DNA分子标记及其数据库：indel标记
InDel标记的研究和应用进展
生物多样性 2016, 24 (2): 237–243 doi: 10.17520/biods.2015205 Biodiversity Science http: //・综述・InDel标记的研究和应用进展杨洁赫佳王丹碧施恩杨文宇耿其芳王中生*(南京大学生命科学学院, 南京 210023)摘要: InDel是指在近缘种或同一物种不同个体之间基因组同一位点的序列发生不同大小核苷酸片段的插入或缺失(insertion-deletion), 是同源序列比对产生空位(gap)的现象。
InDel在基因组中分布广泛、密度大、数目众多。
InDel 多态性分子标记是基于插入/缺失位点两侧的序列设计特异引物进行PCR扩增的标记, 其本质仍属于长度多态性标记, 可利用便捷的电泳平台进行分型。
InDel标记准确性高、稳定性好, 避免了由于特异性和复杂性导致的后续分析模糊。
此外, InDel标记能扩增混合DNA样品和高度降解的微量DNA样品, 并进行有效分型。
InDel标记目前已开始应用于动植物群体遗传分析、分子辅助育种以及人类法医遗传学、医学诊断等领域。
随着位于功能基因上InDel 标记的开发, 结合染色体步移和基因精细定位, 可将这些标记应用于相关物种经济性状的功能基因的筛选, 有利于优良基因的进一步开发和利用。
关键词:分子标记; InDel; SNP; SSRProgress in research and application of InDel markersJie Yang, Jia He, Danbi Wang, En Shi, Wenyu Yang, Qifang Geng, Zhongsheng Wang*School of Life Sciences, Nanjing University, Nanjing 210023Abstract: InDel indicates insertions or deletions (insertion-deletion) of nucleotide fragments of different siz-es at the same site in the genome sequence between the same or closely related species and is a gap in se-quence derived from alignment of the homologous sequence. InDel is widely distributed across the genome and occurs in a high density and large numbers in a genome. The InDel polymorphic molecular marker is a PCR-amplified marker that is based on specific primers designed from both sides of the site of sequence of insertion / deletion. It is essentially a length polymorphic marker still, and one can use the convenient elec-trophoresis platform for genotyping. InDel molecular markers have the advantage of high accuracy and good stability, which help to avoid confusion in subsequent analysis due to marker specificity and complexity, as is often seen in other length polymorphic markers. Furthermore, mixed or highly degraded DNA samples can be successfully amplified with InDel markers, and effectively typed. Because of its abundance, convenient typing platform and other advantages, InDel molecular markers have been applied to genetic analyses of an-imal and plant populations, molecular assisted crops and farmed animal breeding, human forensic genetics, medical diagnostics and other research areas. The development of the InDel molecular marker located on functional genes, combined with chromosome walking and fine gene mapping, has enabled the application of these molecular markers in the screening of genes related to important economic traits, which is conducive to the further development and utilization of these valuable genes. In this review, on the basis of an overview of the InDel marker development and applications, we discuss some of the technical limitations