脉冲场凝胶电泳(PFGE)
脉冲场凝胶电泳技术用途
脉冲场凝胶电泳技术用途
脉冲场凝胶电泳技术（Pulsed-Field Gel Electrophoresis，PFGE）是一种用于分离和分析大分子DNA的技术。
它利用电场在凝胶中引起的不断变化的方向来分离DNA分子，适用于分析大片段DNA，如整个基因组或染色体。
PFGE技术在生物学和医学领域有着广泛的用途，包括但不限于以下几个方面：
1. 研究基因组结构：PFGE技术可以用于分析和研究细菌、真菌、植物和动物等生物的基因组结构，帮助科研人员了解基因组的大小、形态和结构。
2. 分子生物学研究：PFGE技术可以用于分析DNA的大小和构成，例如在基因克隆、DNA 指纹图谱分析、基因组映射等方面有着重要的应用。
3. 疾病研究：PFGE技术可以用于分析病原微生物（如细菌、真菌等）的基因组，帮助研究人员了解病原微生物的遗传特性、毒力因子等，对于疾病的预防、诊断和治疗有着重要的意义。
4. 分子流行病学：PFGE技术可以用于分析病原微生物的遗传特征，帮助研究人员追踪疾病的传播途径和流行病学特征，对于疾病的控制和预防有着重要的作用。
总的来说，PFGE技术在生物学、医学和疾病研究领域有着广泛的应用，可以帮助科研人员深入了解DNA的结构和功能，从而促进基础科学研究和临床医学的发展。
pfge脉冲场凝胶电泳具体操作
pfge脉冲场凝胶电泳具体操作PFGE（Pulsed Field Gel Electrophoresis）是一种高分辨率的凝胶电泳技术，可用于分离和检测大分子量DNA片段。
该技术常用于研究基因组结构、遗传变异和DNA断裂等领域。
下面将详细介绍PFGE的具体操作步骤。
1. 准备DNA样品:a. 从细胞中提取DNA。
可以使用标准的DNA提取方法，如酚/氯仿法或商用DNA提取试剂盒。
b. 用酶切酶或限制酶对DNA进行切割。
选择使DNA在所需大小范围内切割的酶，以便获得所需的DNA片段。
2. 制备凝胶:a. 准备1% - 2% 的琼脂糖溶胶。
将所需琼脂糖加入TE缓冲液中，并在适当的温度下加热搅拌，直到完全溶解。
b. 将琼脂糖溶胶倒入制作凝胶的模具中。
在模具顶部放置梳子以制作凝胶槽，并确保梳子的位置水平。
c. 让凝胶固化。
根据琼脂糖溶胶中指定的温度和时间，将模具放入冰箱或培养箱中，使凝胶完全固化。
3. 负载和电泳样品:a. 准备DNA样品。
将所需比例的DNA标记物和DNA样品混合，并加入适量的加载缓冲液，如Bromophenol Blue。
b. 用吸管吸取混合物，并将其轻轻注入凝胶槽中的样品孔中。
确保尽量避免气泡进入凝胶槽。
c. 启动电泳。
电泳前，确保样品中有足够的时间固定在凝胶上。
启动电源，并将电流设置为所需的值。
4. 设置电泳条件:a. 选择适当的电泳缓冲液。
常用的电泳缓冲液包括TBE缓冲液（三硼酸钠缓冲液）和TAE缓冲液（乙醋酸/三乙酸片性缓冲液）。
b. 设置电泳条件，如电流密度，脉冲时间和频率等。
这些条件可以根据所研究的DNA分子量和所使用的电泳设备进行调整。
5. 进行电泳:a. 启动电泳设备，确保电泳条件设置正确，并在所需时间内运行电泳。
b. 当电泳结束时，关闭电源，并小心地取出凝胶，以免损坏样品。
6. 可选的染色和可视化:a. 将凝胶放入染色缓冲液中，如溴化乙锭溶液，使DNA可被视觉化。
b. 在染色缓冲液中搅拌凝胶，确保各个区域充分染色。
脉冲场凝胶电泳(PFGE)
普通凝胶电 泳
PFGE
二、PFGE在分子生物学中的应用
在普通的凝胶电泳中，大于10kb的 DNA分子移动速度接近，很难分离形成足 以区分的条带。脉冲场凝胶电泳可以用来 分离大小从10kb到10Mb的DNA分子 。主 要用于基因组DNDR-II脉冲场电泳 仪
脉冲场凝胶电泳
报告人：吉尚雷 2013-03-13
一、原理
常规的电泳采用的是单一的均匀电 场，DNA分子经凝胶的分子筛作用由负 极移向正极。而脉冲场凝胶电泳(Pulse dfield gel electrophoresis，PFGE) 采用 了两个交变电场，即两个电场交替地 开启和关闭，使DNA分子的电泳方向随 着电场的变化而改变。电场方向的交 替改变使大分子DNA得以分离。
伯乐CHEF Maмын сангаасFGE电泳实验过程
胶块的制备
1、取肌肉组织、研磨过滤、细胞计数。 2、将细胞与低熔点琼脂糖混合后加入凝胶模 具中，待凝固后取出。 3、用含有蛋白酶K的裂解液将胶块内的细胞 裂解，释放出DNA. 4，用苯甲基磺酰胺（PMSF）去除蛋白酶K。 5、存贮于0.5M EDTA中半年无降解。
1 PFGE是公认的比较繁琐耗时的技术。一次电泳至少需 要两天时间。 2 电泳带型易受人为等多种因素的影响，需要较高的技 术水平。 3 不能同时优化胶的每个部分的条带分布。 4 不能确切地认为相同大小的条带就是相同的DNA片段。 5 一个酶切位点的变化可能引起不止一个条带的变化。 6 PFGE分型技术在大肠杆菌O157：H7等细菌的分子生 物学分析中得到了广泛的应用。但有些菌种用PFGE是 不可分的。研究人员发现对于有广泛基因重组现象的 细菌，PFGE并不是一个适宜的分子分型工具。
