5.3血红蛋白的提取与分离(组内公开课)

③ SDS作用
消除净电荷对迁移率的影响 SDS所带负电荷的量大大超过了蛋白质分子原 有电荷量。因而掩盖了不同种电荷间的电荷差 别，使电泳迁移率完全取决于分子的大小。
一、基础知识 为了消除静电荷对迁移率的影响可以在凝 胶中加入( SDS )。SDS能使蛋白质发生完 全变性。由几条肽链组成的蛋白质复合体 在SDS的作用下会解聚成单条肽链，因此 测定的结果只是( 单条肽链的分子量 )。
根据蛋白质各种特性的差异，如分子的 形状和大小、所带电荷的性质和多少、 溶解度和吸附的性质和对其他分子的亲 和力等等，可以用来分离不同蛋白质。
思考3 高温灭菌和酒精灭菌分别利用蛋白质 的何种作用，作用结果是什么被破坏？
变性、变性、空间结构
思考4 人们用鸡的红细胞提取DNA，用人 的红细胞提取血红蛋白的原因是什么？ 鸡的红细胞具有细胞核，含有DNA， 便于进行DNA的提取，人的红细胞无 细胞核，结构简单，血红蛋白含量丰 富便于提取血红蛋白。
二、实验操作 1.样品处理 (3)分离血红蛋白溶液
红细胞 混合液 高速离心 10min
脂类物质 有机溶剂
滤纸 过滤
离心管
烧杯
血红蛋白
二、实验操作 1.样品处理 (4)透析(粗提取） 透析袋 取( 1 )ml的血红蛋白溶液装入（ ） 中，将透析袋放入盛有300ml的物质的量 浓度为20mmol/L的（磷酸缓冲液 ）中， pH为（ 7.0 ），透析12小时，目的是 （除去样品中分子量较小的杂质 ）或用 于更换样品中的（ 缓冲液 ）。透析袋一 般用硝酸纤维素制成，又称玻璃纸。
血浆 红细胞 红细胞
搅拌10min
重复洗涤3次，直至上清液没有黄色
二、实验操作 1.样品处理 (2)血红蛋白的释放 加（ 蒸馏水 ）到（ 原血液 ）体积， 再加40％体积的（ 甲苯 ）（ 溶解细胞 膜） ，置于（ 磁力搅拌器 ）上充分搅拌 10分钟（加速细胞破裂）, 细胞破裂释放出 血红蛋白.
使红细胞大量吸水胀裂 蒸馏水的作用是______________________________ 。
一、基础知识
一、基础知识
思考：在血红蛋白整个实验室中用的缓冲 液是什么？它的目的是什么？
使用的是磷酸缓冲液，目的是利用缓冲 液模拟细胞内的PH环境，保证血红蛋白 的正常结构和功能，便于观察（红色） 和材料的科学研究（活性）
一、基础知识 （四）蛋白质分离方法2：电泳法
电泳：带电粒子在电场的作用下发生迁移的过程 1）原理： 不同蛋白质的带电性质（正电荷或负电荷）、 电量、形状和大小不同，在电场中受到的作用 力大小、方向、阻力不同，导致不同蛋白质在 电场中的运动方向和运动速度不同。
2.纯化：凝胶色谱法 1）凝胶色谱柱的制作 ①取长40厘米，内径1.6厘米的玻璃 管，两端需用砂纸磨平。 ②底塞的制作：打孔 挖出凹穴 安装移液管头部 覆盖尼龙网，再用100 目尼龙纱包好。 a、选择合适的的橡皮塞，中间打孔； b、在橡皮塞顶部切出锅底状的（ 凹穴）， 在0.5ml的（ 移液管 ）头部切下（ 5cm ） 长的一段，插入橡皮塞孔内，上部不得超过 橡皮塞的凹穴底面。
思考 血红蛋白是有色蛋白，因此在凝胶色谱 分离时可以通过观察颜色来判断什么时 候应该收集洗脱液。这使血红蛋白的分 离过程非常直观，大大简化了实验操作。
思考
血红蛋白提取和分离的程序可分为四大步， 包括：样品处理、粗分离、纯化和纯度鉴定。 首先通过洗涤红细胞、血红蛋白的释放、离 心等操作收集到血红蛋白溶液，即样品的处 理；再经过透析去除分子量较小的杂质，即 （ 样品的粗分离 ）；然后通过凝胶色谱法 将相对分子质量较大杂质蛋白除去，即样品 的（ 纯化）；最后经聚丙烯酰胺凝胶电泳进 行（ 纯度鉴定 ）。
大分子通过多孔凝胶颗粒的间隙，路程短，流动快 小分子穿过多孔凝胶颗粒的内部，路程长，流动慢
混合物 上 柱
洗 脱
大分子流动快 小分子流动慢
收 集 大分子
收 集 小分子
洗脱：从色谱柱上端不断注入缓冲液， 促使蛋白质分子的差速流动。
一、基础知识
