DNA的测序方法、原理及其应用
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◆ 个体识别：亲缘鉴定������
◆ ◆
SNP关联分析������ 疾病诊断等
2、核苷酸序列的生物信息分析
一、在线分析的核心网站
http://www.ncbi.nlm.nih.gov http://bip.weizmann.ac.il http://au.expasy.org/tools/#primary http://www.ebi.ac.uk/embl/ http://www.ddbj.nig.ac.jp/
表----特异断裂4种脱氧核苷酸的方法
作用的碱基 试剂与反应 稀释250倍硫酸二甲酯，在 50mM卡可酸（PH8.0） 强G/弱A 10MMgCl2、 0.1MEDTA20℃60分钟， DNAG的N7和A的N3甲基化 A 同上 0.2NHCl、0℃、60分 钟，碱基被破坏 同上，A断裂比G快 0.5M哌啶处理，断 C+T 15-18M联苯胺、20℃50分钟，嘧啶环被破坏释放 裂DNA键，C与T有 同样速率 C 2MNaCl，联氨处理方法同上，100分钟，此时，T 的破坏被抑制，只有C被破坏释放 同上，只在C处断裂 DNA链 碱基释放 甲基化嘌呤不稳定， 在中型PH加热被破坏 DNA断裂 在0.1M碱中， 90℃15分钟，戊糖脱 落，DNA链断裂，G 断裂比A快5倍
27
氨基酸序列同源性分析
碱基序列同源性
分子进化树分析亲缘性关系
HUN0801
54
JS0809 HUN0802 JS0822 HUN0804
53 67 88
JS0819 JS0821 NN0603
67
BLEN NN1165
60 66
Cu-1wt cef94 CU1M
50
99 63
BH11 B87 CE Gt GLS
1963年，Sanger和Thompson等人第一次完成胰岛素51个 氨基酸的序列测定，这在当时来说是一件了不起的大事。70 年代后期，Sanger和Maxam----Gilbert等人又建立了核酸序 列测定的方法，Sanger双脱氧末端终止法和Maxam---Gilbert化学裂解法将核酸序列测定技术推进到“直读”阶段， 使核酸序列测定变得远比蛋白质氨基酸序列测定容易，这样 人们可以通过核酸序列和遗传密码推导出蛋白质氨基酸的序 列。
由于Sanger法既简便又快速，目前大多数测序策略都是
为Sanger法而设计的。
DNA自动测序与手工测序的不同点
1）标记物不同：手工测序采用放射性核素标记，而自动测
序采用4种荧光染料分别标记ddNTP或标记引物 2) 加样方式不同：手工测序，一个样品的4个测序反应物分 别在不同泳道进行，而自动测序可在一个泳道内电泳 3) 检测手段不同：手工测序采用放射自显影，从4种寡聚核
在4种反应体系中，化学试剂特异地断裂DNA的机制是：
G反应----硫酸二甲酯（DMS）使GN7甲基化，其后断开
了C8-C9间的化学键，哌啶置换了被修饰鸟嘌呤与核糖的结合。
G+A反应----（哌啶）甲酸使嘌呤环上氮原子质子化，削 弱了嘌呤脱氧核糖核苷酸和腺嘌呤脱氧核糖核苷酸的糖苷键，
然后哌啶置换了嘌呤。
用于终止反应的双脱氧核苷酸：
将2’ ，3’ –双脱氧核苷酸（ddNTP）参入到 新合成的DNA链中，由于参入的ddNTP缺 乏3’ –羟基，因此不能与下一位核苷酸反应 形成磷酸二酯键，DNA合成反应将中止。
P
5 C 4
O
碱基
2 H
5 C 4 3 H
3
O
1
H2O
脱 氧 核 苷 酸 的 连 接
P
T+C反应----肼断开了嘧啶环，产生碱基片段被哌啶置换。 C反应----在NaCl存在时，只有C才能与肼发生反应，随后，
被修饰的胞嘧啶被哌啶置换。
Biblioteka Baidu
★ 碱基特异性修饰及裂解
反应体系 G G+A 碱基修饰试剂 碱基修饰反应 主链断裂试剂 硫酸二甲酯 甲酸 鸟嘌呤甲基化 脱嘌呤作用 六氢吡啶 六氢吡啶 断裂点 G G和A
苷酸的梯子形图谱中读出DNA序列，而自动测序则采用
激光扫描器同步扫描，计算机进行阅读和编辑
四、DNA序列测定的应用
1) 测序������
◆ ◆ ◆ ◆ ◆
PCR克隆测序验证������ 突变体检测������ 新基因测序������ 全基因组测序������ 系统发育及物种鉴定������
2) 片段分离
不需酶促反应，可以 1、高负荷，1块胶可 对寡核苷酸测序。 测16个样品；2、机读 不需放射自显影；3、 安全不用同位素；4、 简单迅速8-10h。
1）双脱氧链终止法测序(the chain termination method) 基本原理： 通过合成与单链DNA互补的多核苷酸链， 由于合成的互补链可在不同位置随机终止 反应，产生只差一个核苷酸的DNA分子， 从而来读取待测DNA分子的顺序。
O 2 H 1
碱基
P
5 C 4 3
O 2 1
碱基
双 脱 氧 核 苷 酸
?
