线粒体的活体染色

实验四线粒体的活体染色

实验目的：

1.掌握线粒体的活体染色原理及方法。

2.熟悉在耳缘静脉用空气栓塞法处死兔子的方法。

3.了解光学显微镜和电子显微镜下线粒体基本形态结构。

实验原理：

线粒体是细胞内一种重要细胞器，是细胞进行呼吸作用的场所。细胞的各项活动所需要的能量，主要是通过线粒体呼吸作用来提供的。活体染色是应用无毒或毒性较小的染色剂真实地显示活细胞内某些结构而又很少影响细胞生命活动的一种染色方法。詹纳斯绿B（Janus green B）是线粒体的专一性活体染色剂。线粒体中细胞色素氧化酶系使染料保持氧化状态呈蓝绿色，而在周围的细胞质中染料被还原，成为无色状态。

不同细胞中线粒体的形态和数目不同。在电子显微镜下，线粒体的外形多样，如圆形、椭圆形、哑铃形和杆状。线粒体的数目与细胞类型和细胞的生理状态有关，线粒体多聚集在细胞生理功能旺盛的区域。

线粒体脊的数目与分布方式是多种多样的。一般与线粒体长轴垂直排列，但也可见到与线粒体长轴平行排列的脊。脊的横切面呈囊状或管状。脊的数量与细胞呼吸机能的强度有很大关系。

实验用品：

一、材料和标本兔子一只、线粒体的电镜照片。

二、器材和仪器普通光学显微镜、手术器材一套、解剖盘、腊盘、小平皿、载片、盖片、吸水纸、20ml注射器、吸管。

三、试剂l／300詹纳斯绿B染液、0.9%Ringer氏液(哺乳类用)。

实验内容和方法：

一、兔肝细胞线粒体的活体染色

（一）方法

1.用空气栓塞法处死兔子（见图4-1），置于解剖盘内，迅速打开腹腔，取兔肝边缘较薄的肝组织一小块（约2～3mm3大小）。

2.放入盛有Ringer氏液的平皿内洗去血液(用镊子轻压)，再用吸管吸去Ringer 氏液。

3.在平皿内滴加1／300詹纳斯绿B（Janus green B）染液，，让组织块上表面露在染液外面，使细胞内线粒体的酶系可进行充分的氧化，这样才有利于保持染料的氧化状态，使线粒体着色。当组织块边缘染成蓝色时即可，一般需要染色30分钟。染色期间翻动组织块几次，使其各表面均有机会接触空气和染液。

4. 染色后，将组织块移到载片上，用镊子将组织块拉碎，去除大组织块，就会

有一些游离的细胞或细胞群从组织块脱离留在载片上。

5.滴加一滴Ringer氏液，盖上盖片，吸去多余水分，镜检。

结果：显微镜观察，肝细胞质中许多线粒体被染成蓝绿色，呈颗粒状。

二．线粒体的电镜照片观察

观察三张线粒体超薄切片的电镜照片：第一张是小鼠肾小管上皮细胞中线粒体的电镜照片，可见线粒体呈椭圆形和杆状，由双层膜包围，内膜向内突起成平板状脊，脊与线粒体长轴垂直排列，肾小管上皮细胞重吸收作用需要能量，线粒体数目多。第二张是恒河猴脊髓突触内线粒体。可见线粒体体积小、数目多，脊与线粒体呈同心圆排列。第三张是小鼠睾丸间质细胞线粒体，线粒体的脊为分支的管，在照片上呈单层膜泡状。

作业：绘制光镜下肝细胞活体染色所见的线粒体及电镜下肾小管上皮细胞中线粒体的形态结构。