噬菌体效价及转导实验
P1噬菌体转导敲除基因的实验步骤
P1噬菌体转导基因敲除操作步骤实验室常用大肠杆菌基因敲除方法为P1噬菌体转导敲除。
大肠杆菌利用噬菌体为媒介，将供体细胞DNA转移给受体细胞，从而使受体细胞的基因型和表现型发生改变，这一过程称为转导。
P1噬菌体的DNA分子量为5.8×107Da，在复制过程中，头部包装时容易发生错误包装，可将其宿主菌（供体菌）的基因组DNA误包入蛋白质衣壳内。
当用这一噬菌体裂解液侵染新的宿主菌（受体菌）时，供体菌的DNA片段可随P1噬菌体进入受体菌内，并可以与受体菌基因进行同源重组，从而永久性的存在于受体菌基因组上。
P1转导的频率一般很低，需要选择性标记进行转导子筛选，本实验中为卡那霉素抗性基因（KmR）。
准备材料LB液体试管，LB半固体培养基，LB固体培养基，20%（w/v）葡萄糖溶液，1M CaCl2溶液，1M MgSO4溶液，氯仿，1M柠檬酸三钠溶液；效价109-1010（pfu/mL） P1噬菌体储液，大肠杆菌溶源性供体菌，大肠杆菌受体菌；TM buffer：10mM Tris-HCl（pH7.4）buffer加入10mM MgSO4；P1盐溶液：10mM CaCl2与5mM MgSO4的混合溶液；实验步骤平板培养法准备野生菌种子液自保存甘油管或划线培养平板上，转接到3mL LB液体试管中，37℃，250rpm，培养过夜（12hr）。
制备野生型P1噬菌体1.将野生型菌株的过夜种子液，按1%（v/v）转接5mL LB液体试管，摇床培养至对数中期（~2*108细胞/mL，OD600=0.2~0.3）。
2.加入5mM CaCl2，继续培养至菌体细胞OD600=1。
3.取出野生菌培养液，低温聚菌，加入2倍体积的TM buffer重悬菌体。
4.倒下层平板，LB固体培养基中加入5mM CaCl2。
5.取2.5mL半固体LB培养基，加入0.25mL重悬菌液，混合均匀后倒在下层平板上，轻柔地倾斜平板使其均匀地覆盖在下层培养基表面。
噬菌体的效价测定
裂解 成熟
增殖
侵入 吸附
⑤
★烈性噬菌体与温和噬菌体旳生活史比较：
裂解性循环 屡次循环
溶原性循环
自发或诱导
同步复制 整合
⑥★溶源性菌株旳检验：
措施：在合适旳培养基中培养待测菌样→→在对 数期进行紫外线照射，诱导原噬菌体复制→→进 一步培养→→过滤培养物，去处活菌体→→滤液 与指示菌混合、倒平板（或将滤液加到敏感性指 示菌旳液体培养物中）→→观察是否有噬菌斑出 现（或使菌液变清）.
★一步生长（One-step growth)
成 熟 的 噬 菌 体 粒 子 ， 除 M13 等 少 数 噬 菌 体 外 ，均 借宿主细胞裂解而释放。细菌的裂解导致一种肉眼可 见 的培养物溶解。 噬菌体的这种生长 (繁 殖 )方 式 称 为 一步生长。
如果只观察一个被感染的细胞，噬菌体数目的增 殖过程将是一条垂直于时间的直线：
A mob of bacteriophage attacking E. coli
The oval object that stretches diagonally across the micrograph top-to-bottom is a single bacterium. The much smaller and far more numerous round guys, practically paving the surface of the bacterium, are the bacteriophage heads.
●敏感性指示菌——遇溶源菌裂解后所释放旳温和噬菌体 会裂解性生活周期旳非溶源性菌株，这些菌株能够从自然 界或菌种库中取得。
⑦★溶源菌有下列特征：
☆可稳定遗传，即溶源菌旳子细胞一般也是溶原性 旳。 ☆自发裂解和诱发裂解（具有产生噬菌体旳潜在能 力） ☆具有抗同原噬菌体感染旳“免疫性” ☆溶源性细菌旳复愈 ☆取得新旳生理特征（溶源性转变） ☆不足转导
噬菌体效价实验
中国典型培养物保存中心China Center for Type Culture Collection (CCTCC)噬菌体效价实验实验材料：菌株：CCTCC AB 2013329（λ噬菌体溶原株）Escherichia coli K12 WK 6 λCCTCC AB 2013330（λ噬菌体敏感株）Escherichia coli C600 CR34培养基：肉汤培养基；软琼脂：肉汤培养基中加入0.5%琼脂10ml/管培养条件：NA培养基或LB培养基，37℃实验步骤：7.5ml 新鲜E.coliλ菌液（CCTCC AB 2013329）离心菌沉淀用1ml无菌水悬浮菌悬液加在无菌平皿中央，开皿盖，在安全柜的紫外灯下照射15秒（0.15mJ/cm2）加入NA培养液5ml37℃暗培养3小时吸取以上菌液-培养液混合物，加1 - 0.5ml氯仿震荡后离心12000rpm2分钟上清十倍稀释至10-7选择10-5、10-6、10-7上清稀释液100ul 与100ul受体菌（CCTCC AB 2013330）混合37℃温浴20分钟混合菌液加入到NA软琼脂（不烫手）中震荡混匀倒NA平板实验结果：稀释度为10-4的平板：布满噬斑不可数稀释度为10-5的平板：噬斑346个稀释度为10-6的平板：噬斑37个稀释度为10-7的平板：噬斑4个图1. 上一排为平板背面照片，下一排为平板正面照片。