…
H H OH
X
P
5 C
4 3
O 2 1
碱基
OH H
2）Maxam-Gilbert 化学降解法测序
基本原理：
① 用放射性核素标记待测DNA一侧末端 ② 将标记DNA分为G、A+G、C+T、C 4个反应体系 ③ 用不同的化学试剂处理不同反应体系，随机断裂DNA 片段某种碱基中的任何一个，产生一组一端为放射线标记 的末端，另一端为不同大小的DNA片段的混合物 ④ 电泳分离，放射自显影得到互相错落的梯形图谱，即 可读出DNA序列
二、测序的常用方法
DNA序列测定常用方法有如下3种：
1、末端终止法 2、化学裂解法 3、DNA测序自动化 类似末端终止法，所 不同的是用荧光染料 标记，计算机自动读 出。
使用特异性引物与 用化学试剂在A、G、 单链模板DNA退火， C、T处特定的裂解 在DNA聚合酶作用 DNA片段，产生一簇 下进行延伸反应， 各种长度的短链，经 用ddNTP终止，用 过PAGE放射自显影 PAGE区分长度仅 可直读DNA顺序。 相差1个核苷酸的 ssDNA，从而完成 测序的方法。 优点 简便、迅速、应用 广泛。
DNA的测序方法、原理及其应用
一、DNA序列测定概述及其发展
即核酸DNA分子一级结构的测定，是现代分子生物学一项 重要的技术。
其基本原理是DNA 的复制反应体系中需要存在DNA 聚合 酶、DNA 模板、寡核苷酸引物和dNTP，引物和模板退火形成 双链后，DNA 聚合酶在引物的引导下在模板链上沿3’→5’ 的方向移动，dNTP 按照碱基配对原则，逐个连接在引物的 3’-OH 末端。
100
59
YN1161
Harbin-1
95 100
NN1163 NN1172 HK46
100 59
OKYM
UK661
0.01
2) 蛋白序列序列创建分子分析
西南大学生物技术专业 基因工程
31
二、本地分析的重要软件
Vector NTI Suite 6.0及以上的版本：综合分析、载体分析。 DNA Star：综合分析 Primer Premier 5.0：引物设计 Oligo 7：寡核苷酸分析，引物计算 GCG：蛋白质、核酸序列
26
1) Genbank序列检索
西南大学生物技术专业 基因工程
C+T
C
肼
肼（加盐）
嘧啶开环
胞嘧啶开环
六氢吡啶
六氢吡啶
C和T
C
3） DNA自动化测序
特点 原理同末端终止法 标记物为荧光染料 激光扫描自动测序 结果清晰、准确、分辨率高 测序速度快 200bp/h
三、3种方法的比较
化学法没有末端终止法应用广泛，但有一个明 显的优点，即所测序列来自原DNA分子而不是酶促 合成反应所产生的拷贝，因此利用化学法可以对合 成的寡核苷酸进行测序，可以分析诸如甲基化等
DNA修饰的情况，不能通过化学保护及修饰干扰实
验来研究DNA二级结构及蛋白质与DNA的相互作用。
Maxam-Gilbert法只需简单化学试剂。所测序列来自原
DNA分子而不是酶促合成反应所产生的拷贝，因此利用 化学法可以对合成的寡核苷酸进行测序，可以分析诸如甲 基化等DNA修饰的情况。但所能测定的长度要比Sanger 法短一些，它对放射性标记末端 250个核苷酸以内的DNA 序列效果最佳。 Sanger 法虽需要单链模板和特异寡核苷酸，并需获得大 肠杆菌DNA 聚合酶IKlenow 片段的高质量酶制剂，而随 着M13 噬菌体和噬菌粒载体的发展，也由于现成的合成 引物容易获得及测序反应日期完善，双脱氧链终止法如今 远比Maxam-Gilbert法应用得广泛。
◆ ◆
SNP关联分析������ 疾病诊断等
2、核苷酸序列的生物信息分析
一、在线分析的核心网站
http://www.ncbi.nlm.nih.gov http://bip.weizmann.ac.il http://au.expasy.org/tools/#primary http://www.ebi.ac.uk/embl/ http://www.ddbj.nig.ac.jp/
表----特异断裂4种脱氧核苷酸的方法