1%的琼脂糖浓度最大可以分离3Mb的DNA 片段 0.5-0.9%的琼脂糖浓度可以分离片段更大的 DNA片段，不过条带很弥散
脉冲场凝胶电泳技术在致病菌分型技术的应用
脉冲场凝胶电泳技术在致病菌分型技术的应用脉冲场凝胶电泳（pulse-field gelelectrophoresis，PFGE），又称脉冲式交变电场电泳，该技术是将电泳电场方向交替性改变，并优化脉冲时间和其他条件，可以分辨凝胶中35～10 000 kb的DNA分子。
该方法应用于分子流行病学中，通过观察电泳条带的差异，为确定菌株之间的亲缘关系提供了可靠的技术手段。
该技术在致病菌溯源（细菌性传染性疾病溯源、细菌性食源性疾病溯源）、医院内感染流行监测等方面都有广泛的应用。
标签：脉冲场凝胶电泳；致病菌分型；致病菌溯源；院感监测[Abstract] Pulsed Field Gel Electrophoresis （PFGE）is a new technique of gelelectrophoresis developed in1980’s. It can be used to separate large DNA molecules ranging from 35 to10 Mb. It has been widely applied to the pathogen molecular typing ，identification of species groups ，Source-tracking of pathogen and nosocomial infection surveillance.[Key words] PFGE；Pathogen molecular typing；Traceability pathogens；Hospital infection surveillance脉冲场凝胶电泳（pulse-field gelelectrophoresis，PFGE），又称脉冲式交变电场电泳，是上世纪80年代后期发展起来的一种新型的电泳技术，主要用来分离大分子量线性DNA。
传统的琼脂糖凝胶电泳技术仅能分离50 kb以下的DNA分子，对于超过50 kb的DNA分子，传统的琼脂糖凝胶其分子筛作用较弱，无法清晰分辨电泳条带[3]。
脉冲场凝胶电泳
脉冲场凝胶电泳脉冲场凝胶电泳近年来，以脉冲场凝胶电泳(Pulsed field gel electrophoresis，PFGE)为代表的分子生物学分型方法日渐受到青睐，其原理为通过一定的方法，直接或间接反映病原体变异分化的本质即DNA序列的改变，从而做到微观变化的宏观显示。
电泳结果通常是条带图谱。
该方法的发展成熟为监测控制细菌的流行提供了广阔的前景。
通过分型可以鉴定比较菌株是否一致，对于细菌性传染病监测、传染源追踪、传播途径调查和识别等暴发调查有着非常重要的意义。
一、脉冲场凝胶电泳的原理PFGE与常规电泳的不同之处在于，常规的电泳采用的是单一的均匀电场，DNA分子经凝胶的分子筛作用负极移向正极。
而PFGE采用了两个交变电场，即两个电场交替地开启和关闭，使DNA分子的电泳方向随着电场的变化而改变。
正是因为电场方向的交替改变，才使大分子DNA得以分离。
图l是根据Carle和Olson最初设计的正交场电泳装置(orth-ogona1 field gel electrophoresis，OFA-GE)绘制的PFGE 示意图。
A、B代表两个交替开启和关闭的电场。
当A电场开启时，B电场关闭，DNA分子从A电场的负极(A-)向正设(A+ )移动；当B电场开启时，DNA分子改变原来的运行方向，随B电场负极向正极移动。
这样，随着电场方向的交替变化DNA分子图1 PGE的原理(OFAGE系统) A、B代表两电场即呈“Z” 字形向前移动。
目前的理论和实验研究表明，当某一电场开启时，DNA分子即顺着此电场的方向纵向拉长和伸展，以“蛇行”(reputation)的方式穿过凝胶孔。
如果电场方向改变DNA分子将必须先调转头来，才能沿着新的电场方向泳动。
这样，随着电场方向反复变化，伸展的DNA分子必须相应地变化移动方向。
可以想象，较小的分子能相当快速地适应这种变化，但大分子则需更多的时间来改变方向，而真正用于前移的时间相对减少，从而将不同大小的分子分开。
BIO-RAD脉冲场电泳介绍
﹡这一独具的高分辨力使PFGE的应用范围已涉及到几乎所有生 物基因组结构的研究。
脉冲场电泳（PFGE）的原理
PFGE的原理