教学建议：噬菌体液体放置在室温下两周会导致数量下降一个数量级。
宿主菌必须是噬菌体敏感菌株CCTCC AB 2013330，教学用普通大肠菌和噬菌体溶原菌株不能产生噬菌斑。
琼脂的浓度（1.5%-2.0%），过高或过低的琼脂含量均不能达到好的效果。
噬菌体与细胞的比例，测定噬菌体效价应采用低感染复数。
指示菌密度是在平板上获得清晰噬菌斑效果的重要因素之一，其细胞密度不宜过高。
一般控制在1ⅹ107个细胞/ml为宜。
实验教材：沈萍，陈向东《微生物学实验》4版. 高等教育出版社.2007, 35-39.王建波，方呈祥《遗传学实验教程》武汉大学出版社. 2004, 111-114.。
P1噬菌体转导敲除基因的实验步骤
P1噬菌体转导基因敲除操作步骤实验室常用大肠杆菌基因敲除方法为P1噬菌体转导敲除。
大肠杆菌利用噬菌体为媒介，将供体细胞DNA转移给受体细胞，从而使受体细胞的基因型和表现型发生改变，这一过程称为转导。
P1噬菌体的DNA分子量为5.8×107Da，在复制过程中，头部包装时容易发生错误包装，可将其宿主菌（供体菌）的基因组DNA误包入蛋白质衣壳内。
当用这一噬菌体裂解液侵染新的宿主菌（受体菌）时，供体菌的DNA片段可随P1噬菌体进入受体菌内，并可以与受体菌基因进行同源重组，从而永久性的存在于受体菌基因组上。
P1转导的频率一般很低，需要选择性标记进行转导子筛选，本实验中为卡那霉素抗性基因（KmR）。
准备材料LB液体试管，LB半固体培养基，LB固体培养基，20%（w/v）葡萄糖溶液，1M CaCl2溶液，1M MgSO4溶液，氯仿，1M柠檬酸三钠溶液；效价109-1010（pfu/mL） P1噬菌体储液，大肠杆菌溶源性供体菌，大肠杆菌受体菌；TM buffer：10mM Tris-HCl（pH7.4）buffer加入10mM MgSO4；P1盐溶液：10mM CaCl2与5mM MgSO4的混合溶液；实验步骤平板培养法准备野生菌种子液自保存甘油管或划线培养平板上，转接到3mL LB液体试管中，37℃，250rpm，培养过夜（12hr）。
制备野生型P1噬菌体1.将野生型菌株的过夜种子液，按1%（v/v）转接5mL LB液体试管，摇床培养至对数中期（~2*108细胞/mL，OD600=0.2~0.3）。
2.加入5mM CaCl2，继续培养至菌体细胞OD600=1。
3.取出野生菌培养液，低温聚菌，加入2倍体积的TM buffer重悬菌体。
4.倒下层平板，LB固体培养基中加入5mM CaCl2。
5.取2.5mL半固体LB培养基，加入0.25mL重悬菌液，混合均匀后倒在下层平板上，轻柔地倾斜平板使其均匀地覆盖在下层培养基表面。
噬菌体转导的操作方法
噬菌体转导的操作方法噬菌体是一种可以侵染并感染细菌的寄生病毒。
也可以通过一定的操作方法进行噬菌体的转导，即将噬菌体导入到目标细菌中。
噬菌体转导的方法有多种，包括传统的混合转染和现代的质粒张量传递等。
下面将详细介绍这些方法以及其他与噬菌体转导相关的操作步骤。
一、传统的混合转染方法1. 实验室条件准备：首先需要在无菌环境下操作，在实验室环境中设置无菌台，准备好所需的培养基、细菌菌种、噬菌体溶液和培养皿等。
2. 培养目标细菌：首先，将目标细菌分别接种到含有适合其生长的培养基中，培养至合适的生长状态。
3. 噬菌体溶液制备：将待转导的噬菌体培养物取出，可以进行多次离心洗涤，以去除一些不必要的物质。
然后将噬菌体溶液稀释合适的倍数，通常以MOI （Multiplicity of Infection）为计量单位，即用噬菌体粒子数和目标细胞数的比值来衡量噬菌体转染的效果。
4. 转染实验操作步骤：将噬菌体溶液与目标细菌培养物混合均匀，使噬菌体感染目标细菌。
通常，将细菌培养物与噬菌体溶液在37下静置一段时间（通常为10-30分钟）或在摇床上轻微摇动，以促进噬菌体与细菌结合。
然后，将混合物转移到预先加热的琼脂糖平板上，并均匀摇晃，使得细菌和噬菌体充分接触。
然后将含有混合物的琼脂糖平板培养在适当的温度下，通常在37下培养一段时间，让噬菌体感染目标细菌并形成溶菌斑。
5. 结果分析：观察琼脂糖平板上是否出现了溶菌斑，即噬菌体感染目标细菌后引起的溶解区域。
溶菌斑的大小和数量可以用来评估噬菌体的转导效果和细菌对噬菌体的感受性。
二、质粒张量传递方法传统的混合转染方法虽然简单易行，但受到不少限制，如只能传递噬菌体基因组，不能有效转导大分子质粒等。
而质粒张量传递方法则可以绕过这些限制，使得噬菌体转导的应用领域更加广泛。
1. 质粒构建：首先，需要构建带有目的基因的质粒，该质粒通常包括适当的启动子、转录起始序列、编码序列和终止序列。
2. 噬菌体构建：然后，将构建好的质粒导入到适当的噬菌体质粒载体中。
实验十二 噬菌体效价的测定
实验十二噬菌体效价的测定一、实验目的1、学习并掌握噬菌体效价的测定原理。
2、学习并掌握双层琼脂平板法测定噬菌体效价。
二、实验原理噬菌体属于细菌病毒，它不具备完整的细胞结构，只能通过寄主细胞完成自我复制。
因此人类只有通过电子显微镜才可观察到它们的形态结构。