作用的碱基 试剂与反应 稀释250倍硫酸二甲酯，在 50mM卡可酸（PH8.0） 强G/弱A 10MMgCl2、 0.1MEDTA20℃60分钟， DNAG的N7和A的N3甲基化 A 同上 0.2NHCl、0℃、60分 钟，碱基被破坏 同上，A断裂比G快 0.5M哌啶处理，断 C+T 15-18M联苯胺、20℃50分钟，嘧啶环被破坏释放 裂DNA键，C与T有 同样速率 C 2MNaCl，联氨处理方法同上，100分钟，此时，T 的破坏被抑制，只有C被破坏释放 同上，只在C处断裂 DNA链 碱基释放 甲基化嘌呤不稳定， 在中型PH加热被破坏 DNA断裂 在0.1M碱中， 90℃15分钟，戊糖脱 落，DNA链断裂，G 断裂比A快5倍
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氨基酸序列同源性分析
碱基序列同源性
分子进化树分析亲缘性关系
HUN0801
54
JS0809 HUN0802 JS0822 HUN0804
53 67 88
JS0819 JS0821 NN0603
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BLEN NN1165
60 66
Cu-1wt cef94 CU1M
50
99 63
BH11 B87 CE Gt GLS
1963年，Sanger和Thompson等人第一次完成胰岛素51个 氨基酸的序列测定，这在当时来说是一件了不起的大事。70 年代后期，Sanger和Maxam----Gilbert等人又建立了核酸序 列测定的方法，Sanger双脱氧末端终止法和Maxam---Gilbert化学裂解法将核酸序列测定技术推进到“直读”阶段， 使核酸序列测定变得远比蛋白质氨基酸序列测定容易，这样 人们可以通过核酸序列和遗传密码推导出蛋白质氨基酸的序 列。
由于Sanger法既简便又快速，目前大多数测序策略都是
为Sanger法而设计的。
DNA自动测序与手工测序的不同点
1）标记物不同：手工测序采用放射性核素标记，而自动测
序采用4种荧光染料分别标记ddNTP或标记引物 2) 加样方式不同：手工测序，一个样品的4个测序反应物分 别在不同泳道进行，而自动测序可在一个泳道内电泳 3) 检测手段不同：手工测序采用放射自显影，从4种寡聚核
在4种反应体系中，化学试剂特异地断裂DNA的机制是：
G反应----硫酸二甲酯（DMS）使GN7甲基化，其后断开
了C8-C9间的化学键，哌啶置换了被修饰鸟嘌呤与核糖的结合。
G+A反应----（哌啶）甲酸使嘌呤环上氮原子质子化，削 弱了嘌呤脱氧核糖核苷酸和腺嘌呤脱氧核糖核苷酸的糖苷键，
然后哌啶置换了嘌呤。
用于终止反应的双脱氧核苷酸：
将2’ ，3’ –双脱氧核苷酸（ddNTP）参入到 新合成的DNA链中，由于参入的ddNTP缺 乏3’ –羟基，因此不能与下一位核苷酸反应 形成磷酸二酯键，DNA合成反应将中止。
P
5 C 4
O
碱基
2 H
5 C 4 3 H
3
O
1
H2O
脱 氧 核 苷 酸 的 连 接
P
T+C反应----肼断开了嘧啶环，产生碱基片段被哌啶置换。 C反应----在NaCl存在时，只有C才能与肼发生反应，随后，
被修饰的胞嘧啶被哌啶置换。
Biblioteka Baidu
★ 碱基特异性修饰及裂解
反应体系 G G+A 碱基修饰试剂 碱基修饰反应 主链断裂试剂 硫酸二甲酯 甲酸 鸟嘌呤甲基化 脱嘌呤作用 六氢吡啶 六氢吡啶 断裂点 G G和A
苷酸的梯子形图谱中读出DNA序列，而自动测序则采用
激光扫描器同步扫描，计算机进行阅读和编辑
四、DNA序列测定的应用
1) 测序������
◆ ◆ ◆ ◆ ◆
PCR克隆测序验证������ 突变体检测������ 新基因测序������ 全基因组测序������ 系统发育及物种鉴定������
2) 片段分离
不需酶促反应，可以 1、高负荷，1块胶可 对寡核苷酸测序。 测16个样品；2、机读 不需放射自显影；3、 安全不用同位素；4、 简单迅速8-10h。
1）双脱氧链终止法测序(the chain termination method) 基本原理： 通过合成与单链DNA互补的多核苷酸链， 由于合成的互补链可在不同位置随机终止 反应，产生只差一个核苷酸的DNA分子， 从而来读取待测DNA分子的顺序。
O 2 H 1
碱基
P
5 C 4 3
O 2 1
碱基
双 脱 氧 核 苷 酸
?