of the develop-ment and limited efficiency of genetic analysis, as well as potential future applications in the fine mapping and genetic structure of large numbers of individuals.Key words: molecular marker; InDel; SNP; SSR插入/缺失(insertion-deletion, InDel)是指在近缘种或同一物种不同个体之间基因组同一位点的序——————————————————收稿日期: 2015-07-15; 接受日期: 2015-12-17基金项目: 国家自然科学基金(31100270)∗通讯作者Author for correspondence. E-mail: wangzs@238 生物多样性 Biodiversity Science第24卷列发生了不同大小核苷酸片段的插入或缺失, 即一个序列上某一位点相比同源的另一个序列插入或缺失了一个或多个碱基(Weber et al, 2002)。
InDel标记的研究和应用进展
生物多样性 2016, 24 (2): 237–243 doi: 10.17520/biods.2015205 Biodiversity Science http: //・综述・InDel标记的研究和应用进展杨洁赫佳王丹碧施恩杨文宇耿其芳王中生*(南京大学生命科学学院, 南京 210023)摘要: InDel是指在近缘种或同一物种不同个体之间基因组同一位点的序列发生不同大小核苷酸片段的插入或缺失(insertion-deletion), 是同源序列比对产生空位(gap)的现象。
InDel在基因组中分布广泛、密度大、数目众多。
InDel 多态性分子标记是基于插入/缺失位点两侧的序列设计特异引物进行PCR扩增的标记, 其本质仍属于长度多态性标记, 可利用便捷的电泳平台进行分型。
InDel标记准确性高、稳定性好, 避免了由于特异性和复杂性导致的后续分析模糊。
此外, InDel标记能扩增混合DNA样品和高度降解的微量DNA样品, 并进行有效分型。
InDel标记目前已开始应用于动植物群体遗传分析、分子辅助育种以及人类法医遗传学、医学诊断等领域。
随着位于功能基因上InDel 标记的开发, 结合染色体步移和基因精细定位, 可将这些标记应用于相关物种经济性状的功能基因的筛选, 有利于优良基因的进一步开发和利用。
关键词:分子标记; InDel; SNP; SSRProgress in research and application of InDel markersJie Yang, Jia He, Danbi Wang, En Shi, Wenyu Yang, Qifang Geng, Zhongsheng Wang*School of Life Sciences, Nanjing University, Nanjing 210023Abstract: InDel indicates insertions or deletions (insertion-deletion) of nucleotide fragments of different siz-es at the same site in the genome sequence between the same or closely related species and is a gap in se-quence derived from alignment of the homologous sequence. InDel is widely distributed across the genome and occurs in a high density and large numbers in a genome. The InDel polymorphic molecular marker is a PCR-amplified marker that is based on specific primers designed from both sides of the site of sequence of insertion / deletion. It is essentially a length polymorphic marker still, and one can use the convenient elec-trophoresis platform for genotyping. InDel molecular markers have the advantage of high accuracy and good stability, which help to avoid confusion in subsequent analysis due to marker specificity and complexity, as is often seen in other length polymorphic markers. Furthermore, mixed or highly degraded DNA samples can be successfully amplified with InDel markers, and effectively typed. Because of its abundance, convenient typing platform and other advantages, InDel molecular markers have been applied to genetic analyses of an-imal and plant populations, molecular assisted crops and farmed animal breeding, human forensic genetics, medical diagnostics and