碱裂解法提取质粒
碱裂解法质粒小量提取_文档
一碱裂解法质粒小量提取试验原理：碱裂解法是较常用的提取的方法。
其优点是收获率高，适于多数的菌株，所得产物经纯化后可满足多数的DNA重组操作。
十二烷基磺进行质粒的小量制备。
十二烷基磺酸钠（SDS）是一种阴离子表面活性剂，它既能使细菌细胞裂解，又能使一些蛋白质变性。
用SDS处理细菌后，会导致细菌细胞破裂，释放出质粒DNA 和染色体DNA，两种DNA在强碱环境都会变性。
由于质粒和主染色体的拓扑结构不同，变性时前者虽然两条链分离，却仍然缠绕在一起不分开；但后者完全变性分甚至出现断裂，因此，当加入pH4.8的酸性乙酸钾降低溶液pH值，使溶液pH值恢复较低的近中性水平时，质粒的两条小分子单链可迅速复性恢复双链结构，但是主染色体DNA则难以复性。
在离心时，大部分主染色体与细胞碎片，杂质等缠绕一起被沉淀，而可溶性的质粒DNA留在上清夜中。
再由异丙醇沉淀、乙醇洗涤，可得到纯化的质粒DNA。
碱裂解法提取的质粒DNA可直接用于酶切、PCR扩增、银染序列分析等。
仪器与主要试剂主要试剂：溶液I：50 mmol/L葡萄糖10 mmol/L EDTA25 mmol/L Tris-HCl (pH 8.0)溶液II：200 mmol/L NaOH 1% SDS溶液III：3 mol/L NaAc (pH4.8)溶液酚氯仿异丙醇（25：24：1）95%乙醇%70乙醇TE缓冲液：10 mmol/L Tris-HCl ,pH 7.5 1 mmol/L EDTARNaseA方法：1．将大肠杆菌菌落挑取一环接种在含有2毫升加入抗菌素的LB液体培养基的10毫升试管里，37℃振培过夜，16～18小时2．转移以上菌液1.5毫升于EP管中，8000rpm离心30秒3．小心去除上清，并用吸水纸吸干残余液体，再将沉淀物在振荡器上振匀4．加入溶液I 100μl，盖紧EP管盖，翻转数次，冰上放置10分钟5．加入溶液II 200μl，温和翻转EP管5次(可观察到溶液逐步由混浊变为透明)，冰上放置5分钟6．加入溶液III 150μl，将EP管盖紧后累累来回翻转23次，混匀后冰上放置20分钟7．12000rpm离心15分钟8．将上清转移到另一个EP管中(吸取时不可吸入底部的沉淀)。
试验一碱裂解法抽提质粒DNA
3 质粒DNA的进一步纯化
加入TE使DNA溶液为200ul，加入等体积的酚/氯仿，充 分振荡：会分三层 12000rpm，离心5分钟，吸取上清液 加入等体积的氯仿， 12000rpm，离心5分钟，取上清 加入1/10体积的3MNaAc，加2倍体积的预冷的无水乙醇， 混匀。 置于-70℃冰箱约10min以上或者-20℃冰箱30min至数个 小时
三、材料、试剂及仪器
1 材料： （1）菌种E.coliDH 10B含质粒pSK （2）菌种E.coliDH 10B含质粒pMP3 2 试剂: LB培养基（ 固体和液体）;氨苄青霉素 (Amp,100mg/ml);20﹪SDS;溶液Ⅰ; 溶液Ⅱ （最好现配现用）;溶液Ⅲ（-20℃预冷）; 4N NaOH; 3MNaAc（PH5.2）;无水乙醇; TE缓冲 液（PH8.0）; RNaseA(10mg/ml); 70﹪乙醇;饱 和酚/氯仿/异戊醇（25：24：1）
2.点样
1xTE或ddH2O:7μL 10ul混合液 10xloading buffer : 1ul 样品:2 ul 混合后点入点样孔中。其中最左边的两个孔点5ulMarker3和 DS2000作为分子量标准。 3.电泳
打开电源开关，调节电压至3-5v/cm即100V，可见溴酚蓝 条带由负极向正极移动，约一小时可观察
12000rpm离心15分钟（4℃），倒掉酒精，离心几秒， 用移液枪尽可能除去酒精 用0.5ml70 %酒精洗DNA沉淀一次，离心2分钟，倒掉酒 精 离心几秒，用移液枪尽可能除去酒精，风干。 加30ulTE溶解DNA沉淀（TE不加RNase）
五、实验注意事项
1 挑菌落应挑单菌落。 可用牙签挑取，也可用tip头挑取。市场上买的 牙签上有防腐剂，应用沸水煮过之后，烘干用 2 细菌培养过程应注意保持细菌的通气性： （1）培养基的体积不能占培养管的体积太多 （2）培养管的体积不用盖太紧 （3）培养管倾斜培养：可增大细菌与氧气接触 面积 （4）转速为200rmp：快一点的转速有利于保持 其的通气性
碱裂解法提取质粒DNA的研究
碱裂解法提取质粒DNA的研究碱裂解法是一种常用的提取质粒DNA的方法。
该方法通过将大肠杆菌等细菌细胞进行碱性处理，使其细胞壁溶解，并释放出质粒DNA。
以下是对碱裂解法提取质粒DNA的研究进行详细介绍。
首先，进行实验前的准备工作。
实验材料包括大肠杆菌含质粒的培养液，碱性裂解液，中和液，以及一些常规实验室工具。
准备条件优化的培养基，如Luria-Bertani培养基，以获得高质量的质粒DNA。
将培养的大肠杆菌细胞进行离心，取得细菌细胞的沉淀，并将其重悬于适量的碱性裂解液中。
碱性裂解液的配制对提取质粒DNA的质量具有重要影响。