但由于噬菌体侵染细菌细胞后，可导致寄主细胞裂解死亡，并在琼脂培养基表面形成是菌斑，所以人们可以此来判断噬菌体的存在。
当烈性噬菌体侵染敏感细菌后,会迅速引起敏感细菌裂解，释放出大量子代噬菌体，然后它们再扩散和侵染周围细胞，结果就会在菌苔上形成一个具有一定形状、大小、边缘和透明度的肉眼可见噬菌斑(plague)。
噬菌体的效价：１mL样品中所含侵染性噬菌体的粒子数。
其测定常用双层琼脂平板法。
由此得到的噬菌斑形态、大小较一致且清晰度高，计算准确。
根据不同稀释度平板上出现的噬菌斑数目，即可算出原液噬菌体的效价。
双层琼脂平板的配制：底层平板（1.5~2％琼脂的LB培养基10ml)，将适当稀释的噬菌体与培养至对数期的受体菌混合，保温吸附，加入45°左右的半固体琼脂糖，迅速混匀铺平板作为上层。
计算公式：噬菌体效价(pfu/ml)=噬菌斑数×稀释倍数×10；（这里的10为换算单位，即实验中用到100μl噬菌体原液，换算成1000μl，即1ml时，要乘以10）三、操作步骤流程图流程步骤目的1、制备9套LB 固体培养基底层平板将融化并冷却至45℃左右的LB培养基倒入无菌培养皿，每皿约10~12ml.水平放置，凝固后做好稀释度标记。
1、提供细菌生长营养物质2、提供更加平整的平面2、制备噬菌体稀释液取0.5mL噬菌体原液于4.5mL无菌水中得到10-1稀释液。
再取0.5ml10-1稀释液于4.5ml缓冲液中得到10-2稀释液。
同理再制备10-3稀释液，并在试管上标记备用。
（稀释过程应充分混匀）通过连续稀释使单个噬菌体吸附一个大肠杆菌细胞。
3、制备受体菌细胞将感受态大肠杆菌接种于50ml LB培养液，经过夜培养，离心收集菌体细胞，悬浮于20ml10mM MgSO4中备用。
噬菌体的检查及效价测定
5.3 噬菌体与菌液混合：
将11支灭菌空试管分别标记10-4、10-5、10-6和对照。分别从10-4、10-5和10-6噬菌体稀释液中吸取0.1mL于上述编号的无菌试管 中，每个稀释度平行做三个管，在另外两支对照管中加0.1mL无菌水，并分别于各管中加入0.2mL大肠杆菌菌悬液，振荡试管使菌液与噬菌体液混合均匀， 置37℃水浴中保温5min，让噬菌体粒子充分吸附并侵入菌体细胞。
5.1.5 离心分离加热法（快速检查）
取大肠杆菌正常培养液和侵染有噬菌体的异常大肠杆菌培养液，4000rpm离心20min，分别取两组发酵液的上清液(A1)，一部分于721分光光度计上测定OD650光密度值，另外各取5mL上清液于试管中，置水浴中煮沸2min（A2），检测A2溶液OD650光密度值，记录结果。
5.4 接种上层平板：
将11支融化并保温于45℃的上层肉膏蛋白胨半固体琼脂培养基5mL分别加入到含有噬菌体和敏感菌液的混合管中，迅速搓匀，立即倒入相应编号的底层培养基平板表面，边倒入边摇动平板使其迅速地铺展表面。水平静置，凝固后置37℃培养。
5.5 观察并计数：
观察平板中的噬菌斑，并将结果记录于 计算公式：N=Y/V%26#8226;X
1、目的：
1.1 了解噬菌体效价的含义及其测定原理。
1.2 学会检查噬菌体的方法。
1.3 掌握用双层琼脂平板Байду номын сангаас测定噬菌体效价的操作技能。
双层平板法测定噬菌体效价的原理
双层平板法测定噬菌体效价的原理一、引言噬菌体是一种专门寄生于细菌体内的病毒，可以通过感染和杀死宿主细菌来控制细菌数量。
测定噬菌体效价是评估噬菌体活性和浓度的重要方法之一。
双层平板法是常用的测定噬菌体效价的方法之一，本文将详细介绍双层平板法测定噬菌体效价的原理。
二、仪器与试剂1. 噬菌体悬液：含有足够数量的噬菌体，用于感染宿主细胞。
2. 宿主细胞：适合噬菌体生长和复制的细胞。
3. 导管或微量移液器：用于移液。
4. 烧杯或容量瓶：用于配制琼脂。
5. 琼脂：用于制备双层平板。
6. 加热设备：用于消毒琼脂和灭活宿主细胞。
三、实验步骤1. 制备下层琼脂：将适量琼脂加入烧杯或容量瓶中，加入适量培养基，加热至完全溶解，然后冷却至约50℃。
2. 制备上层琼脂：将适量琼脂加入烧杯或容量瓶中，加入适量培养基和宿主细胞悬液，加热至完全溶解，然后冷却至约50℃。
3. 取下层琼脂约1-2mL放入试管中，倒置试管使琼脂均匀附着于试管壁。
4. 等待下层琼脂凝固。
5. 将上层琼脂与宿主细胞悬液混合均匀后取出适量液体（通常为0.1-0.2mL），加入噬菌体悬液中并混合均匀。
6. 取出一定数量的上述混合液滴到已经凝固的下层琼脂表面上，并轻轻晃动试管使混合液均匀分布于下层琼脂表面上。
7. 等待双层平板凝固并在恰当的条件下培养宿主细胞和噬菌体。
通常在37℃、5%CO2、湿度100%的条件下培养16-20小时。
8. 观察双层平板上的细胞和噬菌体生长情况，记录噬菌体效价。
四、原理1. 下层琼脂：下层琼脂是一种固态培养基，用于支撑和定位上层琼脂。
下层琼脂通常不含任何添加物，以便于观察宿主细胞和噬菌体的生长情况。
2. 上层琼脂：上层琼脂是一种含有宿主细胞悬液的固态培养基，用于感染噬菌体并观察其效应。
在上层琼脂中加入宿主细胞悬液可以提供足够数量的宿主细胞，并为噬菌体复制提供必要的条件。