other research areas. The development of the InDel molecular marker located on functional genes, combined with chromosome walking and fine gene mapping, has enabled the application of these molecular markers in the screening of genes related to important economic traits, which is conducive to the further development and utilization of these valuable genes. In this review, on the basis of an overview of the InDel marker development and applications, we discuss some of the technical limitations of the develop-ment and limited efficiency of genetic analysis, as well as potential future applications in the fine mapping and genetic structure of large numbers of individuals.Key words: molecular marker; InDel; SNP; SSR插入/缺失(insertion-deletion, InDel)是指在近缘种或同一物种不同个体之间基因组同一位点的序——————————————————收稿日期: 2015-07-15; 接受日期: 2015-12-17基金项目: 国家自然科学基金(31100270)∗通讯作者Author for correspondence. E-mail: wangzs@238 生物多样性 Biodiversity Science第24卷列发生了不同大小核苷酸片段的插入或缺失, 即一个序列上某一位点相比同源的另一个序列插入或缺失了一个或多个碱基(Weber et al, 2002)。
利用DNA池技术提高基于InDel标记的种子纯度鉴定效率
Ｉ ｒ ｖｎ ｅ ｄ Ｐｕ ｉ ｄ ｎｉｉａｉｎ ｏ ｎ ｌＰ ｒ ｓ ｑ ｅ ｃｎ ｍｐ ｏ ｉ ｇ Ｓ ｅ ｒｔ Ｉ ｅ ｔｆｃ ｔｏ ｎ Ｉ Ｄｅ ｙ ｏ ｅ ｕ ｎ ｉｇ ｙ ｂ ｙ ＤＮＡ ｏｉ ｇ Ｔ ｃ ｎ ｌｇ Ｐｏ ｌｎ ｅ ｈ ｏｏ ｙ
Ｌ Ｎ ｎ －ｕ Ｕ Ｊｎ －ｕ Ｚ Ａ Ｑｉｇｋ ｏ ，Ｙ ｉｇｈ ｉ， ＨＡＯ Ｘｉ ＷＡＮＧ Ｙｏ ｇ ，Ｚ ＡＮ Ｇｌ－ｕ ｎ， ｎ Ｈ Ｇ ｌｈ ａ ， ｉ
Ｐ Ｒ Ｐｒｓｑ ｅｃｎ 及等位基 因频率分析 。通过 ｒ ＇ｔ Ｃ 、 ｙｏｅｕ ｎｉｇ Ｉ ｅ 分析不 同 Ｐ ｏｎ ｆｓ Ｉ ｏｌ ｇ间等位 基 因频 率 的差异性 ， 定 ３ Ｐｏ ｎ ｉ 确 ｏｌ ｇ为种 ｉ
子 纯 度检 测 最 适 Ｐ ｏ ｎ 数 ； 立 ３Ｐ ｏｎ — Ｄ ｌ ｙｏｅ ｕｎｉｇ标 准 曲 线 ， Ｒ ｏｌ ｇ 建 ｉ ｏｌ ｇＩ ｅ— ｒｓｑｅ ｃ ｉ ｎ Ｐ ｎ 其 ２达 ０ ９９１ 根 据 该 标 准 曲线 ， 测 黄 瓜 ．９ ； 检
（． １ 天津市 农业 科学 院中心 实验 室 ， 天津 ３ ０ ８ ； ０ ３ １ ２ 天 津科 润农 业科 技股 份有 限公 司黄瓜研 究 所 ， 天 津 ３ ０ ９ ） ． ０ １ ２
摘要 ： 为提 高基 于 ｌＤ ｌ ｙｏｅ ｕｎｉｇ的 黄 瓜 杂 交种 纯度 检 测 通 量 ， ｎ ｅ Ｐ ｒｓｑ ｅｃｎ － 降低 检 测 成 本 ， 研 究模 拟 １ 本 ０种 Ｄ Ａ Ｐｏｉ Ｎ ｏｌ ｇ进 行 ｎ
Ｉ Ｄｅ — ｙ ｏ ｅ ｕ ｎ ｉｇ ｔ ｍｐ ｏ ｅ ｈ ｓ ｅ ｐ ｒ ｙ ｉ ｅ ｔ ｃ ｔ ｎ ｆ ｃｅ ｃ ．Ｔ ｅ ａ ｔ ｏ ｉ ｌ ｔｄ ０ ＮＡ ｎ ｌＰ ｒ ｓ ｑ ｅ ｃｎ ｏ ｉ ｒ ｖ ｔ ｅ ｅ ｄ ｕ ｔ ｄ ｎ ｉ ａｉ ｅｆ ｉ ｎ ｙ ｈ ｕ ｈ ｒ ｓｍｕ ａｅ １ Ｄ ｉ ｉ ｆ ｏ ｉ
利用InDel_标记鉴定汴早九号大白菜杂交种纯度
中国瓜菜2023，36（12）：33-38收稿日期：2023-10-24；修回日期：2023-11-27基金项目：河南省重点研发专项（221111110100）作者简介：冯健起，男，副研究员，研究方向为大白菜遗传育种与栽培。
E-mail ：**************大白菜（Brassica rapa ）是起源于我国的一种重要传统蔬菜，在平衡稳定我国“菜篮子”中起着重要作用。
随着我国城镇化的发展以及蔬菜多元化的需求，大白菜的消费倾向于优质、小型、软叶率高的品种，汴早九号正是以此为目标选育出来的新品种，2018年该品种在农业农村部完成非主要农作物品种登记，编号为GPD 大白菜（2018）410957，适合黄淮海流域推广种植，已在河南、河北、安徽、山东等地推广，田间高抗病毒病，抗霜霉病以及软腐病。
种子纯度是种子主要的质量指标，在农业生产中，种子纯度不合格易造成巨大的经济损失[1]。
目前，杂交种的纯度鉴定通常采用田间形态学、蛋白质电泳和DNA 分子标记鉴定法。
田间形态学鉴定法存在诸如周期长、易受环境影响、重复性差等问题，其准确性难以把握[2]。
而分子标记技术因不受组织特异性及外界环境的影响，且具有鉴定准确、快速、重复性强等特点，已成为检测作物杂交种纯度真实且可靠的方法[3]。
钟开勤等[1]利用相关序列扩增多态性SRAP （Sequence-Related Amplified Polymorphism ）标记技术，快速且准确鉴定福春1号大白菜的纯度。