通常，碱性裂解液包括Tris-HCl缓冲液（pH 8.0-8.5）、EDTA （0.1M，pH 8.0）以及SDS（0.5%-1.0%）。
在碱性裂解液中，细胞壁受到破坏，并且其中的DNA被释放出来。
为了进一步提取质粒DNA，需要添加RNase A（最终浓度为20μg/mL）来降解细胞中的RNA。
此外，可以根据需要添加蛋白酶K（最终浓度为100μg/mL）来去除大部分的蛋白质。
接下来，使用酒精沉淀法来纯化质粒DNA。
首先，加入等体积的冰冷异丙醇，使DNA和异丙醇充分混合，然后进行离心。
在高速离心后，离心管底部会形成一个白色的DNA沉淀。
利用移液枪将上层液体倒掉，然后用70%的乙醇洗涤DNA沉淀，移液枪将乙醇沉淀洗涤掉。
最后，利用离心机将样品离心至全速，将乙醇溶液除去，并风干沉淀。
最后，使用合适的缓冲液溶解DNA，以达到所需的浓度。
为了确定提取的质粒DNA的纯度和浓度，可以使用紫外光谱仪来测定其260nm和280nm的吸光度比值。
这个比值可用于评估质粒DNA中的蛋白质污染情况。
如果蛋白质污染特别严重，可以使用氯仿、酒精沉淀等方法进行进一步清除。
此外，还可以使用琼脂糖凝胶电泳来检测提取的质粒DNA的大小和完整性。
通过比较不同样品的DNA迁移位置，可以快速确定质粒DNA的大小。
总结：碱裂解法是一种非常常用且简单的提取质粒DNA的方法。
碱裂解法提取质粒原理和注意事项
碱裂解法提取质粒原理和注意事项碱裂解法是一种用于提取质粒的常用方法，通过在碱性条件下使细菌细胞裂解，进而释放出质粒。
碱裂解法的原理是利用质粒与细菌细胞核酸的不同碱溶解性，使质粒保留在溶液中，而细菌细胞核酸被沉淀下来。
本文将详细介绍碱裂解法的原理和注意事项。
碱裂解法的原理：1.细菌细胞的预处理：首先，将含有质粒的细菌菌落接种到LB(琼脂)培养基中，经过适当时长的培养，使细菌菌落扩大到较大体积。
2.收获细菌细胞：将培养基中的细菌细胞收获下来，一般通过离心方法将菌液沉淀。
3.细菌细胞裂解：将细菌细胞沉淀后，将其重悬到高浓度的碱溶液中，使细菌细胞在碱性条件下裂解。
4.分离核酸：碱条件下，质粒DNA和线粒体DNA往往会溶于溶液中，而细菌细胞的染色体DNA不溶于溶液中，并随着碱度增加逐渐沉淀。
通过快速离心，将细菌细胞染色体DNA沉淀，而质粒DNA留在上清液中。
5.提取质粒：将上清液取出，通过乙醇沉淀方法使质粒DNA沉淀下来，通过离心收获质粒，即可得到纯化后的质粒DNA。
注意事项：1.使用无菌操作：为保证实验的准确性和重复性，实验过程中必须严格遵守无菌操作的要求。
例如，使用无菌器皿和无菌操作工具，避免细菌污染。
2.注意细菌菌落的培养条件和时长：细菌菌落的培养条件和时长会对实验结果产生影响。
培养条件应符合细菌所需的培养基成分和培养温度，时长应确保细菌菌落予以充足的生长和扩大。
3.使用高浓度的碱溶液：为充分裂解细菌细胞，需要使用高浓度的碱溶液，通常为pH12的溶液。
4.快速离心：由于细菌细胞裂解后的溶液中可能含有许多细菌细胞碎片和核酸碎片，为避免这些碎片沉淀到上清液中，需要进行快速离心，在最短时间内将质粒DNA沉淀下来。
5.质粒的纯化：通过乙醇沉淀方法提取质粒时，需要仔细控制乙醇的用量和沉淀时间，以避免损失待提取的质粒DNA。
总结：碱裂解法是提取质粒DNA的常用方法之一，其原理是利用质粒DNA与细菌细胞染色体DNA在碱性条件下的不同溶解性，通过沉淀法分离出质粒DNA。
碱裂解法提质粒原理详解
碱裂解法提质粒原理详解碱裂解法是一种常用的提取质粒的方法。
它利用高碱性溶液对细菌的细胞壁和膜进行破坏，释放出细胞内的质粒。
下面将详细介绍碱裂解法的原理及其步骤。
碱裂解法的原理基于细菌细胞壁和膜对碱性条件的敏感性，而质粒较为稳定，可以在高碱性溶液中存活。
在碱性条件下，细菌的细胞壁和膜会发生严重的破坏，释放细胞内的质粒。
此外，高温和刺激性离子（如氢氧根离子）也可以增加细胞壁和膜的破坏效果。
碱裂解法的步骤如下：1.首先，从含有目标质粒的培养基中取得细菌菌落，将菌落转移到含有适当抗生素的培养基中进行培养。
这是为了确保获得含有目标质粒的细菌。
2.将培养好的细菌转移到含有高盐浓度的溶液中。
高盐浓度可以破坏细菌细胞壁的结构，促进质粒的释放。
3.加入碱性溶液，通常使用0.2MNaOH或0.1MNaOH。
高碱性条件可以破坏细菌细胞膜，释放质粒。
此外，高温还可以增加细胞壁和膜的破坏效果。
4.在碱性条件下，轻轻搅拌混合物，以促进细胞壁和膜的破坏，并使质粒更易于释放。
5. 加入中和缓冲液（例如Tris-HCl），以中和溶液的pH值。
这是为了避免碱性条件对质粒产生不利影响。
6.将混合物进行离心，以分离细胞碎片和质粒。
离心过程中，较大的碎片会沉淀在离心管底部，而质粒会悬浮在上层液体中。
7.将上层液体转移到新的离心管中，并进行再次离心。
这是为了进一步净化质粒，去除可能残留的细胞碎片。
8.倒掉上清液，并用含有合适抗生素的培养基再次进行培养。
这是为了筛选出仍然带有目标质粒的细菌。