3. 噬菌体悬液：噬菌体悬液中含有足够数量的噬菌体，可以感染并杀死宿主细胞。
9噬菌体效价学习资料
噬菌体效价的测定一、实验目的1、了解温和噬菌体与宿主菌之间的溶原关系；2、学习利用溶原性细菌制备噬菌体裂解液方法；3、学习双层平板法测定噬菌体效价的方法；4、以局限性转导为例来，学习转导的基本原理；掌握转导实验的基本方法，测定转导率。
二、实验原理▪细菌转导：由噬菌体为媒介将一个细胞的遗传物质转移给另一个细胞的过程。
▪转导可分为局限性转导和普遍性转导两大类。
普遍性转导：▪噬菌体能转导供体细菌的任何基因；如鼠伤寒沙门氏菌的P22噬菌体、大肠杆菌的P1噬菌体、枯草杆菌的PBS1、PBS2、SP10噬菌体等；▪其机制在于这些噬菌体可以整合在供体菌染色体DNA的任何位置上。
P22噬菌体局限性转导：噬菌体只能转导供体菌染色体DNA上的某些特定基因；如λ噬菌体只能转导供体菌E.coli K12染色体上的半乳糖基因和生物素基因。
产生局限性转导的原因在于这些噬菌体仅能整合在供体菌染色体DNA的特定位置上。
λ(dgal +)λ(dbio +)λ原噬菌体▪转导实验中常用的是λ噬菌体，它能整合在大肠杆菌染色体DNA 上的半乳糖基因（gal ）和生物素基因(bio) 之间，因此，它能转导gal 基因又能转导bio 基因。
噬菌体的溶原▪温和噬菌体侵染细胞后整合到宿主的染色体组中，使宿主细菌成为溶源性细菌。
▪溶源性细菌一般在生长繁殖过程中可自发的发生极低频率的裂解，释放出具有感染力的噬菌体。
可以用物理或化学的方法诱导，使其大部分或全部裂解。
▪检测时需要有对此温和噬菌体敏感的细胞，即溶源性细菌释放的噬菌体对于该细胞而言是烈性噬菌体，被称为受体菌。
λ(dgal +)λ裂解液中λ(dgal +)(转导噬菌体)占50%λ(正常噬菌体)占50%宿主菌染色体供体菌E.coli k 12(λ) gal+▪是一种双重溶源菌▪此菌中λ噬菌体与gal +基因紧密连锁，当其受紫外线照射后即产生裂解反应，噬菌体被诱发释放，以一定的比例形成带有gal 基因的转导噬菌体和完整噬菌体。
实验十二 噬菌体效价的测定
4、将E. coli过夜菌摇匀，用吸管取菌液0.9ml分别加 入上面的10-4,10-5,10-6,10-7和对照试管中，摇匀；
5、将5管上层培养基溶化，分别标上10-4,10-5,106,10-7和对照，分别将4管混合液和对照管加入对应 的上层培养基试管中，每加入一管就要立即摇匀；
6、将摇匀的上层培养基迅速倒入相应的底层平板上， 放在台面上摇匀，使上层培养基布满平板，待平 板凝固后，置37℃培养过夜。
10-2
10-1
噬菌体原液
0.5ml 10-3 0.1ml
0.5ml 10-4
0.5ml 10-5 0.1ml 10-6
A
稀释噬菌体 试管中装4.5ml水
0.1ml
0.1ml
灭菌后待用
B 空EP管中加入： 大肠杆菌0.9ml
10-4
10-5
10-6
10-7
对照
噬菌体0.1ml 对照中换成0.1ml水 C 将全部混合液 （1ml）加入上层 培养基内
10-4
10-5
10-6
7
对照
D
倒板，37℃培养
E 观察并记数噬菌斑
噬菌体效价测定流程图
五 实验结果
1、观测平板中的噬菌斑,将每一个噬菌斑形成单位 (pfu),记录实验数据,并选取30-300个pfu数的平板 记数每ml未稀释的原液的噬菌体的效价. 噬菌体效价=pfu数×稀释倍数
2、实验数据
三、实验器材
1、菌种：大肠杆菌噬菌体原液，大肠杆菌；
2、培养基：上层培养基（5管/组），LB平板（5个/ 组）；
3、4.5mL无菌水（7管/组）；
4、EP管（5管/组）。
四、实验步骤
1、过夜培养物出现澄清，用无菌滤头过滤纯化获得噬 菌体滤液；
噬菌体效价的测定方法
噬菌体效价的测定方法噬菌体效价的测定方法1. 引言噬菌体效价的测定方法是研究噬菌体杀菌能力的重要手段。
本文将详细介绍几种常用的噬菌体效价测定方法。
2. 噬菌体效价测定方法斑点法斑点法是最常用的测定噬菌体效价的方法之一。
具体步骤如下：1.准备一系列浓度递减的噬菌体溶液。
2.在琼脂平板上均匀涂敷被测细菌悬浮液。
3.取一定体积的已知浓度的噬菌体溶液滴在已涂敷的平板上，静置一段时间。
4.观察液滴周围是否出现菌落溶解区，根据出现溶解区的数量和大小，推断噬菌体的效价。
流式细胞术法流式细胞术法是一种快速测定噬菌体效价的方法，适合大规模实验。
具体步骤如下：1.准备一系列浓度递减的噬菌体溶液。
2.将被测细菌悬浮液加入流式细胞仪中，通过光散射和荧光信号检测细菌的状态。
3.依据细菌的状态判断噬菌体的效价。
确定感染能力的法确定感染能力的法是一种精确测定噬菌体效价的方法，可以测定细菌在固定时间内被噬菌体感染的能力。
具体步骤如下：1.准备一系列浓度递减的噬菌体溶液。
2.将细菌与噬菌体溶液接触一定时间后，离心沉淀细菌。
3.通过对沉淀细菌进行计数或直接培养识别，确定细菌被感染的数量。
4.根据感染数量和噬菌体浓度计算噬菌体的效价。
3. 结论本文介绍了斑点法、流式细胞术法和确定感染能力的法三种常用的噬菌体效价测定方法。
这些方法各有优缺点，研究者可以根据实际需求选择合适的方法进行噬菌体效价的测定。
