酶的分离纯化

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三、同工酶
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四、诱导酶 诱导酶(induced enzyme ) 四、诱导酶
诱导酶:在环境中， 诱导酶:在环境中，加入特定的诱导物后产生 的酶。 的酶。 特点：酶的存在是有时间性的， 特点：酶的存在是有时间性的，是有条件的 。 典型的例子就是大肠杆菌体内的半乳糖苷酶。 典型的例子就是大肠杆菌体内的半乳糖苷酶。 组成酶： 组成酶：
二 调节酶
同工酶(isoenzyme) 三 同工酶
四 诱导酶 诱导酶(induced enzyme) 五 抗体酶(abzyme) 抗体酶( 六 固定化酶 固定化酶(immobilized enzyme)
核酶(ribozyme) 七 核酶
八 与人类健康有关的其它一些酶
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•
判断分离纯化方法的优劣， 判断分离纯化方法的优劣，通常用两个指标来 衡量： 衡量： 总活力的回收：表示提纯过程中酶的损失情况。 总活力的回收：表示提纯过程中酶的损失情况。 纯化倍数：表示提纯方法的有效性。 纯化倍数：表示提纯方法的有效性。
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二、酶活力的测定
酶分子的非催化部位与某些化合物可逆地 酶分子的非催化部位与某些化合物可逆地 非催化部位 非共价键结合后引起酶分子构象的改变， 非共价键结合后引起酶分子构象的改变， 进而改变酶的活性状态， 进而改变酶的活性状态，这种现象称为别 构调节作用。 构调节作用。
别构激活作用 别构抑制作用
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第六节 酶的分离提纯及活力测定
一 二 三
分离纯化 (principles of purification) 酶活力的测定(determination of activity ) 酶的纯度鉴定(identification of purity)
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一、分离纯化
2. 酶的活力单位（U, active unit） 酶的活力单位 活力单位（ ）
度量单位，表示酶量的多少。指在一定条件下，一定时间内将一定量 度量单位，表示酶量的多少。指在一定条件下， 的底物转化为产物所需的酶量。 的底物转化为产物所需的酶量。U/mL。 。 IU：指在最适反应条件下，1分钟内催化 µmol底物转化为产物所需的 ：指在最适反应条件下， 分钟内催化 分钟内催化1µ 底物转化为产物所需的 酶量。 酶量。
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二、调节酶
负协同效应别构酶与米氏酶动力学比较
对底物浓度敏感 对底物浓度不敏感
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二、调节酶 2．别构酶举例 ．
• 天冬氨酸转氨甲酰酶 天冬氨酸转氨甲酰酶（ATCase）
(1) 催化反应及动力学曲线
二、调节酶
（3）协同效应也是多亚基别构酶的一个特征 ） 协同效应？ 协同效应？ 寡聚酶中当某一调节亚基与效应物结合后导致其构
象改变，进而影响另一调节亚基与效应物的结合， 象改变，进而影响另一调节亚基与效应物的结合， 引起酶催化活性的增加或降低。 引起酶催化活性的增加或降低。这种现象称为协同 效应。 效应。
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二、调节酶
• 调节酶是对代谢调节起特殊作用的酶类。 调节酶是对代谢调节起特殊作用的酶类。 • 调节酶分子中有活性区和调节区，其催化活力 调节酶分子中有活性区 调节区， 活性区和
可因与调节剂的结合而改变， 可因与调节剂的结合而改变，有调节代谢反应 的功能。 的功能。
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二、调节酶
共价调节酶最典型的例子是动物组织的糖原磷酸化酶
1.结构特征 结构特征
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三、同工酶
• 三、同工酶(Isozyme) ： 同工酶(Isozyme)