宋顺华等[4]采用扩增片段长度多态性AFLP （Amplified Fragment Length Polymorphism ）技利用InDel 标记鉴定汴早九号大白菜杂交种纯度冯健起1，王培云1，蔡亚平2，丁聪1，王惠云3，生园园1（1.河南省开封市农林科学研究院河南开封475004；2.河南省开封市种业发展中心河南开封475004；3.河南省开封市农业农村发展服务中心河南开封475004）摘要：为了准确高效地鉴定大白菜汴早九号杂交种的纯度，从已公布的基于大白菜全基因组开发的32对InDel 核心引物中筛选获得了InDel 引物BrID90029，在汴早九号父母本间呈互补带型且易辨别。
DNA分子标记及其数据库：indel标记
本文以水稻Indel标记的开发为例
水稻是最重要的粮食作物，也是单子叶模式植物。水稻重要基因的 精细定位和克隆已成为当前植物功能基因组学研究的热点之一，而功能 基因克隆的最基本和最重要的方法是图位克隆。图位克隆的关键是寻找 与目标基因紧密连锁的分子标记，然而，目标基因周围已有的分子标记 密度常常不能满足需要。因此，合理地利用亲本之间DNA 序列的多态性 来发展新的分子标记，是提高图位克隆效率的重要方法。双亲间DNA序 列的多态性是发展分子标记的基础，基于PCR的共显性分子标记是现在 最常用的标记类型。通常用于发展这类分子标记的DNA序列多态性有3 种基本的形式：简单序列重复长度多态性(simple sequence repeat length poly—morphism，SSR)、插入缺失长度多态性 (insertiondeletionlength polymorphism，InDel)和单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism，SNP)，由这3种基本的多态性产生的分子标 记分别为SSR标记、InDel标记和SNP标记。
假说可用不同物种的基因组作参照系加以检验，并得到多种检验结果的支持。
田大成解释说，基因突变主要是指DNA中核苷酸顺序、种类和数量的改变，而DNA序
列中普遍存在的点（碱基）突变是遗传变异的基本来源。点突变又分为自发突变和诱发突
变。长期以来，学术界对自发突变机制的经典认识是，自发突变受一系列因素的影响，是 一系列变化的结果，具有随机性和稀有性。但随着上个世纪90年代以来DNA测序技术的突 破性进展，研究者们对自发突变在基因组中的数量和分布有了精确估计，并普遍认为“自发 突变在基因组中不是随机分布的，突变热点普遍存在于基因组中”。这一结论对传统的自发 突变随机性和稀有性的认识形成巨大挑战，而这种现象也引起了各国科学家的极大关注， 但遗憾的是始终没有找到一种普遍的机制来解释这一重大的科学疑问。
新一代遗传标记——InDel研究进展
文 章 编 号 ：１ ０ ０ ４ — ５ ６ １ ９（ ２ ０ １ ３ ） ０ ２ — ０ １ ３ ４ — ０ ６
Ｐｒ ｏ ｇ ｒ ｅ ｓ ｓ ｉ ｎ Ｉ ｎＤｅ ｌ ａ ｓ ａ Ｎｅ ｗ Ｇｅ ｎｅ ｒ ａ ｔ ｉ ｏ ｎ ｏ ｆ Ｇｅ ｎｅ ｔ ｉ ｃ Ｍａ ｒ ｋ ｅ ｒ
ｈ ，Ｓ ａ ｈ ａ ｎ ｇ ｈ ｉ ａ ２ ０ ０ ０ ６ ３ ，Ｃ ｈ ｉ ｎ ａ ）
Ａｂｓ ｔ ｒ ａ ｃ ｔ ： Ａｓ ｆ ｏ ｒ ｅ ｎ ｓ ｉ ｃ ＤＮＡ ｔ ｙ ｐ ｉ ｎ ｇ ｅ ｘ ｐ ｅ ｒ ｉ ｅ ｎ ｃ ｅ ｄ ｔ ｈ ｒ ｅ ｅ ｇ ｅ ｎ ｅ ｒ ａ ｔ ｉ ｏ ｎ ｓ ｏ ｆ ｇ ｅ ｎｅ ｔ ｉ ｃ ｍ ａ ｒ ｋ ｅ ｒ ｒ ｅ ｓ ｅ ａ ｒ ｃ ｈ ｉ ｎ ｇ ｓ ｔ ａ ｇ ｅ ，
ｍｏ ｒ ｐ ｈ ｉ ｓ ｍ （ Ｓ ＮＰ ）ａ ｎ ｄ Ｉ ｎ ｓ ｅ ｒ ｔ ｉ ｏ ｎ ／ Ｄｅ ｌ ｅ ｔ ｉ ｏ ｎ （ Ｉ ｎ Ｄｅ １ ） ．Ｉ ｎ Ｄｅ ｌ ，ｗｈ ｉ ｃ ｈ ｃ ｏ ｍｂ ｉ ｎ ｅ ｓ ｔ ｈ ｅ ｄ ｅ ｓ ｉ ｒ ａ ｂ ｌ ｅ ｃ ｈ ａ ｒ ａ ｃ ｔ ｅ ｒ ｉ ｓ ｔ ｉ ｃ ｓ ｏ ｆ
ｓ ｈ ｏ ｒ ｔ ｔ ａ ｎ ｄ ｅ ｍ ｒ ｅ ｐ ｅ ａ ｔ（ Ｓ Ｔ Ｒ） ｈ ａ ｓ ｂ ｅ ｅ ｎ ｗｉ ｄ ｅ ｌ ｙ ｕ ｓ ｅ ｄ ｉ ｎ ｆ ｏ ｒ ｅ ｎ ｓ ｉ ｃ ｉ ｄ ｅ ｎ ｔ ｉ ｉ ｆ ｃ ａ ｔ ｉ ｏ ｎ ａ ｓ ａ ｍａ ｔ ｕ ｒ ｅ ｔ ｏ ｏ １ ．Ｆ ｕ ｔ ｒ ｈ ｅ ｒ ｅ ｘ －
indel标记原理
indel标记原理Indel标记原理Indel是指插入和删除（Insertion and Deletion）的缩写，也称为插入缺失突变。
Indel标记原理是一种用于生物信息学领域的基因分析方法，可以用来研究基因组中的插入和删除事件。
在基因组中，插入和删除是常见的突变类型，它们会导致DNA序列发生改变。
通过对这些突变进行分析，可以揭示基因组的演化过程、种群遗传结构以及个体间的亲缘关系。
而Indel标记原理就是一种便捷的分析方法，可以通过检测插入和删除事件来实现这些目标。
Indel标记原理的基本思想是通过比较不同个体的DNA序列，寻找其中的插入和删除事件。
具体步骤如下：1. 数据收集：首先，需要收集不同个体的DNA样本，并提取其中的DNA序列。
这些DNA序列可以来自不同物种、不同个体或者不同组织。
2. 序列比对：接下来，使用生物信息学工具将收集到的DNA序列进行比对。
比对的目的是找出序列之间的相似部分和不同部分。
常用的比对工具有BLAST和Bowtie等。
3. Indel检测：在序列比对的基础上，可以开始检测Indel事件。
Indel通常表现为序列中的一段DNA片段在某个个体中存在，而在其他个体中缺失（或反之）。
通过比对结果，可以找到这些插入和删除事件的位置。
4. 特征标记：一旦找到Indel事件的位置，就可以将其标记为特征。
这些特征可以是单个碱基的插入或删除，也可以是多个碱基的插入或删除。
在标记的过程中，可以根据需要设定一些筛选条件，例如Indel的长度、频率等。
5. 数据分析：最后，对标记的Indel特征进行进一步的分析。
可以通过统计学方法，计算Indel的频率、分布以及遗传变异等指标，从而得到关于个体间的亲缘关系、群体结构等信息。
Indel标记原理在生物信息学中有着广泛的应用。
它可以用于构建遗传图谱、研究物种的进化历史、鉴定个体的亲缘关系等。