4. 斑点法的优点和缺点优点•斑点法操作简单，易于掌握。
•可以同时测定多个噬菌体效价，提高效率。
•结果直观，通过观察菌落溶解区可以准确判断噬菌体效价。
缺点•斑点法需要较长的时间来观察菌落溶解区的形成，耗时较长。
•结果的定量分析相对不准确，只能通过观察溶解区数量和大小来推测效价。
•受到环境因素的影响较大，如温度、湿度等。
5. 流式细胞术法的优点和缺点优点•流式细胞术法速度快，可对大量样本进行高通量分析。
•结果定量准确，可以精确地获得细菌的状态信息。
噬菌体的检查及效价测定
5.1.4.1双层琼脂平板法
5.1.4.1.1 倒下层琼脂
融化下层培养基，倒平板（约10mL/皿）待用。
5.1.4.1.2倒上层琼脂
融化上层培养基，待融化的上层培养基冷却至50℃左右时，每管中加入敏感指示菌 (大肠杆菌) 菌液0.2mL，待检样品液或上述噬菌体增殖液0.2～0.5mL，混合后立即倒入上层平板铺平。
5.1.4.1.3恒温培养
30℃恒温培养6～12h观察结果。
5.1.4.1.4 观察结果
如有噬菌体，则在双层培养基的上层出现透亮无菌圆形空斑──%26not;%26not;%26not;%26not;噬菌斑。
5.1.4.2 单层琼脂平板法
省略下层培养基，将上层培养基的琼脂量增加至2%，融化后冷却至45℃左右，如同上法加入指示菌和检样，混合后迅速倒平板。30℃恒温培养6～16h后观察结果。
5.1.5 离心分离加热法（快速检查）
取大肠杆菌正常培养液和侵染有噬菌体的异常大肠杆菌培养液，4000rpm离心20min，分别取两组发酵液的上清液(A1)，一部分于721分光光度计上测定OD650光密度值，另外各取5mL上清液于试管中，置水浴中煮沸2min（A2），检测A2溶液OD650光密度值，记录结果。
5.3 噬菌体与菌液混合：
将11支灭菌空试管分别标记10-4、10-5、10-6和对照。分别从10-4、10-5和10-6噬菌体稀释液中吸取0.1mL于上述编号的无菌试管 中，每个稀释度平行做三个管，在另外两支对照管中加0.1mL无菌水，并分别于各管中加入0.2mL大肠杆菌菌悬液，振荡试管使菌液与噬菌体液混合均匀， 置37℃水浴中保温5min，让噬菌体粒子充分吸附并侵入菌体细胞。
实验七 噬菌体效价的测定
实验七噬菌体效价的测定实验七噬菌体效价的测定杨明轩生物111 1102040128一、实验目的1、学习并掌握噬菌体效价的含义及其测定原理。
2、学习并掌握双层琼脂平板法测定噬菌体效价。
二、实验原理噬菌体属于细菌病毒，侵染细菌细胞后，可导致寄主细胞溶解死亡，并在琼脂培养基表面形成空斑，即为噬菌斑。
人们可以根据噬菌斑来判断噬菌体的存在。
噬菌体的效价指的是每毫升培养液中含有的具感染性的噬菌体的数量。
其测定常用双层琼脂平板法。
由此法得到的噬菌斑形态、大小较为一致，且清晰度高，计算准确。
该方法首先在无菌培养皿内倒入营养琼脂作为底层，然后将适当稀释的噬菌体与培养至对数期的受体菌混合，保温吸附后，加入冷却至45℃左右的半固体琼脂糖，迅速混匀后铺平板，作为上层，最后倒置培养。
只要噬菌体具有感染力就可形成噬菌斑。
根据不同稀释度平板上出现的噬菌斑数目，即可算出原液噬菌体的效价。
公式为：噬菌斑形成单位（pfu/ml）＝噬菌斑数×稀释倍数×10（注：需要说明的是，“×10”表示换算单位，根据本实验步骤，因为加入的是100ul噬菌体原液，换算成1000ul，即1ml，因此“×10”，如有变动更改则需另行计算）本实验选择的是λ噬菌体EA94，它是一种被改造过的烈性噬菌体。
三、实验材料1、菌种：大肠杆菌（Escherichia coli）LE392；2、噬菌体：λ噬菌体EA94；3、培养基：300ml三角瓶中分装100ml LB培养基，15×150mm试管分装4ml 0.7%琼脂糖；4、灭菌物品：20%麦芽糖，1mol/L MgSO4，10mmol/L MgSO4，18×180mm试管分装4.5ml和20ml噬菌体缓冲液，100ml离心管，500μl枪头，200μl枪头，微离心管，培养皿；5、仪器：取样器，恒温水浴锅，恒温培养箱，台式离心机。
四、实验方法1、感受态的大肠杆菌菌悬液的制备：将活化的大肠杆菌接种于50ml牛肉膏蛋白冻培养液（内含0.5ml20% 8磅灭菌麦芽糖和500ul1mol/L灭菌 MgSO4・7H20）中，经37℃过夜培养后，4000转/分，15min离心收集菌体细胞，然后悬于20ml10mmol/L MgSO4中，备用。
噬菌体效价及转导实验
噬菌体效价测定及转导姓名学号：系别：生命科学学院生物科学专业班号：实验日期：4月26日、5月3日同组同学：实验目的1.学习噬菌体效价测定的方法2.了解转导原理、学习转导实验方法实验材料菌种：E. coli K12 F、E. coli K12S、噬菌体裂解液培养基：牛肉膏蛋白胨液体培养基、 EMB培养基、牛肉膏蛋白胨固体培养基实验原理1.噬菌体的效价就是一毫升培养液中所含活噬菌体的数量。
效价测定的方法，一般应用双层琼脂平板法。
由于含有特异宿主细菌的琼脂平板上，一个噬菌体产生一个噬菌斑2.噬菌体的悬浮液是由双重溶源菌（内含一个λ及一个λdg两种噬菌体）裂解而来的，因此λ及λdg两种噬菌体是等量的。