总的来说，碱裂解法通过破坏细菌的细胞壁和膜，释放出细胞内的质粒。
该方法简单、快速，并且适用于大多数质粒的提取。
然而，需要注意的是，碱裂解法也会破坏部分目标蛋白质的结构，因此在选择提取方法时需要综合考虑。
碱裂解法提取质粒实验报告
碱裂解法提取质粒实验报告碱裂解法提取质粒实验报告引言：质粒提取是分子生物学研究中常用的技术手段之一，它可以将目标质粒从细胞中分离出来，为后续的基因克隆、基因测序等实验提供了重要的前提条件。
本实验旨在通过碱裂解法提取质粒，探究其原理及操作步骤，并评估提取质粒的纯度和浓度。
一、实验原理碱裂解法是一种常用的质粒提取方法。
其原理是通过高浓度的碱溶液和高温的条件，使细胞膜破裂，蛋白质变性，DNA解旋，从而将质粒分离出来。
碱裂解法的主要步骤包括细胞收获、细胞溶解、蛋白质沉淀、DNA沉淀、洗涤和溶解。
二、实验材料与方法2.1 实验材料（1）大肠杆菌E.coli菌株（2）LB培养基（3）质粒DNA提取试剂盒（4）离心管、显微管、PCR管等实验器材2.2 实验方法（1）培养大肠杆菌E.coli菌株至对数生长期。
（2）收获细胞，通过离心将菌体沉淀。
（3）将菌体重悬于碱溶液中，轻轻混匀后在冰上静置一定时间。
（4）加入中和溶液，混匀后离心。
（5）将上清液转移至新离心管中，加入异丙醇，混匀后离心。
（6）将异丙醇上清液转移至新离心管中，加入洗涤缓冲液，混匀后离心。
（7）将上清液转移至新离心管中，加入TE溶液溶解。
（8）测定质粒DNA的浓度和纯度。
三、实验结果与分析通过实验操作，成功提取到质粒DNA。
测定质粒DNA的浓度和纯度，结果显示浓度为X μg/μl，纯度（A260/A280）为X。
质粒DNA的浓度和纯度是评估提取质粒质量的重要指标，其高低直接影响后续实验的结果。
四、实验讨论本实验采用碱裂解法提取质粒，该方法操作简单、成本低廉，适用于小规模提取。
但是，碱裂解法提取的质粒DNA可能存在一定的污染物，如蛋白质、RNA 等。
此外，碱裂解法对于某些特殊的质粒可能效果不佳，需要根据实际情况选择合适的提取方法。
五、实验总结通过本实验，我们了解了碱裂解法提取质粒的原理和操作步骤，并成功提取到质粒DNA。
质粒DNA的浓度和纯度评估结果表明提取质粒的质量较好。
碱裂解法提取质粒DNA的实验原理和操作步骤
碱裂解法提取质粒DNA的实验原理和操作步骤碱裂解法是一种常用的方法，用于提取质粒DNA（plasmid DNA）纯化。
以下是具体的实验原理和操作步骤。
实验原理：碱裂解法利用碱性溶液将细菌细胞的细胞壁和细胞膜溶解，使细菌细胞内的质粒DNA被释放出来。
接着，使用中性化剂中和碱性溶液，使DNA带正电荷，而细胞中的蛋白质则带负电荷，从而能够通过离心将DNA与蛋白质分离。
最后，通过浓缩、洗涤和纯化，得到高质量的质粒DNA。
操作步骤：1.培养细菌：选取含有质粒DNA的细菌菌株，如大肠杆菌。
在含有适当抗生素的培养基中培养细菌菌株。
2.收获细菌：当菌液呈现较稠的浑浊状态时，收取细菌培养物。
使用离心机将菌液离心，分离菌体沉淀和上清液。
将上清液倒掉，保留菌体沉淀。
3.碱裂解：将菌体沉淀溶解于碱性溶液中，如盐酸和十二烷基硫酸钠（SDS）溶液。
轻轻混合并将溶液放入水浴中加热，使细菌细胞壁和细胞膜被溶解。
4.中和：使用中性化剂，如醋酸，使溶液中的酸性物质中和。
这样可以确保DNA带正电荷，而蛋白质和其他污染物则带负电荷。
5.离心：将溶液离心，在离心过程中，DNA会与细胞内其他分子分离，形成一个DNA沉淀。
上清液中含有蛋白质和其他污染物。
6.洗涤：使用洗涤缓冲液，如乙酸盐缓冲液，洗涤DNA沉淀，去除残留的污染物。
7.纯化：用去离子水溶解DNA沉淀，使其溶解在水中。
将溶解的DNA沉淀通过滤纸等过滤装置过滤掉残余杂质。
8.浓缩：通过酒精沉淀法或其他方法，将DNA溶液浓缩到所需的浓度。
9.检测：使用紫外分光光度计等方法，测定提取的质粒DNA的纯度和浓度。
注意事项：1.在实验过程中保持操作环境和仪器无菌。
2.碱裂解法中使用的溶液需准备新鲜，并避免受到污染。
3.操作过程中需要低温处理和离心操作，以保护DNA的完整性。
4.质粒DNA的提取可以根据实验目的进行进一步的扩增、测序或转染等应用。
总结：通过碱裂解法，可以从细菌中提取纯化的质粒DNA。
碱裂解法提取质粒原理
碱裂解法提取质粒原理
碱裂解法是一种常用的提取质粒的方法，其原理是利用碱性溶液将细菌细胞膜溶解，从而释放出质粒。
具体步骤如下：
1. 首先，培养含有目标质粒的细菌菌株，并收集足够数量的细菌细胞。
2. 将细菌细胞离心沉淀，去除上清液。
3. 使用含有碱性成分的溶液，如含有氢氧化钠和EDTA的碱
裂解液，将细菌细胞重悬。
4. 碱性溶液中的氢氧化钠会破坏细菌细胞膜的完整性，并且EDTA会螯合钙离子，进一步增强细菌细胞膜的脆弱性。
5. 经过一定时间的碱裂解作用，细菌细胞膜将被溶解，质粒被释放出来。
6. 使用中性化溶液，如盐酸或磷酸，可以调整溶液的酸碱度，使其接近中性，从而停止碱裂解的作用。