同时，由于Indel事件相对较为稳定且易于检测，因此在基因组编辑、基因工程等领域也有着重要的应用价值。
利用InDel_标记鉴定典湖1_号杂交种纯度
1120㊀㊀2024年第65卷第5期收稿日期:2024-03-12基金项目:宁波市 科技创新2025 重大专项(2019B10002)作者简介:方小雪,女,农艺师,主要从事蔬菜遗传育种研究,E-mail:961935710@㊂通信作者:吴新胜,男,高级农艺师,主要从事蔬菜遗传育种研究,E-mail:wxs@㊂文献著录格式:方小雪,韦银兰,张铖锋,等.利用InDel 标记鉴定典湖1号杂交种纯度[J].浙江农业科学,2024,65(5):1120-1125.DOI:10.16178/j.issn.0528-9017.20240078利用InDel 标记鉴定典湖1号杂交种纯度方小雪,韦银兰,张铖锋,廖涵,胡锦彬,吴新胜∗(宁波微萌种业有限公司,浙江宁波㊀315101)㊀㊀摘㊀要:典湖1号是宁波微萌种业有限公司育成的青梗菜新品种,但种子纯度鉴定速度限制了该品种的推广㊂为实现对该品种杂交种纯度的高通量快速鉴定,在典湖1号父母本(父本EPG-194,母本EPG-168)基因组重测序的基础上开发用于纯度检测的InDel 标记㊂试验以典湖1号及其父母本DNA 样品为材料筛选到亲本带型互补㊁扩增条带清晰和分离速度快的引物D1-7,并用该引物检测田间典湖1号F 1群体(EpG-194ˑEpG-168群体400株,EpG-168ˑEpG-194群体400株)㊂试验中,引物D1-7的分子检测结果显示,EpG-194ˑEpG-168群体和EpG-168ˑEpG-194群体分别存在非F 1杂株146和32株,田间表型鉴定发现EpG-194ˑEpG-168群体和EpG-168ˑEpG-194群体分别存在非F 1杂株146和32株,对比后二者鉴定的800株单株结果完全一致㊂结果表明,InDel 分子标记引物D1-7准确鉴定了典湖1号群体中混杂的母本自交种,为之后典湖1号杂交种纯度的快速鉴定奠定了基础㊂关键词:青梗菜;纯度鉴定;InDel中图分类号:S636.9㊀㊀㊀文献标志码:A㊀㊀㊀文章编号:0528-9017(2024)05-1120-06Identification of the purity of Dianhu 1hybrids using InDel markersFANG Xiaoxue,WEI Yinlan,ZHANG Chengfeng,LIAO Han,HU Jinbin,WU Xinsheng ∗(Ningbo Weimeng Seed Industry Co.,Ltd.,Ningbo 315101,Zhejiang)㊀㊀Abstract :Dianhu 1is a new variety of Brassica rapa L.ssp.chinensis L.bred by Ningbo Weimeng Seed IndustryCo.Ltd.,but the speed of seed purity identification has limited the promotion of this variety.In order to realize high-throughput and rapid identification of the purity of hybrid seeds of this variety,InDel markers for purity detection weredeveloped on the basis of the resequencing of the genomes of the parents of Dianhu 1(Male parent:EPG-194;Femaleparent:EPG-168).The DNA samples of Dianhu 1and its parents were used to select primers D1-7with complementaryband types,clear amplification bands and fast separation speed,and the primers were used to detect the F 1population of Dianhu 1in the field.The primer D1-7was used to test the F 1population of Dianhu 1in the field (400plants for EpG-194ˑEpG-168group and 400plants EpG-168ˑEpG-194group).In the experiment,the molecular detection results of primerD1-7showed that there were 146and 32non-F 1hybrids in the EpG-194ˑEpG-168group and EpG-168ˑEpG-194group,and 146and 32non-F 1hybrids in the EpG-194ˑEpG-168group and EpG-168ˑEpG-194group were identified by fieldphenotyping,which were identical to the results of the 800single plants identified by the two primers.The results showedthat the InDel primers D1-7accurately identified the mixed maternal selfed hybrids in Dianhu 1population,which laid the foundation for the rapid identification of the purity of Dianhu 1hybrids in the future.Keywords :Brassica rapa