”定义为宏基因组(Metagenome), the genomes of the total microbiota found in nature”
元基因组学研究的意义
1:认识未培养的微生物
目前研究表明：自然环境中90-99.9％的微生物采用现有培养技术是不能够被 培养的，（海水中微生物的可培养性约为0.001％～0.100％、淡水约0.25％、 土壤约0 .3％、活性污泥为1％～1.5％左右，瘤胃约小于10%）
2:研究不同微生物构成的群落及其相互关系,使得认识单元实现从单一基因 到基因集合的转变
Ecogenomics, Community Genomics）它包含了可培养的和未可培养的 微生物的基因, 目前主要指环境样品中的细菌和真菌的基因组总和。
它是采用未培养技术，通过分子生物学手段，绕过对微生物进行菌
种分离纯培养这一步骤，直接对环境中的微生物基因资源进行研究和
开发的一种方法。
以环境样品中的微生物群体基因组为研究对象, 以功能基因筛选和
微生物前期开发国家重点实验室 2012－3－29
微生物所十二讲 测试技术论坛
提纲
直接针对特定生境中宏量生物信息（DNA.mRNA.micRNA.蛋白等）的研 究技术在近年来发展迅速，元基因组技术是重要的基础之一，该技术 通过分析微生物种群生态分布、群体遗传特征、特殊环境微生物资源 及微生物与人类关系等，已经在地球环境气候科学、生物酶资源、人 类健康等方面取得了重要的进展。