噬菌体效价及转导实验

噬菌体效价测定及转导

姓名

学号：

系别：生命科学学院生物科学专业

班号：

实验日期：4月26日、5月3日

同组同学：

实验目的

1.学习噬菌体效价测定的方法

2.了解转导原理、学习转导实验方法

实验材料

菌种：E. coli K12 F、E. coli K12S、噬菌体裂解液

培养基：牛肉膏蛋白胨液体培养基、 EMB培养基、牛肉膏蛋白胨固体培养基

实验原理

1.噬菌体的效价就是一毫升培养液中所含活噬菌体的数量。效价测定的方法，一般应用双层琼脂平板法。由于含有特异宿主细菌的琼脂平板上，一个噬菌体产生一个噬菌斑

2.噬菌体的悬浮液是由双重溶源菌（内含一个λ及一个λdg两种噬菌体）裂解而来的，因此λ及λdg两种噬菌体是等量的。

3. λ噬菌体能够侵染大肠杆菌并能使其裂解，因此能够形成噬菌斑；λdg噬菌体能够侵染大肠杆菌但不能使其裂解，因此不能够形成噬菌斑

4.噬菌体效价/噬菌体数/ml=每皿平均噬菌斑数*稀释倍数/0.5ml*2 （λdg不能够形成噬菌斑且其数量与λ相等，因此计算时乘以2）

5. λdg是缺陷型噬菌体，其基因组上带有宿主菌的发酵半乳糖的基因。当λdg侵染S菌的时候，就能够使得S菌具有发酵半乳糖的能力，因此菌落也会显现出发酵半乳糖的特征（菌落有金属光泽）。

6.转导子数/ml=每皿平均转导子数*稀释倍数/0.1ml*2 （因为裂解液为0.5ml，所以要乘以2）；转导频率=转导子/ml./噬菌体效价*100%

实验步骤

一、噬菌体效价的测定

1）熔化100mlEMB固体培养基、100ml牛肉膏蛋白胨固体培养基

2将熔化的EMB培养基中加入6.5ml的0.1%的美蓝和2ml的2%的伊红

3）用100ml熔化的EMB培养基倒六个平板。编号EMB1-EMB6

4）用100ml熔化的牛肉膏蛋白胨固体培养基倒4个平板。编号牛固1-牛固

5）水浴加热5管素琼脂，溶解后置于50摄氏度下保温。

6）稀释裂解液：取0.5ml裂解液，加入到4.5ml牛肉膏蛋白胨液体培养基，稀释成了10^-1的稀释液，以此方法，再稀释到10^-2、10^-3、10^-4.并做好标记。

7）向每支素琼脂中接入0.5ml K12S，混匀，再分别取噬菌体裂解液0.5ml（10^0、10^-2、10^-4），加入到素琼脂中，摇匀后立刻倒在牛肉膏蛋白胨平板上。

8）培养待平板凝固后于37 ℃，培养24hr

9）观察实验现象，并数出噬菌斑的多少，根据噬菌斑数量计算噬菌体效价

二、转导

1.点滴法

1）如上图，取两个EMB平板按照上图的轮廓添加试剂，注意接种的裂解液是未经稀释的裂解液。

2）在37 ℃下培养24h，然后置于室温下培养6d

3）观察实验结果

2.转导频率的测定

1）将S菌取0.5ml于空试管中，37℃预热10min,加入0.5ml噬菌体裂解液， 37℃继续保温10min。

2）用牛肉膏蛋白胨液体培养基稀释到10^-4，并注意编号

3）取0.1ml的稀释液（10^-3、10^-4）涂布在EMB平板（每种浓度对应两个EMB平板）。

37℃培养24h，并在室温下培养6d

4）观察实验结果

注意事项

1.素琼脂一定要保持在50 ℃水浴中，防止凝固

2.转导频率测定时一定要稀释到合适浓度后才能涂平板，保证培养后长出单菌落

实验结果及分析

一、噬菌体效价的测定

10^0的牛肉膏蛋白胨固体培养基中长出了霉菌、2个细菌、及1个放线菌。没有出现噬菌斑

10^-2的牛肉膏蛋白胨固体培养基中什么也没长。没有出现噬菌斑

10^-4的牛肉膏蛋白胨固体培养基中长出了霉菌、没有出现噬菌斑

实验分析：实验失败，实验平板遭到污染，可能原因是，在倒平板、涂布及接种过

程中没有严格的按照规定来操作，导致了污染，也可能是接种的噬菌斑或或s菌本身就被污染了。没有长出噬菌斑，可能原因是裂解液的浓度出了问题，问了下其他组的情况，都没有长出噬菌斑，说明很可能是噬菌体裂解液出了问题，不然何以所有的组都没有长出噬菌斑呢。

二、转导实验

1.点滴法

裂解液区域没有长出任何东西，F菌区域也什么都没有长（其他组也是这样的结果），s菌区域长出了紫色的光滑菌落，在与裂解液的交界处，仍然是紫色，没有任何变化。

实验分析：此次实验做得阳性对照F菌什么也没长，说明是老师准备的F菌液本身出现了问题，而S菌与裂解液的交界没有出现不同，由上一个实验分析可以知道，是裂解液出了

问题，因此肯定不会出现转导成功的现象。

2.转导频率的测定

所有平板长的都是紫色的菌落，对光旋转也没有发现哪一个菌落有金属光泽。

实验分析：实验失败，没有发现有金属光泽的菌落，说明长的肯定不是F菌，说明没有

转导成功，由第一个实验分析，我们就知道是噬菌体的裂解液出现问题，所以没有出现预期的实验现象。

实验讨论

本次试验，全部失败，究其原因有如下：

1.实验过程中，无菌操作不当，使得平板受到污染。

2.噬菌体裂解液有问题

3.F菌出现了问题

避开失败，我们讨论了其他问题。

1．噬菌体的效价就是一毫升培养液中所含活噬菌体的数量。效价测定的方法，一般应用双层琼脂平板法。由于含有特异宿主细菌的琼脂平板上，一个噬菌体产生一个噬菌斑。

2. 噬菌体的悬浮液是由双重溶源菌（内含一个λ及一个λdg两种噬菌体）裂解而来的，因此λ及λdg两种噬菌体是等量的。

3. λ噬菌体能够侵染大肠杆菌并能使其裂解，因此能够形成噬菌斑；λdg噬菌体能够侵染大肠杆菌但不能使其裂解，因此不能够形成噬菌斑

4.噬菌体效价/噬菌体数/ml=每皿平均噬菌斑数*稀释倍数/0.5ml*2 （λdg不能够形成噬菌斑且其数量与λ相等，因此计算时乘以2）

5. λdg是缺陷型噬菌体，其基因组上带有宿主菌的发酵半乳糖的基因。当λdg侵染S菌的时候，就能够使得S菌具有发酵半乳糖的能力，因此菌落也会显现出发酵半乳糖的特征（菌落有金属光泽）。

6．素琼脂一定要保持在50 ℃水浴中，防止凝固

7．转导频率测定时一定要稀释到合适浓度后才能涂平板，保证培养后长出单菌落