一、基础知识 （三） 缓冲溶液： 1、概念：在一定的范围内，能对抗外 来少量强酸、强碱或稍加稀释不引起溶液 PH发生明显变化的作用叫做缓冲作用，具 有缓冲作用的溶液叫做缓冲溶液。
溶解红细胞的细胞膜 加入甲苯的作用是____________________________ 。
加速红细胞的破裂 充分搅拌的目的是____________________________ 。
二、实验操作 1.样品处理
(3)分离血红蛋白溶液 将搅拌好混合液转移到离心管内，以 2000r/min的速度离心10 min ，试管中的溶 液分为4层:
2.纯化：凝胶色谱法
2.血红蛋白纯化：凝胶色谱法 ③顶塞的制作： 插入安装了玻璃管的橡皮塞 ④组装：将上述三者按相应位置组装成一 个整体。 ⑤安装其他附属结构。
2.纯化：凝胶色谱法 2）凝胶色谱柱填料的处理 （1）凝胶的选择： （ 交联葡聚糖凝胶 ）（G-75） “G”表示凝胶的交联程度，膨胀程度 及分离范围。 75表示凝胶的得水值，即每克凝胶 膨胀时吸水7.5克。 （2）方法： 配置凝胶悬浮液：计算并称取一定量 的凝胶浸泡于（蒸馏水 ）中充分溶胀后， 配成（ 凝胶悬浮液 ）。
思考：蛋白质为什么带有电荷？ 在一定的PH下，蛋白质可解离的基团会带上电荷
一、基础知识
2）影响蛋白质分子运动速度的因素
影响蛋白质分子运动速度的因素
决定 运动方向
电荷性质
电场 作用力
√
形成 阻力
决定 运动速率
√ √ √
√
√ √
电荷量 分子形状 分子大小
一、基础知识
3）常见方法
琼脂糖凝胶电泳和聚丙稀酰胺凝胶电泳
二、实验操作－－实验步骤 注意事项
血液组成成分 1、样品 处理 （1）洗 涤 红 细 胞 （2）释放血红蛋白 （3）分离血红蛋白
2、粗分离 3、纯化
4、纯度鉴定
（4）透析血红蛋白
凝胶色谱法进Baidu Nhomakorabea纯化
SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定血红蛋白纯度
二、实验操作
1.样品处理
血浆
血 液 血细胞
水分 固体物质
白细胞 血小板 两个a－肽链 血红 红细胞 蛋白 两个β一肽链 （最多） （ 90％ ） 共四条肽链
一、基础知识： ㈠ 蛋白质分离原理
蛋白质提取与分离的依据－－
蛋白质的物理化学性质差异：
1.分子的形状、大小 2.电荷性质和多少 3.溶解度
4.吸附性质
5.对其他分子亲和力
思考1 分离生物大分子的基本思路是什么？ 选用一定的物理或化学的方法分离具有 不同物理或化学性质的生物大分子。
思考2 蛋白质的分离和提取的原理是什么？
4）样品加入与洗脱
①加样前
打开下端出口，使柱内凝 胶面上的（ 缓冲液 ）缓 慢下降到与（ 凝胶面 ） 平齐，关闭出口
②加透析样品
4）样品加入与洗脱
注意：洗脱过程不能发生洗脱液流干，露出凝胶颗粒的现象， 否则重新填装。
1.调液面 2.加样 3.再调液面 4.洗脱 5.收集
缓冲液 凝胶
1.调液面
2.加样
二、实验操作 1.样品处理 (1)红细胞的洗涤
洗涤干净标准：重复4、5步骤（ 三 ）
次，直至上清液中已没有（ 黄色），表 明洗涤干净。利于后续血红蛋白的分离 纯化，不可洗涤次数过少。
二、实验操作 1.样品处理 (1)红细胞的洗涤
3g柠檬酸钠 血液 100mL 低速短时 间离心
吸出血浆 5倍体积生理盐水
2、作用： 能够抵制（ 外界的酸或碱 ）的对溶液 的（ PH值 ）的影响，维持PH基本不变。
3、缓冲溶液的配制 通常由（ 1－2 ）种缓冲剂溶解于水 中配制而成。调节缓冲剂的（ 使用比例 ） 就可以制得（ 在不同PH范围内 ）使用的 缓冲液。
思考：说出人体血液中缓冲对。 NaH2PO4 H2CO3 / / Na2HPO4 NaHCO3
3.再调液面
4.洗脱 、 5.收集
①调整缓冲液面：与凝胶面平齐
②滴加透析样品：用（吸管）将1ml（透析液 ） 的样品加到色谱柱的（ 顶端 ） ③样品渗入凝胶床：（样品完全进凝胶层）
④洗脱：打开下端，用磷酸缓冲液洗脱
⑤收集：待（ 红色的蛋白质）接近色谱柱底 端时，用试管收集流出液，每（ 5ml ） 收集一试管连续收集 注意正确的加样操作： ①不要触及破坏凝胶面 ②贴壁加样 ③使吸管管口沿管壁环绕移动