7. 利用离心的方法，将碱裂解液中的细菌残渣和其他杂质分离，得到含有质粒的上清液。
8. 最后，可通过柱层析等方法对上清液进行纯化，以获取纯净的质粒。
这种碱裂解法提取质粒的原理是利用碱性溶液破坏细菌细胞膜，从而释放出质粒。
与其他提取方法相比，这种方法简单易行，成本低廉，并且适用于大规模提取质粒。
实验一-碱裂解法提取质粒DNA
实验一-碱裂解法提取质粒DNA
碱裂解法是一种常用的质粒DNA提取方法。
下面是进行碱裂
解法提取质粒DNA的实验步骤：
1. 培养细胞：选择所需的质粒含有目标基因的细菌，如大肠杆菌等，并在适当的培养基中培养细菌，使其达到对数生长期。
2. 收集细菌：将培养好的细菌菌液转移到离心管中，并进行离心，以沉淀细菌。
3. 溶解细菌：加入一定浓度的碱液（例如0.2N NaOH）使细
菌溶解。
通常使用细菌菌液总量的1/5体积的碱液，并轻轻摇
晃混合。
4. 添加中和液：将等体积的中和液（例如3M乙酸酸化乙酸钠
溶液）加入到溶解好的细菌溶液中，并迅速而轻轻地混合。
5. 离心：将混合液进行离心，以除去沉淀的细菌残渣和碱液。
6. 提取DNA：将上一步离心得到的上清液转移至新的离心管中，加入等体积的冷乙醇，并轻轻摇晃，使DNA沉淀。
7. 沉淀DNA：进行高速离心，使DNA沉淀。
8. 弃去上清液：弃去上清液，保留沉淀的DNA。
9. 洗涤DNA：使用70%乙醇洗涤沉淀的DNA，以去除残留的盐类和碱液。
10. 干燥DNA：使用洗涤干净的乙醇或空气干燥DNA沉淀。
11. 溶解DNA：用适当的缓冲液（如TE缓冲液）溶解DNA。
12. 储存DNA：将溶解好的DNA储存于适当的温度和条件下，用于后续实验。
实验一碱裂解法提取质粒DNA
实验一-碱裂解法提取质粒DNA 碱裂解法是一种常用的提取质粒DNA的方法。
质粒是一种裸露的、结构简单的小型环状DNA，它们存在于许多细菌细胞中，可以自主复制和表达。
质粒通常用于克隆和转化实验，是分子生物学实验中常用的工具之一。
一、实验目的通过碱裂解法提取质粒DNA，进一步了解质粒的基本性质和提取过程，为后续的分子生物学实验打下基础。
二、实验原理碱裂解法是一种利用细菌细胞壁和质粒DNA在不同pH值下稳定性的差异，将细胞壁和质粒DNA分离的方法。
在pH值高于7.5的环境下，细菌细胞壁的稳定性降低，而质粒DNA的稳定性相对较高。
通过加入碱液（如NaOH）并加热，可以破坏细菌细胞壁，使细胞内容物释放出来。
在pH值低于7.5的环境下，质粒DNA的稳定性降低，而细菌染色体DNA的稳定性相对较高。
通过加入高浓度的醋酸钾溶液并冰浴，可以沉淀出染色体DNA，而质粒DNA则留在上清液中。
三、实验步骤1.准备所需试剂和器材，包括细菌培养液、NaOH、KAc、冰浴、离心管、移液器等。
2.将细菌培养液倒入离心管中，用移液器加入适量NaOH，搅拌均匀。
3.将离心管放入沸水浴中加热5分钟，使细菌细胞壁破裂，释放出细胞内容物。
4.用移液器加入适量KAc，搅拌均匀，使pH值降低至7.5以下。
5.将离心管放入冰浴中冷却10分钟，使染色体DNA沉淀出来。
6.用离心机将上清液和沉淀物分开，收集上清液。
7.在收集的上清液中加入适量的乙醇，放在-20℃冰箱中冷冻1小时，使质粒DNA沉淀出来。
8.用离心机将沉淀物和上清液分开，收集沉淀物。
9.用适量的TE缓冲液溶解沉淀物，得到质粒DNA溶液。
10.用紫外分光光度计测定质粒DNA溶液的浓度和质量。
四、实验结果与数据分析1.实验结果：通过紫外分光光度计测定，得到质粒DNA溶液的浓度和质量。
通常，提取到的质粒DNA溶液需要有一定的浓度和质量才能进行后续的分子生物学实验。
2.数据分析：根据实验数据可以分析出提取到的质粒DNA溶液的质量和浓度是否符合要求。
实验二 碱裂解法抽提质粒DNA-2
注意事项
1、因为细菌培养液中的细胞壁成分抑制限制性内切酶活性，所有未从细菌 沉淀中除去所有培养液可导致质粒不能被限制性内切酶切割或不能完全 切割。 2、酚：在酸性pH条件下，DNA分配于有机相。因此，使用前酚必须用水 饱和并用Tris平衡至 pH>7.8，以防DNA分配到有机相。
三、实验材料
1、 含有pBluescript II SK (+)(pSK)质粒载体的大肠杆菌菌株DH5α菌液
2、含有重组质粒 MP3的大肠杆菌菌株DH5α菌液
注：pBluescript是由Stratagene公司开发的噬菌粒载体（phagemid vector，由质 粒载体和单链噬菌体的复制起点结合而成）。
10、移取上清液（记体积），加2倍体积冷的无水乙醇（ -20 ℃冰箱），混匀；
11、离心（12000 rpm，10分钟，室温)，倒掉乙醇。离心几秒钟，用移液器尽可能 除去乙醇； 12、加入0.5 ml 70％乙醇洗DNA沉淀一次，离心2分钟，倒掉乙醇；
13、加40 μl 1× TE 溶解，于65℃热板上温育10分钟，之后于 -20 ℃保存备用。
7、离心几秒钟，用移液器尽可能除去酒精，风干（或热板上烘干1 min）。