L.ssp.chinensis L.;purity identification;InDel㊀㊀青梗菜属于十字花科,芸薹属作物,是叶菜类蔬菜的典型代表[1]㊂因其生长周期短㊁种植密度大㊁适应性强等优点在我国被广泛种植,是国家 菜篮子工程 的重要作物之一[2]㊂青梗菜杂交种的一致性强,抗性稳定,当前国内市场中的青梗菜品种多为杂交品种㊂种子纯度是决定杂交种质量的关键因素,直接影响种子经济价值和蔬菜特征特性的一致性㊂青梗菜的杂交种主要通过人工去雄后再授粉获得,容易产生自交种,导致种子混杂[3]㊂目前杂交种的主要鉴定方式为田间表型鉴定和分子标记鉴定㊂田间表型鉴定耗时较长,容易受到环境因素的影响,无法满足快速准确鉴定种子纯度的需求[4]㊂因此,寻找合适的分子标记,对大批量青梗菜种子纯度的快速鉴定很有必要㊂分子标记鉴定主要建立在DNA序列多态性的基础上,兼具稳定性高㊁数量丰富㊁多态性高等优点[5]㊂InDel标记是目前最主要的分子标记之一㊂某一等位基因的DNA序列在不同个体间发生了一段相对较短的核苷酸片段的插入或缺失,产生长度多态性变异是InDel标记设计的基础㊂根据目标位点两侧的序列设计特异引物,进行PCR扩增,扩增片段的长度存在多态性[6]㊂InDel标记为共显性标记,在基因组内分布广㊁密度高,自生变异稳定㊁多态性强,引物的扩增效率高㊁带型简单㊁分离效果好[7-8]㊂因此,InDel分子标记的建立对青梗菜的育种研发具有重要意义㊂本试验通过对宁波微萌种业有限公司育成的青梗菜品种典湖1号父母本的重测序数据进行比对,筛选出合适的InDel分子标记,用于快速鉴定典湖1号种子纯度㊂1㊀材料与方法1.1㊀试验材料㊀㊀本试验以宁波微萌种业有限公司提供的青梗菜品种典湖1号及其父本㊁母本为试验材料㊂典湖1号母本EPG-168株幅大㊁叶柄半直立㊁叶片近圆形,老叶深绿色㊁新叶浅绿色,叶脉宽㊂父本EPG-194株型紧凑,叶柄直立,叶片卵圆形,老叶和新叶颜色深绿,叶脉窄㊂典湖1号杂交种植株株幅大,叶片近圆形,老叶深绿,新叶颜色介于母本和父本之间,叶脉宽㊂EpG-194ˑEpG-168群体叶色较EpG-168ˑEpG-194群体浅㊂试验取典湖1号EpG-194ˑEpG-168和pG-168ˑEpG-194种子各400粒,播于塑料穴盘内,播种时需一孔一粒㊂待幼苗长至两叶一心阶段定植到浙江省宁波市鄞州区的宁波微萌有限公司邱隘农场内,定植时做到同一大棚同一地块以减小环境影响㊂1.2㊀试验方法1.2.1㊀DNA提取㊀㊀以典湖1号杂交种及其父㊁母植株为对象,摘取约2cm2新鲜幼叶置于装有钢珠的2mL离心管中,用组织研磨仪60Hz研磨60s㊂离心管内加入700μL浓度为0.05mol㊃L-1NaHSO3的2ˑCTAB 溶液,经65ħ水浴30min后加入700μL氯仿-异戊醇混合液(氯仿ʒ异戊醇=24ʒ1),摇匀后以8000r㊃min-1离心8min㊂离心后吸取300μL上清液并移入1.5mL离心管中㊂上清液中加入300μL预冷的异丙醇,摇匀后12000r㊃min-1离心10min㊂弃去溶液后加入300μL75%乙醇溶液洗涤5min㊂小心地弃去乙醇溶液,室温放置24h 蒸发残存的乙醇溶液㊂乙醇溶液完全蒸发后加入ddH2O溶解DNA,并用混匀仪混匀,用ddH2O调节DNA浓度至100~200ng㊃μL-1,即得DNA溶液㊂DNA溶液置于-20ħ冰箱内保存㊂实际取样提取DNA时,田间因存在枯死植株和离心管破裂等问题,EpG-194ˑEpG-168㊁EpG-168ˑEpG-194群体分别仅提取了395和399份DNA样品㊂1.2.2㊀全基因组重测序与InDel位点筛选㊀㊀将制备好的典湖1号父㊁母本各3株单株的DNA溶液混合做混合基因池㊂父㊁母本混合基因池送至天津诺禾致源科技股份有限公司进行全基因组重测序,获取全基因组原始数据㊂去除原始数据中的低质量序列㊁接头序列㊁重复序列等,以排除测序过程中产生的错误和杂质,保证所获取的数据准确可靠㊂处理后的数据通过BWA软件与青梗菜全基因组数据进行比对,筛选出在父㊁母本间存在的变异位点㊂使用SAMTOOLS软件对父㊁母本变异位点进行InDel位点检测㊂1.2.3㊀引物设计㊀㊀根据预测到的InDel位点,选取父本缺失㊁母本无变异的差异位点,运用Primer5.0软件在其两端的保守区域设计引物㊂为保证引物能实现有效扩增和产物分离的效果,设计引物参数为:退火温度为50~60ħ,长度为18~24bp,GC含量为40%~ 60%,产物长度为200~400bp,引物无二级结构和发夹结构,不产生引物二聚体㊂引物由宁波景航生物科技有限公司合成㊂1.2.4㊀PCR扩增和电泳㊀㊀PCR扩增体系为:DNA模板1.5μL,ddH2O 5.5μL,2ˑTaqMasterMix10μL,正㊁反向引物各1.5μL(浓度10ng㊃μL-1)㊂PCR扩增程序为:94ħ预变性3min,94ħ变性20s,56ħ退火20s,72ħ延伸30s,循环数32,72ħ延伸10min,12ħ保存㊂制备浓度为4%的琼脂糖凝胶,在350V, 500mA的条件下电泳50min㊂使用BIO-RAD凝胶成像仪获取图像㊂1122㊀㊀2024年第65卷第5期2㊀结果与分析2.1㊀引物筛选㊀㊀将典湖1号亲本全基因组重测序信息与青梗菜全基因组信息进行比对分析,根据预测到的InDel 位点设计出4对引物(表1)㊂利用4对引物对典湖1号及其父㊁母本DNA样品进行PCR扩增,经琼脂糖凝胶电泳后所得条带如图1所示㊂DH1-9和DH1-10均未扩增出明显的母本条带,无法用于纯度鉴定㊂DH1-6和DH1-7扩增典湖1号及其父㊁母本均可扩增出清晰度高㊁特异性强㊁分离程度适中的条带,且杂交种典湖1号的带型为父㊁母本带型的互补型㊂仔细比较后发现DH1-6上带下方有暗淡的副带,特异性低于DH1-7㊂筛选后确定DH1-7可用于典湖1号纯度鉴定㊂表1㊀典湖1号引物序列Table1㊀Sequence of primers for Dianhu1引物编号正向引物(5ᶄ-3ᶄ)反向引物(3ᶄ-5ᶄ) DH1-6GAATCGTCGCTCAAATCGGG TCTTCCGCAGGCTGGAAGA DH1-7ATGCGTCAGGAGAATATCGC