PFGE的基本原理是对琼脂糖凝胶外加交变的脉冲电场,其方向 、时间和电流大小交替改变,每当电场方向发生改变时,大分子DNA 便滞留在凝胶孔内,直至沿新的电场轴重新定向后,才能继续向前泳 动,DNA分子越大,这种重新定向需要的时间就越长,当DNA分子改 变方向的时间小于脉冲时间时,DNA就可以按照其分子量大小分开, 经EB染色后在凝胶上出现按DNA大小排列的电泳带型。
一、PFGE在分子分型方面的应用 通过微生物分型可以鉴定菌株是否一致、比较它们的亲缘
关系,对于细菌性传染病的监测、传染源追踪、传播途径的调查 和识别有着非常重要的意义。
传统的微生物分型技术主要是基于表型特性分类,如生化分 型(biotyping)、血清学分型(serotyping)、耐药谱测定(antmi icrobial susceptibility testing)、噬菌体分型(bacterialphage typing) 等。由于微生物易受环境的影响,很容易改变其表达性状,使得表 型分类很不准确。
CHEF-DR III
脉冲场电泳系统的配件
脉冲场电泳（PFGE）的实验流程
Cultured Cells
Unicellular Organisms
Harvest Cells
Tissues
Dissociate
Wash Cell Suspension
Determine Cell Concentration Resuspend to needed Concentration
pfge原理
pfge原理PFGE原理是一种分子生物学技术，全称为脉冲场凝胶电泳（Pulsed-Field Gel Electrophoresis），它是一种分离和分析DNA片段的方法，可以将大片段的DNA分子从凝胶中分离出来，从而进行电泳分析。
1. 原理PFGE的原理在于凝胶中应用交错电场，使DNA的运动方向变化，从而使大分子量DNA可以被更好的分离。
首先，DNA被切成片段，并在凝胶中进行电泳分离。
PFGE所采用的凝胶是一种“交错”的凝胶，即在不同方向上阻碍电泳运动的纤维素。
在电场中，DNA分子因为其大小、形状和电荷密度不同而负载不同的电荷，向着凝胶的两个端点移动。
在PFGE过程中，电场方向会不断改变，这种改变可以使大分子量DNA分子在不同方向上进行运动。
一次分离过程通常持续16小时以上。
2. 应用PFGE技术是目前常用的DNA分子分离技术之一，其应用范围广泛，主要用于以下领域：（1）遗传学研究：PFGE技术可以帮助了解基因组结构和动态变化，尤其是在菌群的基因组研究中，PFGE技术具有重要作用。
（2）食品安全检测：PFGE技术可以用于食品安全检测，例如细菌的分离和鉴定，食品中微生物的种类、数量及分布等的研究。
（3）医学研究：PFGE技术在医学领域中有广泛应用，比如可以用来检测癌症等重大疾病，检测病原体和细菌的快速鉴定等。
3. 优势相较于常规的DNA电泳，PFGE技术有以下几点优势：（1）可以分离大分子量的DNA分子，比如细菌的染色体DNA。
（2）可以提高DNA分离的分辨率，从而更准确地分析DNA的结构和变异情况。
（3）PFGE的原理可以单独分离DNA分子，使处理比较麻烦的DNA成为可能，比如重复序列等。
总之，PFGE技术在现代生命科学中已经成为了不可或缺的基础技术之一。
通过PFGE技术，我们可以更好地理解细胞DNA的组成和结构，同时对食品和医学工作中的研究也有着巨大的帮助作用。
脉冲场凝胶电泳的原理
改变脉冲时间
分离不同大小DNA
电压
最常用的电压是6V/cm，低电压时，迁移率与电 压成正比，想分离大分子DNA时一般选用低电压 和延长脉冲时间
脉冲角度
随着角度的减小，较大的片段分离的更好，较小的片段分 离的效果降低。
注意事项
蠕动泵的流速：电泳过程中，控制好蠕动泵的流速， 一般控制在50-70左右，以免速度太快，使胶在溶液中 移动。
冷却泵的开启：冷却泵开启时，一定要把蠕动泵打开， 以避免冷却泵管道内的溶液因为过度制冷，凝结成冰 块而堵塞管道。
电泳结束后，应及时取出凝胶，进行染色等操作，以 避免因为时间太长，而造成条带的弥散。Biblioteka 可能遇到的问题以及解决方法
凝胶在缓冲液中漂浮---蠕动泵的速度太快或太慢， 请调到合适的速度。
缓冲液不流动或流速慢---检查冷却泵：当冷却泵制 冷时，如果蠕动泵没有开，会造成管道内结冰，导 致管道堵塞。
电泳条带扭曲---因为流速太低，导致制冷不充分， 或不均一 、缓冲液体积必须大于2.2 L
缓冲液和温度
温度越高，DNA移动速度越快，但是条带的 清晰度和分辨力明显下降。温度过高会导致 DNA带变形或解链。
最佳电泳温度是14 ℃
最常用的电泳液是 0.5x的TBE buffer，有时 也可以用1.0x的TAE buffer代替
脉冲时间
当电场方向发生改变, 大分子的DNA 便滞留在胶孔中, 直 至沿新的电场重新定向后, 才能继续向前移动,大分子DNA 重新定向需要的时间长
脉冲场凝胶电泳 (Pulsed Field Gel Electrophoresis ,PFGE)
脉冲场凝胶电泳.