8、根据DNA沉淀的大小加20~50 l 1× TE 溶解DNA沉淀，并在65℃热板上温育 10分钟（可使DNase失活），之后于 -20 ℃保存备用。
质粒抽提方法即去除 RNA，将质粒与细菌基因组 DNA分开，去除蛋白质及 其它杂质，以得到相对纯净的质粒。 使用相对过量的试剂 — 这是适合所有核酸抽提的建议。试剂相对过量的好处 是：稳定性好，纯度高，操作更简单。 关注溶液I、溶液II和溶液III的比例！
提取质粒--碱裂解法打印版
碱裂解法碱裂解液1组分浓度：25mM Tris-HCl(pH8.0),10mM EDTA,50mM glucose配制量：1L配制方法：1、量取下列溶液，置于1L烧杯中1M Tris-HCl(pH8.0) 25ml0.5M EDTA(pH8.0) 20ml20% glucose(1.11M) 45mlaH2O 910ml2、高温高压灭菌后，4℃保存3、使用前每50ml的碱裂解液1中加入2mlRNase A(20 ug/ml)1M Tris-HCl(pH8.0)配制量：1L配制方法：1、称量121.1g Tris 置于1L烧杯中2、加入约800ml的去离子水，充分搅拌溶解3、加入浓盐酸调节所需pH值pH 8.0 约 42ml4、定容至1L5、灭菌，室温保存注意：应使溶液冷却了再调pH值0.5M EDTA(pH8.0)配制量：1L配制方法：1、称取186.1gNa2EDTA.2H2O于1L烧杯中2、加入约800ml的去离子水，充分搅拌3、用NaOH调节pH至8.0（约20gNaOH）注意：pH至碱裂解液2组分浓度：200 mMNaOH,1%(w/v)SDS配制量：500 ml配制方法：1、量取下列溶液，置于500ml烧杯中50ml10% SDS 50ml2N NaOH 50ml2、加灭菌水定容至500ml，充分混匀3、室温保存，此溶液保存时间最好不要超过1个月注意：SDS易产生气泡，不要剧烈搅拌碱裂解液3组分浓度：3M KOAc,5M CH3COOH配制量：500ml配制方法：1、称量下列试剂，置于500ml烧杯中KOAc 147gCH3COOH 57.5 ml2、加入300ml去离子水后搅拌溶解3、加去离子水将溶液定容至500ml4、高温高压灭菌后，4℃保存Ⅰ1M Tris-HCl(pH 8.0)配制量：1L配制方法：1、称量121.1gTris置于1L烧杯中2、加入约800ml的去离子水，充分搅拌溶解3、加入浓盐酸调节所需的pH值Ph 8.0 约42ml4、定容至1L5、灭菌，室温保存应使溶液冷却了再调PH值0.5M EDTA(PH 8.0)配制量：1L配制方法：1、称取186.1gNa2EDTA.2H2O于1L烧杯中2、加入约800ml的去离子水，充分搅拌3、用NaOH调节pH至8.0（约20g NaOH）PH至8.0时，EDTA才能完全溶解4、加入去离子水，定容至1L5、适量分成小份，高温灭菌6、室温保存20%（w/v）glucose配制量：100ml方法：1、称取20g glucose置于100—200ml烧杯中，加入约80ml去离子水，搅拌溶解2、加去离子水定容至100ml3、灭菌，4℃保存Ⅱ2N NaOH配量：100ml方法：1、量取80ml去离子水于100-200ml塑料烧杯中2、称取8gNaOH小心加入烧杯中，边加边搅拌3、待NaOH完全溶解后，用去离子水将溶液定至100ml4、室温保存10% SDS（PH7.2）配制100ml方法：1、称取10gSDS于100-200ml烧杯中，加入约80ml去离子水，68℃加热溶解2、滴加浓HCl调至7.23、定容100ml，室温保存提取质粒注意事项：1、将菌种接种到LB培养基上（3ml），含适当培养基2、在离心管中加入1.5ml培养液，离心2min(12000改为15000rpm)3、倒去上清，重复2次，用枪吸去上清4、将菌沉淀重悬于100ul冰预冷的溶液Ⅰ，再涡旋搅拌剧烈振荡，室温放置5min5、加入200ul溶液Ⅱ，盖紧管口快速颠倒（勿振荡）ep管5次，充分混合后，充分混合内容物后，放在冰上4min6、加入150ul冰预冷溶液Ⅲ，盖紧管口，倒置振荡10s，将溶液Ⅲ分散均匀后，置于冰上3-5min，离心5min，12000rpm，取上清7、加入等量酚：氯仿：异戊醇25:24:1,12000rpm离心2min，取上清8、加入2倍体积冰无水乙醇，1/10NaOAc，冰箱放置30min（-20℃ 2小时以上，-80℃20-30min）以沉淀DNA9、4℃,12000rpm，5min离心（改为15000,8min）10、小心吸取上清，将离心管倒放在纸巾上，以使所有液体流出，并将附于管壁上的液滴除尽11、用1ml70%乙醇在4℃离心5min(12000rpm)，去上清12、干燥30min(空气中)，加入20ug（2ul）10mg/mlRNA酶和50ulTE，37℃反应1-3h，-20℃保存。
质粒DNA的提取（碱裂解法）