催化相同的化学反应，而酶蛋白的分子结构、 催化相同的化学反应，而酶蛋白的分子结构、理化性质乃 至免疫学性质不同的一组酶。 至免疫学性质不同的一组酶。 • 举例：乳酸脱氢酶（Lactate dehydrogense, LDH） 举例：乳酸脱氢酶（ ） 4聚体，M型和H型。 聚体， 型和H LDH 心肌中（ ） 心肌中（4H） 骨骼肌中 ( 4M)
氨甲酰来自百度文库酸 + Asp
+ ATP
ATCase Pi
氨甲酰天冬氨酸
-
UMP
CTP
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二、调节酶
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二、调节酶
3. 别构酶调节酶活性的机理 对称或协同模型（ (1) 对称或协同模型（symmetry or concerted model, 也称齐变模型、MWC模型） 也称齐变模型 模型 1965年由 年由Monod、Wyman和Changeux提出。 提出。 年由 、 和 提出 该模型的要点 :
二、调节酶
（二）共价调节酶 什么是共价调节酶？ 什么是共价调节酶？
调节剂通过共价键与酶分子结合， 调节剂通过共价键与酶分子结合， 以增加、或减少酶分子上的基团， 以增加、或减少酶分子上的基团， 从而调节酶的活性状态与非活性状 态的相互转化， 态的相互转化，这种调节酶称为共 价调节酶。 价调节酶。
共价修饰类型： 共价修饰类型：
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、酶
分光光 度法： 度法： 荧光光 度法： 度法： 恘 法： 性 法： 法：
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的 定
酶 活 力 的 测 定 方 法
如果酶促反应的产物具有光吸收性质 如果酶促反应的产物具有光吸收性质 可见光、紫外光）， ），或反应产物进 （可见光、紫外光），或反应产物进 行一定反应后具有光吸收性质。 行一定反应后具有光吸收性质。 方便，常用。 方便，常用。 底物或产物具有荧光性质。 底物或产物具有荧光性质。 荧光性质 灵敏度高。 灵敏度高。 反应 有 的 ，可惣用 定。 ，可惣用 定法 定。 方便，常用。 方便，常用。 的底物进行酶 用 性 的底物进行酶 促反应， 促反应， 定产物的 。 灵敏度高， 常用。 灵敏度高， 常用。
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二、酶活力的测定
1．酶活力（enzyme activity, 也称酶活性） ． 活力（ 也称酶活性）
酶催化反应的能力。 酶催化反应的能力。 指在一定条件下所催化的某一化学反应的速度来表示。 化学反应的速度来表示 指在一定条件下所催化的某一化学反应的速度来表示。
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三、同工酶
1、功能
催化的反应
心肌: 心肌: 骨骼肌: 骨骼肌:
乳酸 乳酸
LDH1 LDH5
丙酮酸 丙酮酸
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三、同工酶
2、组成和电泳行为 、
HHHH (LDH1) HHHM (LDH2) HHMM (LDH3) HMMM (LDH4) MMMM (LDH5)
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五、抗体酶
五、抗体酶 （abzyme） ） 抗体酶本质上是免疫球蛋白， 抗体酶本质上是免疫球蛋白，但在易变区被赋予了 免疫球蛋白 酶的属性，所以又称“催化性抗体” 酶的属性，所以又称“催化性抗体”（catalytic antibody）。 ）。 抗原： 抗原：
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二、调节酶
(2) 序变模型（sequential model，也称 序变模型（ 模型） ，也称KNF模型） 模型 1966年由 年由Koshland、Nemethy和Filmer提出。 提出。 年由 、 和 提出 该模型的要点 :
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二、调节酶
（4）别构酶存在同促效应和异促效应 ） 底物分子本身对别构酶的调节作用称为同促效应； 底物分子本身对别构酶的调节作用称为同促效应； 非底物分子本身对别构酶的调节作用称为异促效应