CGCCAAGAGAGTTACGAGA DH1-9GCCTTCAACTTGGGGTTTAAGGG CATACAAGGAGCAGCTGACGTG DH1-10TGTTTGCGAGGGGTGATTGA GGTAGGCGAATTCAGGTGAA图1㊀不同引物扩增产物的琼脂糖凝胶电泳图Fig.1㊀Agarose gel electropherograms of different primer amplification products2.2㊀InDel标记鉴定典湖1号纯度2.2.1㊀EpG-194ˑEpG-168群体㊀㊀利用引物DH1-7检测典湖1号EpG-194ˑEpG-168群体395株,其中144株扩增出母本条带,其余256株扩增出F1型双带(图2)㊂根据纯度计算公式,计算出EpG-194ˑEpG-168群体的纯度为64.81%㊂2.2.2㊀EpG-168ˑEpG-194群体㊀㊀利用引物DH1-7检测典湖1号EpG-168ˑEpG-194群体399株,其中32株扩增出母本条带,其余植株扩增条带均为F1型双带,EpG-168ˑEpG-194群体纯度为91.98%㊂2.3㊀田间表型鉴定典湖1号纯度2.3.1㊀EpG-194ˑEpG-168群体在田间表型鉴定中,典湖1号杂交种株型较大,叶片颜色相对较浅,叶片近圆形,老叶深绿,新叶颜色介于母本和父本之间,叶脉宽㊂EpG-194ˑEpG-168群体叶色较EpG-168ˑEpG-194群体浅㊂运用传统的田间表型鉴定法观察EpG-194ˑEpG-168群体396株,确认146株母本自交种植株,纯度为68.49%㊂2.3.2㊀EpG-168ˑEpG-194群体㊀㊀运用传统的田间表型鉴定法观察EpG-168ˑEpG-194群体399株,检出32株杂株(图3), EpG-168ˑEpG-194群体纯度为91.98%㊂2.4㊀InDel标记分子检测与田间表型鉴定纯度结果比对㊀㊀InDel标记分子检测与田间表型鉴定比对结果如表2所示㊂EpG-194ˑEpG-168群体分子检测检出㊀㊀图2㊀DH1-7检测典湖1号EpG-194ˑEpG-168群体纯度部分电泳图Fig.2㊀Partial electropherogram of DH1-7to detect the purity of the EpG-194ˑEpG-168group of Dianhu1图3㊀田间鉴定典湖1号EpG-194ˑEpG-168和pG-168ˑEpG-194群体表型Fig.3㊀Phenotype of EpG-194ˑEpG-168group and EpG-168ˑEpG-194group of Dianhu1was identifiedin the field 144株为杂株,纯度为63.64%;田间表型鉴定检出146株杂株,纯度为63.22%㊂将分子检测与表型鉴定结果进行比对,有254株杂交种和144株自交种鉴定结果一致,吻合度为99.50%㊂EpG-168ˑEpG-194群体分子检测和表型鉴定均检出32株杂株,杂株编号一致,纯度为91.92%,吻合度为100%㊂2.5㊀InDel标记鉴定与田间表型鉴定结果差异分析㊀㊀对比后,发现编号124㊁302两株植株的InDel 标记鉴定与田间表型鉴定结果不一致㊂查看原始胶图发现编号124无条带,编号302显示F1带型㊂经过重新取样检测,结果(图4)显示,编号124㊁302植株条带均为母本带型,可认定为杂株㊂1124㊀㊀2024年第65卷第5期㊀㊀表2㊀InDel 标记鉴定与田间表型鉴定纯度结果对比Table 2㊀Comparison of the purity results of InDel marker identification and field phenotypic identification检测样品检测株数检测方法鉴定结果纯度/%吻合度/%典湖1号(EpG-194ˑEpG-168群体)396InDel 标记鉴定上带带型编号:8㊁10㊁11㊁12㊁15㊁23㊁24㊁25㊁31㊁36㊁37㊁40㊁47㊁55㊁56㊁57㊁59㊁63㊁64㊁65㊁69㊁72㊁73㊁74㊁75㊁76㊁79㊁80㊁81㊁82㊁86㊁89㊁90㊁91㊁92㊁95㊁100㊁102㊁107㊁108㊁109㊁113㊁117㊁118㊁119㊁120㊁122㊁125㊁129㊁134㊁135㊁139㊁140㊁141㊁142㊁144㊁145㊁149㊁150㊁153㊁154㊁161㊁162㊁164㊁170㊁172㊁174㊁178㊁179㊁183㊁185㊁187㊁188㊁192㊁199㊁201㊁204㊁209㊁214㊁215㊁216㊁217㊁221㊁222㊁224㊁225㊁226㊁228㊁230㊁236㊁238㊁240㊁241㊁247㊁248㊁253㊁254㊁255㊁256㊁263㊁265㊁270㊁271㊁273㊁276㊁277㊁278㊁279㊁280㊁282㊁286㊁290㊁292㊁295㊁303㊁305㊁306㊁310㊁314㊁316㊁318㊁332㊁335㊁339㊁340㊁341㊁343㊁345㊁348㊁349㊁355㊁357㊁360㊁361㊁364㊁365㊁370㊁372㊁376㊁377㊁381㊁387㊁396㊁397(共144株)无条带编号:104㊁105㊁124㊁36363.6499.50397表型鉴定母本自交种植株编号:8㊁10㊁11㊁12㊁15㊁23㊁24㊁25㊁31㊁36㊁37㊁40㊁47㊁55㊁56㊁57㊁59㊁63㊁64㊁65㊁69㊁72㊁73㊁74㊁75㊁76㊁79㊁80㊁81㊁82㊁86㊁89㊁90㊁91㊁92㊁95㊁100㊁102㊁107㊁108㊁109㊁113㊁117㊁118㊁119㊁120㊁122㊁125㊁129㊁134㊁135㊁139㊁140㊁141㊁142㊁144㊁145㊁149㊁150㊁153㊁154㊁161㊁162㊁164㊁170㊁172㊁174㊁178㊁179㊁183㊁185㊁187㊁188㊁192㊁199㊁201㊁204㊁209㊁214㊁215㊁216㊁217㊁221㊁222㊁224㊁225㊁226㊁228㊁230㊁236㊁238㊁240㊁241㊁247㊁248㊁253㊁254㊁255㊁256㊁263