质粒DNA的提取（碱裂解法）实验原理：碱裂解法提取质粒利用的是共价闭合环状质粒DNA与线状的染色体DNA片段在拓扑学上的差异来分离它们。
在pH 值介于12.0-12.5这个狭窄的范围内，线状的DNA双螺旋结构解开变性，在这样的条件下，共价闭环质粒DNA的氢键虽然断裂，但两条互补链彼此依然相互盘绕而紧密地结合在一起。
当加入pH4.8的醋酸钾高盐缓冲液使pH降低后，共价闭合环状的质粒DNA的两条互补链迅速而准确地复性，而线状的染色体DNA的两条互补链彼此已完全分开，不能迅速而准确地复性，它们缠绕形成网状结构。
通过离心，染色体DNA 与不稳定的大分子RNA、蛋白质-SDS复合物等一起沉淀下来，而质粒DNA却留在上清液中。
提取步骤：1.吸取1.5mL菌液于1.5mL离心管中，4℃下12000rpm离心2min，吸干上清液，使细菌沉淀尽可能干燥2.加入100μLSolutionⅠ，枪头充分打匀，使细胞重新悬浮。
此步骤菌体一定要悬浮均匀，不能有结块，否则会降低抽提得率3.加入200μL新配制的SolutionⅡ，轻柔颠倒混匀（千万不要振荡），冰上放置至清亮（小于5min）。
这一步操作要注意两点：第一，时间不能过长，因为在这样的碱性条件下基因组DNA片断会慢慢断裂；第二，必须温柔混合，不然基因组DNA也会断裂。
4.加入150μL solutionⅢ，颠倒混匀（温和振荡10秒），使溶液Ⅲ在粘稠的细菌裂解物中分散均匀冰浴10min，使杂质充分沉淀5.4℃下12000rpm离心15min，小心将上清转至新的1.5mL离心管中6.加入6μL 10μgl/μL的RaseA，混匀，37℃温浴30min。
7.等体积TriS饱和酚:氯仿:异戊醇(25:24:l)抽提1次，小心将上清吸至新的 1.5mL离心管中8.等体积氯仿:异戊醇(24:l)抽提1次，小心将上清吸至新的 1.5mL离心管中9.加入2.5倍体积的冰冻无水乙醇，冰浴0.5-1h，沉淀双链 DNA。
碱裂解法提取质粒DNA
碱裂解法
1、取1.5ml培养液倒入1.5ml离心管中，4℃下12000g离心30秒。
2、弃上清，将管倒置于卫生纸上数分钟，使液体流尽。
3、菌体沉淀重悬浮于100μl溶液Ⅰ中（需剧烈振荡），室温下放置5-10分钟。
4、加入新配制的溶液Ⅱ200μl，盖紧管口，快速温和颠倒离心管数次，以混匀内容物（千万不要振荡），冰浴5分钟。
5、加入150μl预冷的溶液Ⅲ，盖紧管口，并倒置离心管，温和振荡10秒，使沉淀混匀，冰浴中5-10分钟，4℃下12000g离心5-10分钟。
6、上清液移入干净离心管中，加入等体积的酚/氯仿（1:1），振荡混匀，4℃下12000g离心5分钟。
7、将水相移入干净离心管中，加入2倍体积的无水乙醇，振荡混匀后置于-20℃冰箱中20分钟，然后4℃下12000g离心10分钟。
8、弃上清，将管口敞开倒置于卫生纸上使所有液体流出，加入1ml70％乙醇洗沉淀一次，4℃下12000g离心5-10分钟。
9、吸除上清液，将管倒置于卫生纸上使液体流尽，真空干燥10分钟或室温干燥。
10、将沉淀溶于20μl STE缓冲液（pH8.0，含20μg/mlRNaseA）中，储于-20℃冰箱中。
[注意]1.提取过程应尽量保持低温。
2.提取质粒DNA过程中除去蛋白很重要，采用酚/氯仿去除蛋白效果较单独用酚或氯仿好，要将蛋白尽量除干净需多次抽提。
3.沉淀DNA通常使用冰乙醇，在低温条件下放置时间稍长可使DNA沉淀完全。
沉淀DNA也可用异丙醇（一般使用等体积），且沉淀完全，速度快，但常把盐沉淀下来，所以多数还是用乙醇。
碱裂解法提取质粒dna临床应用
碱裂解法是一种常用的质粒DNA提取方法，适用于从细菌、真菌、酵母等微生物中提取质粒DNA。其具体步骤为：
1.培养目标微生物，并将其离心收集细胞。
2.用0.9% NaCl溶液洗涤细胞，去除培养基残留物和细胞外DNA。
3.加入低浓度的缓冲液和碱液，使细胞壁和细胞膜破裂，释放出DNA。
4.加入醋酸和等体积的异丙醇，沉淀DNA。
5.离心、洗涤、干燥DNA沉淀。
6.加入适量的去离子水，溶解DNA。
7.经过纯化、定量、检测等步骤后即可应用于PCR扩增、测序等实验中。
该方法优点在于操作简单、成本低回收率高、适用范围广，但也有其缺点，如提取的DNA质量较差，含有大量杂质等。因此，在具体实验中应根据需要选择最适合的提取方法。
碱裂解法提取质粒
碱裂解法是一种应用最为广泛的制备质粒DNA的方法，碱变性抽提质粒DNA是基于染色体DNA与质粒DNA的变性与复性的差异而达到分离目的。
在pH值高达12.6的碱性条件下，染色体DNA的氢键断裂，双螺旋结构解开而变性。
质粒DNA的大部分氢键也断裂，但超螺旋共价闭合环状的两条互补链不会完全分离，当以pH4.8的NaAc/KAc高盐缓冲液去调节其pH值至中性时，变性的质粒DNA又恢复原来的构型，保存在溶液中，而染色体DNA不能复性而形成缠连的网状结构，通过离心，染色体DNA与不稳定的大分子RNA、蛋白质－SDS 复合物等一起沉淀下来而被除去。
溶液1 溶解细胞壁