3. λ噬菌体能够侵染大肠杆菌并能使其裂解，因此能够形成噬菌斑；λdg噬菌体能够侵染大肠杆菌但不能使其裂解，因此不能够形成噬菌斑4.噬菌体效价/噬菌体数/ml=每皿平均噬菌斑数*稀释倍数/0.5ml*2 （λdg不能够形成噬菌斑且其数量与λ相等，因此计算时乘以2）5. λdg是缺陷型噬菌体，其基因组上带有宿主菌的发酵半乳糖的基因。
当λdg侵染S菌的时候，就能够使得S菌具有发酵半乳糖的能力，因此菌落也会显现出发酵半乳糖的特征（菌落有金属光泽）。
6.转导子数/ml=每皿平均转导子数*稀释倍数/0.1ml*2 （因为裂解液为0.5ml，所以要乘以2）；转导频率=转导子/ml./噬菌体效价*100%实验步骤一、噬菌体效价的测定1）熔化100mlEMB固体培养基、100ml牛肉膏蛋白胨固体培养基2将熔化的EMB培养基中加入6.5ml的0.1%的美蓝和2ml的2%的伊红3）用100ml熔化的EMB培养基倒六个平板。
编号EMB1-EMB64）用100ml熔化的牛肉膏蛋白胨固体培养基倒4个平板。
编号牛固1-牛固5）水浴加热5管素琼脂，溶解后置于50摄氏度下保温。
6）稀释裂解液：取0.5ml裂解液，加入到4.5ml牛肉膏蛋白胨液体培养基，稀释成了10^-1的稀释液，以此方法，再稀释到10^-2、10^-3、10^-4.并做好标记。
大肠杆菌噬菌体的分离纯化及效价的测定
噬菌体的分离纯化及效价的测定1 目的1.1 了解噬菌体效价的含义及其测定原理。
1.2 学会检查噬菌体的方法。
1.3 掌握用双层琼脂平板法测定噬菌体效价的操作技能。
2 原理噬菌体是一类专性寄生于细菌和放线菌等微生物的病毒，其个体形态极其微小，用常规微生物计数法无法测得其数量。
当烈性噬菌体侵染细菌后会迅速引起敏感细菌裂解，释放出大量子代噬菌体，然后它们再扩散和侵染周围细胞，最终使含有敏感菌的悬液由混浊逐渐变清，或在含有敏感细菌的平板上出现肉眼可见的空斑──噬菌斑。
了解噬菌体的特性，快速检查、分离，并进行效价测定，对在生产和科研工作中防止噬菌体的污染具有重要作用。
检样可以是发酵液、空气、污水、土壤等（至于无法采样而需检查的对象，可以用无菌水浸湿的棉花涂拭表面作为检查样品）。
为了易于分离可先经增殖培养，使样品中的噬菌体数量增加。
采用生物测定法进行噬菌体检查，约需12h左右，因而不能及时判断是否有噬菌体污染。
通过快速检查可大致确定是否有噬菌体污染，以采取必要的防治措施。
根据正常发酵（培养）液离心后菌体沉淀，上清液蛋白含量很少，加热后仍然清亮；而侵染有噬菌体的发酵（培养）液经离心后其上清液中因含有自裂解菌中逸出的活性蛋白，加热后发生蛋白质变性，因而在光线照射下出现丁达尔效应而不清亮。
此法简单、快速，对发酵液污染噬菌体的判断亦较准确。
但不适于溶源性细菌及温合噬菌体的诊断，对侵染噬菌体较少的一级种子培养液也往往不适用。
噬菌体的效价即１mL样品中所含侵染性噬菌体的粒子数。
效价的测定一般采用双层琼脂平板法。
由于在含有特异宿主细菌的琼脂平板上，一般一个噬菌体产生一个噬菌斑，故可根据一定体积的噬菌体培养液所出现的噬菌斑数，计算出噬菌体的效价。
此法所形成的噬菌斑的形态、大小较一致，且清晰度高，故计数比较准确，因而被广泛应用。
3 材料3.1菌种敏感指示菌（大肠杆菌）、大肠杆菌噬菌体(从阴沟或粪池污水中分离)。
3.2培养基二倍肉膏蛋白胨培养液，上层肉膏蛋白胨半固体琼脂培养基（含琼脂0.7%，试管分装，每管５mL），下层肉膏蛋白胨固体琼脂培养基（含琼脂2%），1%蛋白胨水培养基。
细菌转导_实验报告
一、实验目的1. 理解细菌转导的基本原理。
2. 掌握细菌转导实验的基本技术。
3. 观察和分析转导噬菌体在细菌间传递遗传物质的现象。
二、实验原理细菌转导是一种通过噬菌体作为媒介，将供体细菌的遗传物质传递给受体细菌的过程。
转导可分为普遍性转导和局限性转导。
本实验采用局限性转导，以噬菌体专一性转导半乳糖发酵基因为例，说明转导的基本原理。
三、实验材料与试剂1. 供体菌株：E.coli K12（gal）2. 受体菌株：E.coli K12gal-3. 噬菌体：噬菌体λ4. 培养基：肉汤液体培养基、加倍肉汤液体培养基5. 工具：培养皿、三角瓶、试管、离心管、吸管、玻璃涂棒四、实验步骤1. 将供体菌株E.coli K12（gal）在肉汤液体培养基中培养至对数生长期。
2. 将培养好的供体菌株离心收集菌体，重悬于加倍肉汤液体培养基中。
3. 将噬菌体λ与供体菌株混合，在37℃水浴中保温30分钟。
4. 将混合液接种到受体菌株 E.coli K12gal-的肉汤液体培养基中，37℃培养过夜。
5. 将培养好的混合液涂布到含有伊红和美蓝的平板上，37℃培养过夜。
6. 观察并记录平板上的菌落生长情况。
五、实验结果与分析1. 在平板上观察到菌落生长，说明转导过程成功。
2. 观察到部分菌落呈现半乳糖发酵阳性，即能够利用半乳糖生长，而受体菌株E.coli K12gal-为半乳糖发酵阴性。
3. 通过对菌落进行PCR检测，证实转导噬菌体将半乳糖发酵基因从供体菌株传递给了受体菌株。
六、实验结论1. 本实验成功实现了细菌转导，证实了噬菌体可以作为遗传物质的载体，在细菌间传递遗传物质。