血浆蛋白 无机盐 磷脂 葡萄糖等
每个肽链环绕（ 一个亚铁血红素基团 ），此 基团可携带（ 一分子氧或一分子二氧化碳）。 血红蛋白因含有（ 血红素 ）而呈红色。本课 题可选用猪、牛、羊或其他脊椎动物的血液来 分离血红蛋白。
二、实验操作 1.样品处理 (1)红细胞的洗涤 ①目的：去除（ 杂质蛋白 ） ②方法：（ 低速短时间 ）离心（速度越 高和时间越长会使白细胞和淋巴细胞等一 同沉淀达不到分离的效果），然后用胶头 吸管吸出上层透明的（黄色血浆），将下 层（ 暗红色）的红细胞液体倒入（烧杯 ） 再加入用（ 五倍体积 ）的（生理盐水 ） 质量分数为0.9％的氯化钠溶液洗涤
聚丙稀酰胺凝胶：是由单体丙烯酰胺和交 联剂N,N-亚甲基双丙烯酰胺在引发剂和催 化剂的作用下聚合交联成三维网状结构的 凝胶 测定（ 蛋白质相对分子质量 ）通常 用十二烷基硫酸钠（SDS）—聚丙烯酰胺 凝胶电泳
①应用
一、基础知识
十二烷基磺酸钠（SDS）—聚丙稀酰胺凝胶电 泳测定蛋白质分子量 ②原理
蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中的迁移率取决于它 所带净电荷的多少以及分子的大小等因素
第1层（最上层）： （无色透明）甲苯层 第2层（中上层）： （ 脂溶性物质 ）的沉淀层， （ 白 ）色薄层固体
第3层（中下层）： （血红蛋白 ）的水溶液层 （红色透明 ）的液体 第4层（最下层）： 其它杂质（ 暗红色 ）的沉淀层
用滤纸过滤， 除去脂溶性沉 淀层，于分液 漏斗中静置片 刻后，分出下 层的红色透明 液体。
一、基础知识 （二）蛋白质分离方法1：凝胶色谱法 1、凝胶： 一些微小多孔的球体（内含许多贯穿的 通道，由多糖类构成如葡聚糖、琼脂糖， 具多孔的凝胶就叫分子筛） 2、概念：根据被分离物质的蛋白质相对 分子质量的大小，利用具有网状结构的凝 胶的分子筛作用，来进行分离。
3、原理：当不同的蛋白质通过凝胶时，相 对（相对分子质量较小 ）的蛋白质容易进入 凝胶内部的通道，路程（ 较长 ），移动速 度（ 较慢 ），而（ 相对分子质量较大） 的蛋白质无法进入凝胶内部的通道，只能 凝胶外部 ）移动，路程（较短 ）， 在（ 移动速度（ 较快 ），相对分子质量不同 的蛋白质因此得以分离。
注意事项
1. 红细胞的洗涤：
思考：蛋白质为什么带有电荷？ 在一定的PH下，蛋白质可解离的基团会带上电荷
一、基础知识 （四）蛋白质分离方法2：电泳法
电泳：带电粒子在电场的作用下发生迁移的过程 1）原理： 不同蛋白质的带电性质（正电荷或负电荷）、 电量、形状和大小不同，在电场中受到的作用 力大小、方向、阻力不同，导致不同蛋白质在 电场中的运动方向和运动速度不同。
二、实验操作
（1）凝胶色谱柱的制 作 底塞中插入的玻璃管的上部不得超出橡皮 塞的凹穴底面，否则难以铺实尼龙网，还 会导致液体残留，蛋白质分离不彻底。 c.剪尼龙网小圆片覆盖在（ 橡皮塞的凹面） 上，用（ 100目 ）的尼龙纱将橡皮塞 （ 上部 ）包好，插到玻璃管一端。 d、色谱柱下端用移液头部做（出口部位 ）， 连接一细的（ 尼龙管 ），并用螺旋夹 控制尼龙管的（ 打开与关闭），另一端放 入收集（ 色谱流出液 ）的收集器内
3）凝胶色谱柱的装填方法
③洗涤平衡 装填完毕后，立即用缓冲液洗脱瓶，在(50cm ) 高的操作压下，用300ml的20mmol/l的磷酸缓冲 液（pH为7.0）充分（ 洗涤平衡 ）12小时。
注意液面不要低于凝胶表面，否则可能有 气泡混入，影响液体在柱内的流动与最终 生物大分子物质的分离效果。不能发生洗 脱液流干，露出凝胶颗粒的现象，否则重 新填装。
3）凝胶色谱柱的装填方法
①固定：将色谱柱处置固定在支架上
②装填：
将（ 凝胶悬浮液 ）一次性的缓慢 倒入（ 色谱柱）内，装填时轻轻敲动色 谱柱，使凝胶填装均匀。 注意：凝胶装填时尽量紧密，以降低凝胶 颗粒之间的空隙。装填凝胶柱时不能有气 泡存在：因为气泡会搅乱洗脱液中蛋白质 的洗脱次序，降低分离效果。