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二、调节酶
（5）动力学曲线 ）
别构激活剂 无效应物 别构抑制剂
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三、酶的纯度鉴定
酶产品质量评价中常使用比活力， 酶产品质量评价中常使用比活力， 比活力越高，纯度越高。 比活力越高，纯度越高。
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第七节 一些酶的名称及概念介绍
寡聚酶( ) 一 寡聚酶(oligoenzyme)
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一、寡聚酶
一个亚基具有催化功能 具有催化功能， B．一个亚基具有催化功能，另一个亚基无 催化活性，但可以改变第一个亚基的催化反应 催化活性，但可以改变第一个亚基的催化反应 专一性，从而使反应发生。 专一性，从而使反应发生。 C．一个酶分子中有的亚基有酶活性，有的 一个酶分子中有的亚基有酶活性 酶活性， 亚基只是底物的载体而不具酶活性， 底物的载体而不具酶活性 亚基只是底物的载体而不具酶活性，也不改变 其他亚基的活性。 其他亚基的活性。
正协同效应 负协同效应
当一种配基与酶蛋白结合后，新构象的形成促进后 当一种配基与酶蛋白结合后， 续配基与酶蛋白的结合。 续配基与酶蛋白的结合。
亚基构象的改变能够传递， 亚基构象的改变能够传递，从而改变与底 物结合的速度，产生协同效应。 物结合的速度，产生协同效应。
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比活力（ 3. 酶的比活力（specific activity） 酶的比活力 ）
指每mg蛋白质所具有的酶活力单位， 蛋白质来表示。 指每 蛋白质所具有的酶活力单位，一般用 U/mg蛋白质来表示。 蛋白质所具有的酶活力单位 蛋白质来表示
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二、酶活力的测定
一、寡聚酶
寡聚酶(oligoenzyme) 一、寡聚酶(oligoenzyme) 1.特点：由两个及两个以上的亚基组成的酶。 1.特点：由两个及两个以上的亚基组成的酶。 特点 2.类型： 2.类型： 类型 含有相同亚基的寡聚酶： 含有相同亚基的寡聚酶： 含不同亚基的寡聚酶： 含不同亚基的寡聚酶： A．双功能寡聚酶：每种亚基表现不同的功 双功能寡聚酶： 因而整个酶分子催化两个相关的反应 整个酶分子催化两个相关的反应， 能，因而整个酶分子催化两个相关的反应，这种寡 聚酶称为双功能寡聚酶 双功能寡聚酶。 聚酶称为双功能寡聚酶。
• 调节酶一般可分为共价调节酶及别构调节酶。 调节酶一般可分为共价调节酶及别构调节酶。 共价调节酶
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二、调节酶
（一）别构调节酶
1. 别构酶的特点和性质 (1)概念：具有别构调节作用的酶称为别构酶。 (1)概念：具有别构调节作用的酶称为别构酶。 概念 别构调节作用? 别构调节作用? (2)别构效应: (2)别构效应: 别构效应 效应物（ 效应物（effector）： ）： 别构效应
提纯的目的： 提纯的目的： 步骤： 步骤：
• 选材 • 破碎细胞 • 抽提 • 分离及纯化 • 保存
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一、分离纯化
由于酶的特殊性， 由于酶的特殊性，在提纯过程中要注意 :
1．全部操作在低温0～4℃。 全部操作在低温0 4℃。 2．在分离提纯过程中，不能剧烈搅拌。 在分离提纯过程中，不能剧烈搅拌。 3．在提纯溶剂中加一些保护剂，如少量EDTA、 在提纯溶剂中加一些保护剂，如少量EDTA、 EDTA 少量β 巯基乙醇。 少量β-巯基乙醇。 4．在分离提纯过程中要不断测定酶活力和蛋白质浓 在分离提纯过程中要不断测定酶活力和蛋白质浓 度，从而求得比活力，还要计算总活力。 从而求得比活力，还要计算总活力。 比活力 总活力
(antigen)凡是能引起免疫反应的任何分子或细胞。 (antigen)凡是能引起免疫反应的任何分子或细胞。 凡是能引起免疫反应的任何分子或细胞
半抗原： 半抗原： E与S作用形成的过渡态结构设计合成的一些类似物。 作用形成的过渡态结构设计合成的一些类似物。 据 意义： 意义：设计新药的思路