脉冲场凝胶电泳(PFGE实验原理、操作步骤和注意事项【实验原理】大分子DNA(一般长度超过20kb ，在某些情况下，超过40kb 在电场作用下通过孔径小于分子大小的凝胶时，将会改变无规卷曲的构象，沿电场方向伸直，与电场平行从而才能通过凝胶。
此时，大分子通过凝胶的方式相同，迁移率无差别(也称“极限迁移率”，不能分离。
脉冲场凝胶电泳技术解决了这一难题，它应用于分离纯化大小在10～2000kb 之间的DNA 片段。
这种电泳是在两个不同方向的电场周期性交替进行的，DNA 分子在交替变换方向的电场中作出反应所需的时间显著地依赖于分子大小，DNA 越大，这种构象改变需要的时间越长，重新定向的时间也越长，于是在每个脉冲时间内可用于新方向泳动的时间越少，因而在凝胶中移动越慢。
反之，较小的DNA 移动较快，于是不同大小的分子被成功分离。
在许多实用的PFGE 方法中，倒转电场凝胶电泳是最简单最常用的方法(FIGE。
通过把一个在不同电场方向有不同脉冲方式的脉冲电场加在样品上，倒转电场凝胶电泳(FIGE设备能把大小范围在10～2000kb 的DNA 片段分开。
FIGE 也可通过重新确定一个对准完全固定好角度的电场，这样会进一步扩展其分离极限达到10Mb 。
【仪器、材料与试剂】1. 制备DNA 样品所需材料1TEN 缓冲液(0.1mol/LTris，pH7.5；0.15mol/LNaCl；0.1mol/LEDTA。
2Seaplaque 琼脂糖(EC 缓冲液中浓度为2%。
3EC 缓冲液(6mol/LTris，pH7.5；lmol/L NaCl；0.5%4ESP 缓冲液(0.5mol/L EDTA，1%十二烷基肌氨酸钠，lmg/mL 蛋白酶K 。
5 溶葡萄球菌素(5mg/mL。
6RNase(10mg/mL。
7 胶模(由常规琼脂糖凝胶制得或购买成品。
8 苯甲基横酰氟(PMSF(17.4mg/mL 于乙醇中。
90.5μg/mL 溴化乙锭2. 分离、纯化大的DNA 片段所需材料1 紫外递质。
脉冲场凝胶电泳
脉冲场凝胶电泳
脉冲场凝胶电泳（Pulsed Field Gel Electrophoresis，PFGE）是一
种常用于分析测定大分子量DNA分子种类、外源DNA同源度、DNA长度等
实验的灵敏度相当高的一种电泳技术。
该技术是利用 DNA 分子在脉冲场
条件下的电泳运动，将不同类型的 DNA 集合体根据其分子质量分离而得
到细菌的 DNA 指纹图谱，从而用于基因检测、基因定位、系统发育研究、菌种识别、菌群分析、植物起源及食品安全检测等领域。
其实验原理是在
原电泳的基础上，增加了两个梯度磁场，形成脉冲场条件下，DNA 分子会
从均匀电荷有序分布转变为非均匀电荷分布，在脉冲场条件下，它会产生
不均匀向偏冲，从而实现对 DNA 集合体的分离，再加上同时对 DNA 分子
进行大量的微量操纵，有效的分离了DNA分子，使它们能够产生端粒酶消
化片段，最终可以经过比较求得大分子量DNA分子种类，外源DNA同源度、DNA长度等实验结果。
脉冲场凝胶电泳
脉冲场凝胶电泳近年来，以脉冲场凝胶电泳(Pulsed field gel electrophoresis ，PFGE)为代表的分子生物学分型方法日渐受到青睐，其原理为通过一定的方法，直接或间接反映病原体变异分化的本质即DNA 序列的改变，从而做到微观变化的宏观显示。
电泳结果通常是条带图谱。
该方法的发展成熟为监测控制细菌的流行提供了广阔的前景。
通过分型可以鉴定比较菌株是否一致， 对于细菌性传染病监测、传染源追踪、传播途径调查和识别等暴发调查有着非常重要的意义。
一、脉冲场凝胶电泳的原理PFGE 与常规电泳的不同之处在于，常规的电泳采用的是单一的均匀电场，DNA 分子经凝胶的分子筛作用由负极移向正极。
而PFGE 采用了两个交变电场，即两个电场交替地开启和关闭，使DNA 分子的电泳方向随着电场的变化而改变。
正是因为电场方向的交替改变，才使大分子DNA 得以分离。
图l 是根据Carle 和Olson最初设计的正交场电泳装置(orth-ogona1field gel electrophoresis ，OFA-GE)绘制的PFGE 示意图。
A 、B 代表两个交替开启和关闭的电场。
当A 电场开启时，B 电场关闭，DNA 分子从A 电场的负极(A-)向正设(A+ )移动；当B 电场开启时，DNA 分子改变原来的运行方向，随B 电场由负极向正极移动。
这样，随着电场方向的交替变化DNA 分子 即呈“Z” 字形向前移动。