溶液2 裂解，溶解细胞膜核蛋白
溶液3 复性
用试剂盒提取质粒，有一个很关键的步骤，就是裂解时不要超过5min，如果裂解时间过长，会有基因组污染
三条带以电泳速度的快慢而排序，分别是超螺旋、开环和复制中间体（即没有复制完全的两个质粒连在了一起）。
如果你不小心在溶液II加入后过度振荡，会有第四条带，这条带泳动得较慢，远离这三条带，是20-100kb的大肠杆菌基因组DNA的片断。
碱裂解法提取质粒-配方,最好的说明
碱裂解法提取质粒一、基本概念1．质粒：质粒是染色体外能够进行自主复制的遗传单位，包括真核生物的细胞器和细菌细胞中染色体以外的脱氧核糖核酸(DNA)分子。
现在习惯上用来专指细菌、酵母菌和放线菌等生物中染色体以外的DNA分子。
在基因工程中质粒常被用做基因的载体。
许多细菌除了染色体外，还有大量很小的环状DNA分子，这就是质粒(plasmid)。
质粒上常有抗生素的抗性基因，例如，四环素抗性基因或卡那霉素抗性基因等。
有些质粒称为附加体(episome)，这类质粒能够整合进细菌的染色体，也能从整合位置上切离下来成为游离于染色体外的DNA分子。
目前，已发现有质粒的细菌有几百种，已知的绝大多数的细菌质粒都是闭合环状DNA分子(简称cccDNA)。
细菌质粒的相对分子质量一般较小，约为细菌染色体的0.5%～3%。
根据相对分子质量的大小，大致上可以把质粒分成大小两类：较大一类的相对分子质量是40×106以上，较小一类的相对分子质量是10×106以下(少数质粒的相对分子质量介于两者之间)。
每个细胞中的质粒数主要决定于质粒本身的复制特性。
按照复制性质，可以把质粒分为两类：一类是严紧型质粒，当细胞染色体复制一次时，质粒也复制一次，每个细胞内只有1～2个质粒;另一类是松弛型质粒，当染色体复制停止后仍然能继续复制，每一个细胞内一般有20个左右质粒。
一般分子量较大的质粒属严紧型。
分子量较小的质粒属松弛型。
质粒的复制有时和它们的宿主细胞有关，某些质粒在大肠杆菌内的复制属严紧型，而在变形杆菌内则属松弛型。
在基因工程中，常用人工构建的质粒作为载体。
人工构建的质粒可以集多种有用的特征于一体，如含多种单一酶切位点、抗生素耐药性等。
常用的人工质粒运载体有pBR322、pSC101。
pBR322含有抗四环素基因(Tcr)和抗氨苄青霉素基因(Apr)，并含有5种内切酶的单一切点。
如果将DNA片段插入EcoRI切点，不会影响两个抗生素基因的表达。
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碱裂解法质粒提取的原理
碱裂解法从大肠杆菌制备质粒，是从事分子生物学研究的实验室每天都要用的常规技术。
下面是该法的提取原理:
碱法质粒抽提用到三种溶液：
溶液I，50 mM葡萄糖/ 25 mM Tris-Cl / 10 mM EDTA，pH 8.0；
溶液II，0.2 N NaOH / 1% SDS；
溶液III，3 M 醋酸钾/ 2 M 醋酸。
溶液I的作用
任何生物化学反应，首先要控制好溶液的pH，因此用适当浓度的和适当pH值的Tris-Cl 溶液，是再自然不过的了。
那么50 mM葡萄糖是干什么的呢？说起来不可思议，加了葡萄糖后最大的好处只是悬浮后的大肠杆菌不会快速沉积到管子的底部。
因此，如果溶液I中缺了葡萄糖其实对质粒的抽提本身而言，几乎没有任何影响。
所以说溶液I中葡萄糖是可缺的。
那么EDTA呢？大家知道EDTA是Ca2+和Mg2+等二价金属离子的螯合剂，配在分子生物学试剂中的主要作用是：抑制DNase的活性，和抑制微生物生长。
在溶液I中加入高达10 mM 的EDTA，无非就是要把大肠杆菌细胞中的所有二价金属离子都螯合掉。
如果不加EDTA，其实也没什么大不了的，只要不磨洋工，只要是在不太长的时间里完成质粒抽提，就不用怕DNA会迅速被降解，因为最终溶解质粒的TE缓冲液中有EDTA。
如果哪天你手上正好缺了溶液I，可不可以抽提质粒呢？实话告诉你，只要用等体积的水，或LB培养基来悬浮菌体就可以了。
有一点不能忘的是，菌体一定要悬浮均匀，不能有结块。
溶液II的作用
这是用新鲜的0.4 N的NaOH和2％的SDS等体积混合后使用的。
要新从浓NaOH稀释制备0.4N的NaOH，无非是为了保证NaOH没有吸收空气中的CO2而减弱了碱性。
其实破细胞的主要是碱，而不是SDS，所以才叫碱法抽提。
事实上NaOH是最佳的溶解细胞的试剂，不管是大肠杆菌还是哺乳动物细胞，碰到了碱都会几乎在瞬间就溶解，这是由于细胞膜发生了从bilayer（双层膜）结构向micelle（微囊）结构的相变化所导致。
用了不新鲜的0.4 N NaOH，即便是有SDS也无法有效溶解大肠杆菌，自然就难高效率抽提得到质粒。
如果只用SDS当然也能抽提得到少量质粒，因为SDS也是碱性的，只是弱了点而已。
很多人对NaOH 的作用误以为是为了让基因组DNA变性，以便沉淀，这是由于没有正确理解一些书上的有关DNA变性复性的描述所导致。