2. 通过局限性转导实验，揭示了细菌转导的基本原理和操作技术。
七、实验讨论1. 在实验过程中，噬菌体λ的选择对转导效率有重要影响。
本实验中使用的噬菌体λ具有较高的转导效率。
2. 实验中受体菌株的选择对转导结果也有一定影响。
本实验中使用的受体菌株E.coli K12gal-为半乳糖发酵阴性，使得半乳糖发酵阳性的转导子更加明显。
噬菌体的检查及效价测定
【转贴】【加密0】噬菌体的检查及效价测定噬菌体的检查及效价测定[日期：2004-12-22] 来源：作者：孔庆学[字体：大中小]1 目的1.1 了解噬菌体效价的含义及其测定原理。
1.2 学会检查噬菌体的方法。
1.3 掌握用双层琼脂平板法测定噬菌体效价的操作技能。
2 原理噬菌体是一类专性寄生于细菌和放线菌等微生物的病毒，其个体形态极其微小，用常规微生物计数法无法测得其数量。
当烈性噬菌体侵染细菌后会迅速引起敏感细菌裂解，释放出大量子代噬菌体，然后它们再扩散和侵染周围细胞，最终使含有敏感菌的悬液由混浊逐渐变清，或在含有敏感细菌的平板上出现肉眼可见的空斑──噬菌斑。
了解噬菌体的特性，快速检查、分离，并进行效价测定，对在生产和科研工作中防止噬菌体的污染具有重要作用。
检样可以是发酵液、空气、污水、土壤等（至于无法采样而需检查的对象，可以用无菌水浸湿的棉花涂拭表面作为检查样品）。
为了易于分离可先经增殖培养，使样品中的噬菌体数量增加。
采用生物测定法进行噬菌体检查，约需12h左右，因而不能及时判断是否有噬菌体污染。
通过快速检查可大致确定是否有噬菌体污染，以采取必要的防治措施。
根据正常发酵（培养）液离心后菌体沉淀，上清液蛋白含量很少，加热后仍然清亮；而侵染有噬菌体的发酵（培养）液经离心后其上清液中因含有自裂解菌中逸出的活性蛋白，加热后发生蛋白质变性，因而在光线照射下出现丁达尔效应而不清亮。
此法简单、快速，对发酵液污染噬菌体的判断亦较准确。
但不适于溶源性细菌及温合噬菌体的诊断，对侵染噬菌体较少的一级种子培养液也往往不适用。
噬菌体的效价即１mL样品中所含侵染性噬菌体的粒子数。
效价的测定一般采用双层琼脂平板法。
由于在含有特异宿主细菌的琼脂平板上，一般一个噬菌体产生一个噬菌斑，故可根据一定体积的噬菌体培养液所出现的噬菌斑数，计算出噬菌体的效价。
此法所形成的噬菌斑的形态、大小较一致，且清晰度高，故计数比较准确，因而被广泛应用。
微生物实验(七)噬菌体效价测定及转导HJ
微生物实验（七）实验名称：噬菌体效价测定、转导姓名：韩俊学号：201011202902班级：10级2班实验日期：2012-4-26试验时间：周四13:00-16：00同组同学：李扬陈奉桂黄立波、【实验目的】1.了解温和噬菌体与宿主菌之间的溶原关系。
2.学习利用溶原性细菌制备噬菌体裂解液的方法。
3.学习噬菌体效价测定的方法4.了解转导原理、学习转导实验方法5.学习凝集反应和沉淀反应的实验方法【实验原理】溶原性细菌经紫外线照射诱导后，使得原噬菌体从细菌染色体上脱离而进入裂解周期，在宿主细菌细胞内进行复制和组装，形成大量完整的噬菌体粒子。
细菌被裂解，释放出游离的噬菌体粒子，通过离心获得噬菌体裂解液。
噬菌体的效价是指1ml噬菌体裂解液中所含噬菌体的数目。
在含有敏感宿主菌的琼脂平板上，噬菌体产生肉眼可见的噬菌斑，根据噬菌斑形成单位，进行噬菌体效价测定。
转导分为两种类型，即为普遍性转导和局限性转导。
本实验为局限性转导，以双重溶源性细菌E.coli K12F(λ)gal+为供体，经紫外线（UV）诱导，在噬菌体裂解液中，将含有两种类型的噬菌体，（λ和λdg），λdg是缺陷噬菌体，其基因组上带有宿主菌的发酵半乳糖的基因（gal），当缺陷性噬菌体λdg再次侵染敏感菌大肠杆菌K12S时，会将发酵半乳糖的基因转移到S菌，使S菌获得gal 基因，从而使得S菌获得发酵半乳糖的能力，利用转导子在EMB培养基上发酵半乳糖的特征进行转导频率的计算和分析。
【实验仪器、材料】菌种：E. coli K12 F，E. coli K12S，各种方式保藏的微生物菌种，噬菌体裂解液培养基：牛肉膏蛋白胨固体及液体培养基，素琼脂，EMB培养基试剂：氯仿、磷酸缓冲液，无菌水，1%琼脂糖仪器：离心机、UV灯、磁力搅拌器，培养箱，打孔器等【实验内容】1、噬菌体裂解液的制备从E. coli K12 F菌种斜面上取一环菌种，接种于2mL牛肉膏蛋白胨液体培养基中，离心10min，弃去上清夜，用等体积磷酸缓冲液悬浮细胞，制成菌悬液。
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噬菌体效价测定及转导
姓名
学号：
系别：生命科学学院生物科学专业
班号：
实验日期：4月26日、5月3日
同组同学：
实验目的
1.学习噬菌体效价测定的方法
2.了解转导原理、学习转导实验方法
实验材料
菌种：E. coli K12 F、E. coli K12S、噬菌体裂解液
培养基：牛肉膏蛋白胨液体培养基、 EMB培养基、牛肉膏蛋白胨固体培养基
实验原理
1.噬菌体的效价就是一毫升培养液中所含活噬菌体的数量。
效价测定的方法，一般应用双层琼脂平板法。
由于含有特异宿主细菌的琼脂平板上，一个噬菌体产生一个噬菌斑