目前的理论和实验研究表明，当某一电场开启时，DNA 分子即顺着此电场的方向纵向拉长和伸展，以“蛇行”(reputation)的方式穿过凝胶孔。
如果电场方向改变 DNA 分子将必须先调转头来，才能沿着新的电场方向泳动。
这样，随着电场方向反复变化，伸展的DNA 分子必须相应地变化移动方向。
可以想象， 较小的分子能相当快速地适应这种变化，但大分子则需更多的时间来改变方向，而真正用于前移的时间相对减少，从而将不同大小的分子分开。
脉冲场凝胶电泳
脉冲场凝胶电泳
脉冲场凝胶电泳（Pulse Field Gel Electrophoresis, PFGE），是一种通过交替改
变电场方向和大小等参数，使得大分子DNA在凝胶中得到更好的分离的电泳技术。
该技术
主要依靠电场对DNA分子的移动与定向拉伸，通过一系列的脉冲场控制形成脉冲态运动，
使DNA分子得到更广泛的电泳分离。
在经过凝胶电泳之后，得到的分离图谱呈现出一组带状分布的DNA分子，每条带都代
表着分子的大小。
DNA分子越大，迁移的速率就越慢，因此大的分子在凝胶上迁移的距离
要比小的分子短。
这个技术被广泛应用于基因编辑、基因检测和病原体的快速分型等领域。
实验中，将DNA分子高压加在凝胶中，通过影响电场的大小和方向，脉冲场凝胶电泳
可以将DNA分子拉伸成一系列不同长度的线条。
接下来应该是经过染色或者转移等方法，
对凝胶进行图像处理，得到DNA分子的带状图谱。
带状图谱中，每一条带代表一个不同的DNA分子长度，因此可以确定DNA的大小。
根据带的数量、大小和密度等参数，可以进一
步区分样品中不同的DNA分子。
需要注意的是，PFGE并不能很好地分离具有相同长度的DNA分子，因为它们将聚集成一个带状图。
但总的来说，PFGE是一种用于高分辨率DNA分离的强大工具，已被广泛用于研究多种生物学和医学问题，例如：身份鉴定、结构基因组学、基因突变分析等。
脉冲场凝胶电泳技术
5、 把梳子平放在胶槽上，把胶块加在梳子齿上。 如果用的是10个齿的梳子，把标准菌株H9812加在 第1、5、10个齿上。 6、 用吸水纸的边缘吸去胶块附近多余的液体，在 室温下风干约3分钟。 7、 把梳子放入胶槽，确保所有的胶块在一条线上， 并且胶块与胶槽的底面相接触。从胶槽的下部中央 缓慢到入100ml熔化的在55℃－60℃平衡的1％ SKG。避免气泡的生成；如果有，用枪头消除。在 室温下凝固30分钟左右。 8、 记录加样顺序。
多余的部分。
5、 保证胶块在液面下而不在管壁上。
6、 将管子放在54℃水浴摇床中孵育2小时，转速
约170转/分钟。
7、 将纯水和TE放在50℃水浴摇床中预热。
三、洗胶块 1、 从水浴摇床中拿出screw-cap管，盖上绿色的 screened-cap。轻轻倒掉CLB。在实验台上轻磕管 底使胶块落在管底。 2、 每管中加入15ml预热的纯水。 3、 确保胶块在液面下而不在管壁或盖子上，放回 50℃水浴摇床中，摇10分钟。 4、 倒掉水，用纯水再洗一次。 5、 倒掉水，加入15ml预热的TE，在50℃的水浴 摇床中摇15分钟。 6、 倒掉TE，用TE重复洗三次，每次10－15分钟。 7、 倒掉TE，加入10ml TE，放在4℃冰箱保存备 用。
四、胶块内DNA的酶切 1、 在1.5ml eppendorf管上标记好相应的样品及 H9812的名称。 2、 按照下面的比例配制缓冲液H的稀释液，混匀。 试剂 µl/胶块 µl /10胶块 纯水 180µl 1800µl Buffer D 20µl 200µl 总体积 200µl 2000µl 注意：缓冲液要置于冰上。
调整至3.6~4.5。如果OD值大于4.5，加入CSB稀释；如果
脉冲交变电场凝胶电泳
脉冲交变电场凝胶电泳脉冲交变电场凝胶电泳（PulseFieldGelElectrophoresis，简称PFGE）是一种常用的分子印迹技术，可以分析出微生物类群的分子细胞分子量和电泳结构。
PFGE是由威廉S克莱因爵士（William S. Klein）于1989年发明的，也是当今最为重要的遗传技术之一。
它利用了由一个或多个可改变的电场来引导DNA链在凝胶电泳中运动，这种可改变的电场交替变化，称为脉冲(Pulse)。
PFGE首先使用聚合物凝胶将所要分析的DNA片段缓慢拉伸，然后将拉伸的DNA片段注入凝胶电泳板。
在凝胶电泳过程中，DNA片段会被拉伸，形成一条宽的“蛇形”DNA条带，可以被精确测定。
脉冲场电泳技术将电场脉冲应用到凝胶电泳中，可以改变凝胶电泳速度，使DNA片段在凝胶中移动，从而分离出小片段，有利于进一步改善结果的质量和精确度。
