第七章基因的定点诱变

基因家族的改组
交错延伸重组 图10-5
以两个以上的有一定同源性的DNA片段 为模板进行PCR反应，通过交换模板机制 实现DNA序列的重新组装。
不需要DNaseI切割DNA，简化了程序。
随机引发重组 图10-6
用一套随机引物与模板配对延伸，产生 不同位点的短DNA片段混合物（含有少 量点突变），以这些短DNA片段为引物 重新组装成全长基因。
与校正和修复有关的基因突变后细胞内 基因突变频率大大增加，这样的菌株叫 突变菌株。
流程：
把携带待突变基因的质粒转入增变菌株 扩增，------随机突变体库。
把该库的重组质粒转化到正常宿主中， 筛选鉴定突变体。
4 化学诱变
➢ 化学诱变剂（亚硝酸、羟胺、EMS（甲 基磺酸乙酯）、亚硝基胍等）处理DNA 片段，产生随机突变体库。
错配碱基的位置应设计在寡核苷酸分子 的中央部位，每侧至少10-15个碱基
通常采用化学合成 无回文，重复和自身互补序列
②基本步骤：
将待突变的目的基因插入M13噬菌体载体， 制备单链DNA
将合成的寡核苷酸片段与单链模板退火， 在DNA聚合酶作用下合成互补的双链DNA
将双链DNA转化大肠杆菌，获得突变基因 突变体的筛选：寡核苷酸探针杂交筛选法
细胞内甲基介导的错配修复机制会修复 新合成链中的错配碱基
一、Kunkel 法 或称“U”法 1．背景知识
dut- dUTP酶(dUTPase)缺陷，细胞不能把dUTP转
基本步骤:
目的基因片段的准备：根据不同的需要选择一个 基因或其片段，也可以是几个序列上具有较高同 源性的基因
DNaseI酶切：将基因随机切割成约50～100bp左 右的小片段
不加引物的PCR：在Taq酶的作用下将切割后的 DNA重叠小片段重新连接起来，在这个过程中可 能发生许多突变和重组
加引物的PCR：加入目的基因片段两端的引物, 使连接好的DNA得到扩增，筛选正突变。
包括两种方式： 盒式取代诱变和混合寡核苷酸诱变
野 生 型 DNA
H in d I I I 移走小片段
E coR I
H in d I I I E coR I
人工合成的寡核苷酸片段 退火
H in d I I I
H in d I I I
E coR I
突变体序列
E coR I
D N A连 接 酶
简 单 盒 式 取 代 诱 变
第十章 DNA诱变
突变是研究基因结构与功能的最基本手 段。
经典的方法是根据突变体的表型，采用 遗传学的方法鉴定相应的基因。
传统的诱变方式
利用能够修饰DNA分子的化学或物 理诱变剂处理生物体
➢ 射线（紫外线、X射线、γ射线等）
➢ 化学诱变剂（亚硝酸、羟胺、EMS、亚 硝基胍等）
不足：
➢ 生物体的任何基因都可能发生突变，目 的基因突变率较低，筛选困难
单 链 的 M 13 重组分子
AGTACGA
TCAGGCT
化学合成的寡核苷酸
杂交退火
TCAGGCT AGTACGA
D N A聚 合 酶
D N A连 接 酶
TCAGGCT AGTACGA
TCATGCT
TCAGGCT AGTCCGA
野生型
转化大 肠杆菌
突变型
局限性：突变体子代频率低
退火时，有些单链模板DNA未与寡核苷 酸配对
主要方法有：随机诱变，DNA体外重组， 寡核苷酸介导的定点诱变，嵌套缺失
第一节 随机诱变
随机的在克隆化DNA中引入碱基置换突 变，引入位置和性质均为随机性的。
包括：1.错误掺入诱变（易错PCR)
2.盒式诱变
3.增变菌株的诱变作用
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4.化学诱变
随机突变的策略：
1. 易错PCR（error-prone PCR）
➢ 即使获得期望表型的突变体，无法保证 突变确实发生在目的基因上
➢ 在基因克隆和核酸测序技术发展之前， 无法知道基因中突变的位置和性质
Directed evolution （定向进化或直接进化）
对目的基因人为制造大量突变，然后 按照特定的需要和目的，给予选择压力， 反复诱变，循环筛选，将满足要求的、适 合特定目的的分子筛选出来，获得满足需 要的性能改良的蛋白质，从而实现在试管 中分子水平的模拟进化。
野 生 型 DNA
突 变 DNA
H in d I I I
E coR I 野 生 型 D N A
混合寡核苷酸诱变
用于取代的是含有随机突变的混合双联 寡核苷酸，可引入大量的随机突变。
在合成寡核苷酸片段时，需要带限制性 内切酶位点，以便介导它们互为引物
3增变菌株的诱变作用
因为DNA复制酶有校正功能及DNA复制 后修复系统，正常大肠杆菌自发突变频 率较小。
基因直接进化的步骤
突变
基因突变库的建立
筛选
基因突变库的活体或离体筛选
Key steps of a typical directed enzyme evolution experiment
体外诱变
是对克隆化的DNA进行诱变处理，改变 其核苷酸序列，获得突变基因。研究基 因的结构与功能的关系，获得所需功能 的突变体蛋白质
DNA体外重组
依赖序列同源性的DNA体外重组，包括 DNA洗牌(DNA shuffing)，交错延伸（ StEP)，随机引发重组（RPR).
2. DNA shuffling （DNA 重排或改组）
DNA shuffling 是指DNA分子的体外重 组,是基因在分子水平上进行有性重组。 通过改变单个基因（或基因家族）原有 的核苷酸序列，创造新基因，并赋予表 达产物以新功能
寡核苷酸介导的定点诱变
①基本原理： 使用化学合成的含有突变碱基的
寡核苷酸片段作为引物，启动单链DNA 分子进行复制，随后这段寡核苷酸引物 便成为了新合成DNA子链的一个组成部 分，因此所产生出来的新链便具有已发 生突变的碱基序列
作为诱变剂的寡核苷酸序列：
人工合成一段寡核苷酸序列，该序列中 除了所需的碱基突变外，其余的则与目 的基因编码链的特定区段完全互补
在扩增目的基因的过程中，通过改变 PCR反应的条件（如改变4种dNTP的比例、 改变Mg2+的浓度等），在PCR过程中引入 碱基错配，导致目的基因的随机突变
2. 盒式诱变
Cassette mutagenesis
利用一段人工合成的具有突变序列的 寡核苷酸片段，即寡核苷酸盒，取代野 生型基因中的相应序列