2.噬菌体的悬浮液是由双重溶源菌（内含一个λ及一个λdg两种噬菌体）裂解而来的，因此λ及λdg两种噬菌体是等量的。
3. λ噬菌体能够侵染大肠杆菌并能使其裂解，因此能够形成噬菌斑；λdg噬菌体能够侵染大肠杆菌但不能使其裂解，因此不能够形成噬菌斑
4.噬菌体效价/噬菌体数/ml=每皿平均噬菌斑数*稀释倍数/0.5ml*2 （λdg不能够形成噬菌斑且其数量与λ相等，因此计算时乘以2）
5. λdg是缺陷型噬菌体，其基因组上带有宿主菌的发酵半乳糖的基因。
当λdg侵染S菌的时候，就能够使得S菌具有发酵半乳糖的能力，因此菌落也会显现出发酵半乳糖的特征（菌落有金属光泽）。
6.转导子数/ml=每皿平均转导子数*稀释倍数/0.1ml*2 （因为裂解液为0.5ml，所以要乘以2）；转导频率=转导子/ml./噬菌体效价*100%
实验步骤
一、噬菌体效价的测定
1）熔化100mlEMB固体培养基、100ml牛肉膏蛋白胨固体培养基
2将熔化的EMB培养基中加入6.5ml的0.1%的美蓝和2ml的2%的伊红
3）用100ml熔化的EMB培养基倒六个平板。
编号EMB1-EMB6
4）用100ml熔化的牛肉膏蛋白胨固体培养基倒4个平板。
编号牛固1-牛固
5）水浴加热5管素琼脂，溶解后置于50摄氏度下保温。
6）稀释裂解液：取0.5ml裂解液，加入到4.5ml牛肉膏蛋白胨液体培养基，稀释成了10^-1的稀释液，以此方法，再稀释到10^-2、10^-3、10^-4.并做好标记。
7）向每支素琼脂中接入0.5ml K12S，混匀，再分别取噬菌体裂解液0.5ml（10^0、10^-2、10^-4），加入到素琼脂中，摇匀后立刻倒在牛肉膏蛋白胨平板上。
8）培养待平板凝固后于37 ℃，培养24hr
9）观察实验现象，并数出噬菌斑的多少，根据噬菌斑数量计算噬菌体效价
二、转导
1.点滴法
1）如上图，取两个EMB平板按照上图的轮廓添加试剂，注意接种的裂解液是未经稀释的裂解液。
2）在37 ℃下培养24h，然后置于室温下培养6d
3）观察实验结果
2.转导频率的测定
1）将S菌取0.5ml于空试管中，37℃预热10min,加入0.5ml噬菌体裂解液， 37℃继续保温10min。
2）用牛肉膏蛋白胨液体培养基稀释到10^-4，并注意编号
3）取0.1ml的稀释液（10^-3、10^-4）涂布在EMB平板（每种浓度对应两个EMB平板）。
37℃培养24h，并在室温下培养6d
4）观察实验结果
注意事项
1.素琼脂一定要保持在50 ℃水浴中，防止凝固
2.转导频率测定时一定要稀释到合适浓度后才能涂平板，保证培养后长出单菌落
实验结果及分析
一、噬菌体效价的测定
10^0的牛肉膏蛋白胨固体培养基中长出了霉菌、2个细菌、及1个放线菌。
没有出现噬菌斑
10^-2的牛肉膏蛋白胨固体培养基中什么也没长。
没有出现噬菌斑
10^-4的牛肉膏蛋白胨固体培养基中长出了霉菌、没有出现噬菌斑
实验分析：实验失败，实验平板遭到污染，可能原因是，在倒平板、涂布及接种过
程中没有严格的按照规定来操作，导致了污染，也可能是接种的噬菌斑或或s菌本身就被污染了。
没有长出噬菌斑，可能原因是裂解液的浓度出了问题，问了下其他组的情况，都没有长出噬菌斑，说明很可能是噬菌体裂解液出了问题，不然何以所有的组都没有长出噬菌斑呢。
二、转导实验
1.点滴法
裂解液区域没有长出任何东西，F菌区域也什么都没有长（其他组也是这样的结果），s菌区域长出了紫色的光滑菌落，在与裂解液的交界处，仍然是紫色，没有任何变化。
实验分析：此次实验做得阳性对照F菌什么也没长，说明是老师准备的F菌液本身出现了问题，而S菌与裂解液的交界没有出现不同，由上一个实验分析可以知道，是裂解液出了
问题，因此肯定不会出现转导成功的现象。
2.转导频率的测定
所有平板长的都是紫色的菌落，对光旋转也没有发现哪一个菌落有金属光泽。
实验分析：实验失败，没有发现有金属光泽的菌落，说明长的肯定不是F菌，说明没有
转导成功，由第一个实验分析，我们就知道是噬菌体的裂解液出现问题，所以没有出现预期的实验现象。
实验讨论
本次试验，全部失败，究其原因有如下：
1.实验过程中，无菌操作不当，使得平板受到污染。
2.噬菌体裂解液有问题
3.F菌出现了问题
避开失败，我们讨论了其他问题。
1．噬菌体的效价就是一毫升培养液中所含活噬菌体的数量。
效价测定的方法，一般应用双层琼脂平板法。
由于含有特异宿主细菌的琼脂平板上，一个噬菌体产生一个噬菌斑。
2. 噬菌体的悬浮液是由双重溶源菌（内含一个λ及一个λdg两种噬菌体）裂解而来的，因此λ及λdg两种噬菌体是等量的。
3. λ噬菌体能够侵染大肠杆菌并能使其裂解，因此能够形成噬菌斑；λdg噬菌体能够侵染大肠杆菌但不能使其裂解，因此不能够形成噬菌斑
4.噬菌体效价/噬菌体数/ml=每皿平均噬菌斑数*稀释倍数/0.5ml*2 （λdg不能够形成噬菌斑且其数量与λ相等，因此计算时乘以2）
5. λdg是缺陷型噬菌体，其基因组上带有宿主菌的发酵半乳糖的基因。
当λdg侵染S菌的时候，就能够使得S菌具有发酵半乳糖的能力，因此菌落也会显现出发酵半乳糖的特征（菌落有金属光泽）。
6．素琼脂一定要保持在50 ℃水浴中，防止凝固
7．转导频率测定时一定要稀释到合适浓度后才能涂平板，保证培养后长出单菌落。