PFGE技术可以分离出不同的DNA片段，可以用来评估微生物的分子多样性、物种的分子变异和群体的遗传多样性。
它可以用于研究病原体的分子结构和多样性，包括疾病的基因分型、抗药突变类型等，也可以用于家系遗传研究、基因库构建、病毒检测等。
PFGE技术可以以高精度、快速、简便的方式，实现病原体和分子结构的高精度分析，是病原体研究比较可靠的技术。
此外，PFGE技术还可以用于肿瘤基因突变检测、遗传学计算机模拟和基因芯片验证等，它可以提供快速、精确、可靠的分子诊断，更有利于科学家们认识病毒、病原体和细胞免疫力的结构。
脉冲交变电场凝胶电泳的关键技术，主要是电泳温度的控制和脉冲电场的调制，使之能够实现精准的DNA分离。
首先，PFGE实验仪会将温度保持在室温的一定程度，使得DNA能够在芯片凝胶中热性解析，实现最佳的分离结果。
其次，PFGE设备还需要使用脉冲交变电场电泳分离DNA片段，将电场脉冲应用到凝胶电泳中。
这样，就可以有效防止微生物病毒的拉伸，改善凝胶电泳结果的质量和精确性。
PFGE技术已经广泛应用于预防医学、兽医学和细胞遗传学的众多领域。
脉冲场凝胶电泳.
脉冲场凝胶电泳(PFGE实验原理、操作步骤和注意事项【实验原理】大分子DNA一般长度超过20kb，在某些情况下，超过40kb在电场作用下通过孔径小于分子大小的凝胶时，将会改变无规卷曲的构象，沿电场方向伸直，与电场平行从而才能通过凝胶。
此时，大分子通过凝胶的方式相同，迁移率无差别(也称“极限迁移率”，不能分离。
脉冲场凝胶电泳技术解决了这一难题，它应用于分离纯化大小在10〜2000kb之间的DNA片段。
这种电泳是在两个不同方向的电场周期性交替进行的，DNA 分子在交替变换方向的电场中作出反应所需的时间显着地依赖于分子大小，DNA 越大，这种构象改变需要的时间越长，重新定向的时间也越长，于是在每个脉冲时间内可用于新方向泳动的时间越少，因而在凝胶中移动越慢。
反之，较小的DNA移动较快，于是不同大小的分子被成功分离。
在许多实用的PFGE方法中，倒转电场凝胶电泳是最简单最常用的方法(FIGE。
通过把一个在不同电场方向有不同脉冲方式的脉冲电场加在样品上，倒转电场凝胶电泳(FIGE 设备能把大小范围在10〜2000kb 的DNA 片段分开。
FIGE 也可通过重新确定一个对准完全固定好角度的电场，这样会进一步扩展其分离极限达到10Mb 。
【仪器、材料与试剂】1. 制备DNA 样品所需材料1TEN 缓冲液(0.1mol/LTris ，pH7.5；0.15mol/LNaCl ；0.1mol/LEDTA。
2Seaplaque 琼脂糖(EC 缓冲液中浓度为2%。
3EC 缓冲液(6mol/LTris ，pH7.5；lmol/L NaCl ；0.5%4ESP缓冲液(0.5mol/L EDTA，1%十二烷基肌氨酸钠，Img/mL蛋白酶K。
5 溶葡萄球菌素(5mg/mL。
6RNase(10mg/mL。
7 胶模( 由常规琼脂糖凝胶制得或购买成品8 苯甲基横酰氟(PMSF(17.4mg/mL 于乙醇中。
90.5匕g/mL溴化乙锭2. 分离、纯化大的DNA 片段所需材料1 紫外递质。
脉冲电场凝胶电泳及其应用
脉冲电场凝胶电泳及其应用脉冲电场凝胶电泳（Pulsed-field Gel Electrophoresis，简称PFGE）是一种高分辨率的凝胶电泳技术，广泛应用于基因组学、分子流行病学和疾病诊断等领域。
本文将介绍脉冲电场凝胶电泳的原理、实验步骤以及其在不同领域的应用。
一、原理脉冲电场凝胶电泳是基于传统凝胶电泳的基础上发展起来的一种技术。
其原理是利用不同方向的电场脉冲交替作用于DNA分子，使得DNA在凝胶中的运动方向改变，从而提高了分离效果。
在脉冲电场凝胶电泳中，常用的凝胶材料是琼脂糖凝胶或聚丙烯酰胺凝胶。
DNA样品首先经过酶切或限制性内切酶切割，然后将切割后的DNA片段进行电泳分离。
脉冲电场通常是由两个方向的电场脉冲交替作用产生的，这样就使得DNA在凝胶中呈现交错状的运动轨迹。
通过调整电场的强度和方向，可以实现对DNA片段的高效分离。
二、实验步骤脉冲电场凝胶电泳的实验步骤包括样品制备、琼脂糖凝胶制备、电泳条件设置和电泳结果分析等。
1. 样品制备：将待测DNA样品进行切割或限制性内切酶切，得到DNA片段。
2. 琼脂糖凝胶制备：将琼脂糖加热至溶解，然后冷却至约60°C左右，加入缓冲液和DNA样品，混合均匀后倒入电泳槽中。
3. 电泳条件设置：根据实验需要，设置电场的强度和方向。