有人不禁要问，既然是NaOH溶解的细胞，那为什么要加SDS呢？那是为下一步操作做的铺垫。
这一步要记住两点：第一，时间不能过长，因为在这样的碱性条件下基因组DNA片断会慢慢断裂；第二，必须温柔混合，不然基因组DNA也会断裂。
基因组DNA的断裂会带来麻烦。
溶液III的作用
溶液III加入后就会有大量的沉淀，但大部分人却不明白这沉淀的本质。
最容易产生的误解是，当SDS碰到酸性后发生的沉淀。
如果你这样怀疑，往1%的SDS溶液中加如2M 的醋酸溶液看看就知道不是这么回事了。
大量沉淀的出现，显然与SDS的加入有关系。
如果在溶液II中不加SDS会怎样呢，也会有少量的沉淀，但量上要少得多，显然是盐析和酸变性沉淀出来的蛋白质。
既然SDS不是遇酸发生的沉淀，那会不会是遇盐发生的沉淀呢？在1％的SDS溶液中慢慢加入5 N的NaCl，你会发现SDS在高盐浓度下是会产生沉淀的。
因此高浓度的盐导致了SDS的沉淀。
但如果你加入的不是NaCl而是KCl，你会发现沉淀的量要多的多。
这其实是十二烷基硫酸钠（sodium dodecylsulfate）遇到钾离子后变成了十二
烷基硫酸钾（potassium dodecylsulfate, PDS），而PDS是水不溶的，因此发生了沉淀。
如此看来，溶液III加入后的沉淀实际上是钾离子置换了SDS中的钠离子形成了不溶性的PDS，而高浓度的盐，使得沉淀更完全。
大家知道SDS专门喜欢和蛋白质结合，平均两个氨基酸上结合一个SDS分子，钾钠离子置换所产生的大量沉淀自然就将绝大部分蛋白质沉淀了，让人高兴的是大肠杆菌的基因组DNA也一起被共沉淀了。
这个过程不难想象，因为基因组DNA太长了，长长的DNA自然容易被PDS给共沉淀了，尽管SDS并不与DNA分子结合。
那么2 M的醋酸又是为什么而加的呢？是为了中和NaOH，因为长时间的碱性条件会打断DNA，所以要中和之。
基因组DNA一旦发生断裂，只要是50－100 kb大小的片断，就没有办法再被PDS共沉淀了。
所以碱处理的时间要短，而且不得激烈振荡，不然最后得到的质粒上总会有大量的基因组DNA混入，琼脂糖电泳可以观察到一条浓浓的总DNA条带。
很多人误认为是溶液III加入后基因组DNA无法快速复性就被沉淀了，这是天大的误会，因为变性的也好复性的也好，DNA分子在中性溶液中都是溶解的。
NaOH本来是为了溶解细胞而用的，DNA分子的变性其实是个副产物，与它是不是沉淀下来其实没有关系。
溶液III 加入并混合均匀后在冰上放置，目的是为了PDS沉淀更充分一点。
酚/氯仿纯化
不要以为PDS沉淀的形成就能将所有的蛋白质沉淀了，其实还有很多蛋白质不能被沉淀，因此要用酚/氯仿/异戊醇进行抽提，然后进行酒精沉淀才能得到质量稳定的质粒DNA，不然时间一长就会因为混入的DNase而发生降解。
这里用25/24/1的酚/氯仿/异戊醇是有很多道理的，这里做个全面的介绍。
酚（Phenol）对蛋白质的变性作用远大于氯仿，按道理应该用酚来最大程度将蛋白质抽提掉，但是水饱和酚的比重略比水重，碰到高浓度的盐溶液（比如4M的异硫氰酸胍），离心后酚相会跑到上层，不利于含质粒的水相的回收；但加入氯仿后可以增加比重，使得酚/氯仿始终在下层，方便水相的回收；还有一点，酚与水有很大的互溶性，如果单独用酚抽提后会有大量的酚溶解到水相中，而酚会抑制很多酶反应（比如限制性酶切反应），因此如果单独用酚抽提后一定要用氯仿抽提一次将水相中的酚去除，而用酚/氯仿的混合液进行抽提，跑到水相中的酚则少得多，微量的酚在乙醇沉淀时就会被除干净而不必担心酶切等反应不能正常进行。
至于异戊醇的添加，其作用主要是为了让离心后上下层的界面更加清晰，也方便了水相的回收。
回收后的水相含有足够多的盐，因此只要加入2倍体积的乙醇，在室温放置几分钟后离心就可以将质粒DNA沉淀出来。
这时候如果放到－20℃，时间一长反而会导致大量盐的沉淀，这点不同于普通的DNA酒精沉淀回收，所以不要过分小心了。
高浓度的盐会水合大量的水分子，因此DNA分子之间就容易形成氢键而发生沉淀。
如果感觉发生了盐的沉淀，就用70％的乙醇多洗几次，每次在室温放置一个小时以上，并用tip将沉淀打碎，就能得到好的样品。
得到的质粒样品一般用含RNase（50 ug/ml）的TE缓冲液进行溶解，不然大量未降解的RNA会干扰电泳结果的。
质粒检测
琼脂糖电泳进行鉴定质粒DNA时，多数情况下你能看到三条带，但千万不要认为你看到的是超螺旋、线性和开环这三条带。
碱法抽提得到质粒样品中不含线性DNA，不信的话你用EcoRI来线性化质粒后再进行琼脂糖电泳，就会看到线性质粒DNA的位置与这三条带的位置不一样。
其实这三条带以电泳速度的快慢而排序，分别是超螺旋、开环和复制中间体（即没有复制完全的两个质粒连在了一起）。
如果你不小心在溶液II加入后过度振荡，会有第四条带，这条带泳动得较慢，远离这三条带，是20-100kb的大肠杆菌基因组DNA的片断。
非常偶然的是，有时候抽提到的质粒会有7－10条带，这是由于特殊的DNA序列导致了不同程度的超螺旋（超螺旋的圈数不同）所致。