…
H H OH
X
P
5 C
4 3
O 2 1
碱基
OH H
2）Maxam-Gilbert 化学降解法测序
基本原理：
① 用放射性核素标记待测DNA一侧末端 ② 将标记DNA分为G、A+G、C+T、C 4个反应体系 ③ 用不同的化学试剂处理不同反应体系，随机断裂DNA 片段某种碱基中的任何一个，产生一组一端为放射线标记 的末端，另一端为不同大小的DNA片段的混合物 ④ 电泳分离，放射自显影得到互相错落的梯形图谱，即 可读出DNA序列
二、测序的常用方法
DNA序列测定常用方法有如下3种：
1、末端终止法 2、化学裂解法 3、DNA测序自动化 类似末端终止法，所 不同的是用荧光染料 标记，计算机自动读 出。
使用特异性引物与 用化学试剂在A、G、 单链模板DNA退火， C、T处特定的裂解 在DNA聚合酶作用 DNA片段，产生一簇 下进行延伸反应， 各种长度的短链，经 用ddNTP终止，用 过PAGE放射自显影 PAGE区分长度仅 可直读DNA顺序。 相差1个核苷酸的 ssDNA，从而完成 测序的方法。 优点 简便、迅速、应用 广泛。
DNA的测序方法、原理及其应用
一、DNA序列测定概述及其发展
即核酸DNA分子一级结构的测定，是现代分子生物学一项 重要的技术。
其基本原理是DNA 的复制反应体系中需要存在DNA 聚合 酶、DNA 模板、寡核苷酸引物和dNTP，引物和模板退火形成 双链后，DNA 聚合酶在引物的引导下在模板链上沿3’→5’ 的方向移动，dNTP 按照碱基配对原则，逐个连接在引物的 3’-OH 末端。
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YN1161
Harbin-1
95 100
NN1163 NN1172 HK46
100 59
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UK661
0.01
2) 蛋白序列序列创建分子分析
西南大学生物技术专业 基因工程
31
二、本地分析的重要软件
Vector NTI Suite 6.0及以上的版本：综合分析、载体分析。 DNA Star：综合分析 Primer Premier 5.0：引物设计 Oligo 7：寡核苷酸分析，引物计算 GCG：蛋白质、核酸序列
26
1) Genbank序列检索
西南大学生物技术专业 基因工程
C+T
C
肼
肼（加盐）
嘧啶开环
胞嘧啶开环
六氢吡啶
六氢吡啶
C和T
C
3） DNA自动化测序
特点 原理同末端终止法 标记物为荧光染料 激光扫描自动测序 结果清晰、准确、分辨率高 测序速度快 200bp/h
三、3种方法的比较
化学法没有末端终止法应用广泛，但有一个明 显的优点，即所测序列来自原DNA分子而不是酶促 合成反应所产生的拷贝，因此利用化学法可以对合 成的寡核苷酸进行测序，可以分析诸如甲基化等
DNA修饰的情况，不能通过化学保护及修饰干扰实
验来研究DNA二级结构及蛋白质与DNA的相互作用。
Maxam-Gilbert法只需简单化学试剂。所测序列来自原
DNA分子而不是酶促合成反应所产生的拷贝，因此利用 化学法可以对合成的寡核苷酸进行测序，可以分析诸如甲 基化等DNA修饰的情况。但所能测定的长度要比Sanger 法短一些，它对放射性标记末端 250个核苷酸以内的DNA 序列效果最佳。 Sanger 法虽需要单链模板和特异寡核苷酸，并需获得大 肠杆菌DNA 聚合酶IKlenow 片段的高质量酶制剂，而随 着M13 噬菌体和噬菌粒载体的发展，也由于现成的合成 引物容易获得及测序反应日期完善，双脱氧链终止法如今 远比Maxam-Gilbert法应用得广泛。