通常情况下，电场强度为6 V/cm至8 V/cm，电泳时间为16小时至20小时。
4. 电泳结果分析：将凝胶取出，进行染色或杂交等处理后，通过紫外光照射或激光扫描等方式观察和记录DNA分子的迁移情况。
三、应用脉冲电场凝胶电泳在基因组学、分子流行病学和疾病诊断等领域具有广泛的应用。
1. 基因组学：脉冲电场凝胶电泳可用于基因组的拓扑结构研究、基因重排分析、基因突变检测等。
例如，通过脉冲电场凝胶电泳可以分析染色体的大小、数目和结构等信息，从而揭示基因组的组织和功能。
2. 分子流行病学：脉冲电场凝胶电泳可以用于病原微生物的分子流行病学研究。
副溶血弧菌脉冲场凝胶电泳(PFGE)标准操作方案
酶 NotI（10U/µl） 4µl 总体积 200µl
9、
每管加入 200µl 混合液，轻轻在实验台上磕管子的底部，确保胶块在液面 的下面。
10、
在 50℃水浴中孵育至少 4 小时，H9812 的胶块放在 37℃水浴中孵育至少 2 小时。 灌制电泳胶
1、 打开水浴箱，温度调至 55-60℃。 2、 配制 2200ml 的 0.5×TBE。 3、 用 0.5×TBE 配制 1%SeaKem Gold(SKG)胶。 14cm 宽电泳胶框（10-15 加样孔） ：1.0gSKG 胶溶于 100ml0.5×TBE 中； 21cm 宽电泳胶框（≥15 加样孔） ：1.5gSKG 胶溶于 150ml0.5×TBE 中。 4、 熔化时，微波加热 60 秒，混合；每隔 15-30 秒重复一次，直到胶完全熔化。 放在 55-60℃水浴备用（温度至少平衡 30 分钟以后使用） 。 5、从 37℃水浴中取出酶切完的胶块，平衡到室温。 6、用枪头吸出酶切混合液，避免损伤或吸出胶块。 7、每管加入 200µl 0.5×TBE, 室温平衡 5 分钟。 8、安装胶槽，调整梳子高度，使梳子齿与胶槽的底面相接触。用水平仪调整胶 槽使其水平。 9、 把梳子平放在胶槽上， 把胶块加在梳子齿上。 把标准菌株 H9812 加在第 1、 5、 10 个齿上（10 齿梳子）或第 1、5、10、15 个齿上（15 齿梳子） 。 10、用吸水纸的边缘吸去胶块附近多余的液体，在室温下风干约 3 分钟。 11、把梳子放入胶槽，确保所有的胶块在同一条直线上，并且胶块与胶槽的底面 相接触。从胶槽的下部中央缓慢到入熔化的在 55℃－60℃平衡的 1％SKG。避免 气泡的生成；如果有，用枪头消除。在室温下凝固 30 分钟左右。 12、记录加样顺序。
BIO-RAD脉冲场电泳介绍
– Cluster according to similarity of pattern
Dice (Opt:1.50%) (Tol 1.5%-1.5%) (H>0.0% S>0.0%) [0.0%-100.0%]
PFGE-XbaI
PFGE-XbaI
80 100
.E2003002160 .E2003002977 .E2003002278 .E2003002247 .E2003002231 .E2003002306 .E2003002276 .E2003002366 .E2003002399 .E2003002778 .E2003002827 .E2003002828 .E2003003026 .E2003002033
缺少病原体历史数据、成本高
1.表型和分子分型各有优缺点；对于罕见血清型菌株，表型可发挥重要作用 2.分子分型的方法各有优缺点，各有适用性，联合使用是主流 3.实验方法和结果的质量保证是任何分析网络的最关键部分
脉冲场电泳（PFGE）的应用——分子分型
• PFGE分型技术因其重复性好、分辩力强被誉为细菌分子分 型技术的“金标准”,并推荐作为金黄色葡萄球菌等病原微 生物分型的标准技术。 • PFGE分型技术的不足是:耗时,需要2~4 d的样品制备时间;设 备价格昂贵；对分析大小相似的片段分辨力不是很高。 • 目前,美国PulseNet已创建病原菌PFGE图谱数据库,通过与数 据库中病原菌PFGE图谱的比较,可以判断菌株间染色体 DNA的相似程度。
Mix cells with Low Melt agarose and harden in mold (be sure to use certified agarose when doing restriction digestions)
BN软件分析PFGE
BN软件分析PFGE脉冲场凝胶电泳（PFGE）是一种高度区分性的分子分型技术，是一种分离大分子DNA或者染色体的方法。
PFGE是基于大的DNA限制性片段在交替极性的电场中的可变迁移的原理。
在脉冲场凝胶电泳中，电场不断在两种方向（有一定夹角，而不是相反的两个方向）变动。
DNA分子带有负电荷，会朝正极移动。
相对较小的分子在电场转换后可以较快转变移动方向，而较大的分子在凝胶中转向较为困难。
因此小分子向前移动的速度比大分子快。
然后通过比较任何两个分离株的指纹图谱，可以研究它们是否属于同一菌株（即两个分离株是克隆的）或在遗传上不相关。
PFGE在国际监测网络（例如PulseNet）中的使用以及在重要食源性病原体（大肠杆菌，李斯特菌，弯曲杆菌等）的标准流程中的使用，促进了该技术的采用。
尽管可以使用最新的分型方法，但PFGE仍然是许多国家和国际监测程序中的金标准。
在实践中，将经过研究的分离株的标准化细胞悬液包埋在琼脂中，以增强该过程中的DNA稳定性。
然后裂解细菌细胞，并通过宏观限制性分析产生细菌染色体的大片段。
在电泳过程中使用交替极性的电场分离DNA片段，然后得到图谱并记录指纹文件。
BioNumerics使用行业领先的数据库引擎Oracle，可以将所有流行病学信息和凝胶图像存储在一个数据库中。
使用便捷的向导可以定义新的指纹类型，选择最佳设置以进行标准化、分辨率、背景消除、平滑和条带查找。
BioNumerics软件提供了用于分析PFGE指纹数据的集成平台。
通过轻松简单的拖放，将指纹数据链接到BioNumerics数据库中的分离株。
只需单击几下鼠标即可创建数据比较：一个可帮助您使用BioNumerics丰富的统计工具集来计算相似度矩阵和树状图的向导：包括基于条带的相似系数：Jaccard、Dice、Jeffrey's X、Ochiai、不同条带的数量。
在各种聚类分析方法之间进行选择：UPGMA、Ward、邻位相邻、单链接、完整链接、创建图。
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脉冲场凝胶电泳（PFGE）的原理大致为：
细菌包埋于琼脂块中，用适当的内切酶在原位对整个细菌染色体进行酶切，酶切片段在特定的电泳系统中通过电场方向不断交替变换及合适的脉冲时间等条件下而得到良好的分离。
PFGE中内切酶的选用至关重要，所采用的内切酶常为寡切点酶（low frequency cleavagerestric-tionendoucleases），这种酶切后的片段少而大，适合于作PFGE电泳。
McCllelland等通过对细菌的PFGE电泳图谱的内切酶的选择研究发现，四核苷酸CTAG在许多GC含量>45%的细菌染色体中是很少见的，在他们所试验的16个细菌的染色体中，被1个或多个可识别CTAG位点的内切酶酶切，每100000bps中不到一次，这些酶的识别序列分别为：XbaⅠ（TCTAGA），SepⅠ（ACTAGT），AvrⅡ（CCTAGG）和NheⅠ（GCTAGC）。
同样地，在许多含G+C<45%的基因组，CCG和CGG更少。
这样用SmaⅠ（CCCGGGG）、R srⅡ（CGGWCGG）、NaeⅠ（GCCGGC）和SacⅡ（CCGCGG）进行酶切，对产生平均超过100000bps片段是非常合适的。
对PFGE结果的观察，可因不同研究者而出现较大差异，据此，Tenover等经过多年的研究提出了PFGE的解释标准：
(1)相同（indistinguishable）：酶切图谱间有同样的条带数，且相应条带大小相同，流行病学上则认为相同，这种经PFGE证实的结果，用其它方法检测不可能显示实质性的差异。
(2)紧密相关（closelyrelated）：PFGE试验中，其它克隆株与暴发克隆株有一致的单一基因事件的改变，如点突变、插入或DNA缺失。
典型的情况下，这种变化可导致2～3条带的差异，当一些分离菌株被多次重复培养或自同一病人多次分离时可观察到这种现象。
(3)可能相关（possiblyrelated）：两个独立的基因情况所致的一致的差异，如出现了4～6条带差异，此时能用简单的插入或DNA缺失或限制性位点的获得或缺失来解释。
这些菌株与暴发株间遗传基因不紧密相关，流行病学上也不大可能相关，在长于6个月时间及大范围的暴发中收集的菌株可出现这类情况。
(4)不相关（unrelated）：1个分离菌株通过3个更多个独立的基因事件所致的一致的改变，其PFGE图谱与暴发克隆株样式不同，则可认为与暴发克隆株不相关（一般总有7个或更多个条带的差异）。
典型情况下，这一分离株常只有少于50%的良好的分离的片段出现在暴发株图谱样式中。