㊁265㊁270㊁271㊁273㊁276㊁277㊁278㊁279㊁280㊁282㊁286㊁290㊁292㊁295㊁303㊁305㊁306㊁310㊁314㊁316㊁318㊁332㊁335㊁339㊁340㊁341㊁343㊁345㊁348㊁349㊁355㊁357㊁360㊁361㊁364㊁365㊁370㊁372㊁376㊁377㊁381㊁387㊁396㊁397㊁124㊁302(共146株)枯死无法鉴定植株:104㊁105㊁36363.22典湖1号(EpG-168ˑEpG-194群体)399分子检测下带带型编号:10㊁15㊁32㊁34㊁42㊁51㊁66㊁80㊁104㊁112㊁132㊁136㊁149㊁150㊁155㊁165㊁176㊁178㊁189㊁192㊁211㊁222㊁265㊁282㊁283㊁287㊁313㊁330㊁331㊁340㊁346㊁376㊁(共32株)无条带编号:39691.92100.00399表型鉴定父本自交种植株编号:10㊁15㊁32㊁34㊁42㊁51㊁66㊁80㊁104㊁112㊁132㊁136㊁149㊁150㊁155㊁165㊁176㊁178㊁189㊁192㊁211㊁222㊁265㊁282㊁283㊁287㊁313㊁330㊁331㊁340㊁346㊁376㊁(共32株)枯死无法鉴定植株:39691.92图4㊀InDel 标记对田间表型鉴定杂株的再次验证电泳图Fig.4㊀Revalidation electropherogram of InDel markers for phenotypic identification of hybrid plantsin the field分子检测鉴定典湖1号EpG-194ˑEpG-168群体杂株数为146株,纯度为63.22%,分子鉴定与田间表型鉴定结果吻合度为100%㊂3㊀讨论㊀㊀种子纯度是种子质量的关键指标,直接影响着作物的产量和品质㊂传统田间表型鉴定纯度因时间周期长㊁受环境影响大和部分表型性状把握不准等因素被淘汰㊂而分子检测,如SSR㊁InDel 分子标记等技术逐渐被应用到种子纯度鉴定领域[9]㊂SSR 标记因操作简单㊁广谱性好和成本低等特点,已经成熟应用于水稻㊁西瓜和棉花等作物的种子纯度鉴定[10]㊂随着全基因组技术的发展,InDel 标记逐渐被研究者广泛应用,其中就涉及了性状控制㊁纯度鉴定等领域[11-12]㊂InDel 分子标记相比SSR 标记,多态性更小且分布较密,应用时的重现性㊁准确性和分辨率大幅提高[13]㊂试验的InDel 分子检测的主要目标为混杂其中的亲本自交种,外源花粉污染植株因随机性强而无法准确鉴定㊂考虑实际种子生产存在人为隔离外源花粉源的措施如套袋㊁人为拔除等,因此,开发该InDel标记应用于杂交种种子纯度是有实际意义的㊂典湖1号EpG-168ˑEpG-194群体的InDel标记分子检测与田间表型鉴定结果完全一致,但EpG-194ˑEpG-168群体编号124㊁302的分子检测结果与田间表型有差异㊂经检查,编号124植株提取DNA样品中因磨样过程中离心管破裂导致DNA提取失败,造成第一次InDel分子检测无扩增产物条带;编号302植株则是因播种穴盘时没有做到一粒一空,定植的302编号对应植株有2株导致取样和InDel分子检测结果紊乱㊂为排除上述因素的干扰,试验对编号124㊁302植株重新取样,二次分子检测的条带均为上带带型,鉴定为母本自交种或外源花粉污染植株,与田间表型鉴定结果一致㊂综上所述,InDel分子标记引物DH1-7可以准确检测出典湖1号EpG-194ˑEpG-168和EpG-168ˑEpG-194群体中混杂的母本自交种植株,可以替换传统的田间表型鉴定用于纯度检测㊂通过InDel分子检测和田间表型鉴定两种方式对同一杂交种青梗菜典湖1号群体做了纯度检测,二者结果相互验证确保了InDel分子检测结果的准确性㊂验证后的InDel引物DH1-7可以直接应用于种子或植株的纯度鉴定,不仅减少了大量工作和时间,也保障了大批量样品检测的速度和准确性㊂本试验对InDel分子标记测纯引物开发做出了系统性的阐述,为后续其他作物开发相关标记提供了借鉴㊂参考文献:[1]㊀王晶晶.铬污染胁迫下青梗菜的代谢响应[D].温州:温州大学,2019.[2]㊀施正侃,朱守业,杨昌勤,等.青梗菜新品种寒悦160的选育及其栽培技术[J].浙江农业科学,2023,64(5):1153-1156.[3]㊀张跃华.持绿青梗菜和菜心雄性不育系定向转育与利用[D].沈阳:沈阳农业大学,2022.[4]㊀胡志辉,陈禅友.豇豆品种纯度鉴定方法及其评析[J].江汉大学学报,2002,19(1):86-88.[5]㊀李斯更,沈镝,刘博,等.基于黄瓜基因组重测序的InDel标记开发及其应用[J].植物遗传资源学报,2013,14(2):278-283.[6]㊀王莎.瓠瓜SSR和InDel分子标记的开发及应用[D].金华:浙江师范大学,2013.[7]㊀岳晓鹏.基于甘蓝型油菜基因组重测序开发InDel标记[D].武汉:华中农业大学,2014.[8]㊀冯芳君,罗利军,李荧,等.水稻InDel和SSR标记多态性的比较分析[J].分子植物育种,2005,3(5):725-730.[9]㊀胡丹丹.新型甘蓝型油菜的群体改良和杂种优势分析[D].武汉:华中农业大学,2019.[10]㊀余香.白菜薹杂种一代种子生产技术的研究及纯度鉴定[D].武汉:华中农业大学,2015.[11]㊀阚云霞,师海林,张丹丹,等.基于农艺性状和InDel标记的矮生番茄种质资源遗传多样性分析[J].农业生物技术学报,2023,31(6):1122-1132.[12]㊀冯健起,王培云,蔡亚平,等.利用InDel标记鉴定汴早九号大白菜杂交种纯度[J].中国瓜菜,2023,36(12):33-38.[13]㊀魏茜雅,刘乃新,吴则东,等.甜菜分子标记InDel-PCR引物的筛选[J].中国糖料,2020,42(2):7-11.(责任编辑:王新芳)。
玉米和高粱SSR与InDel分子标记基因分型中N+1峰的消除
以36份玉米材料为供试品种,采用五种N+1峰消除方法对这13对引物进行试验,比较几种方法对N+1峰的消除结果,筛选出三种消除结果好的方法,利用筛选出的方法对40对SSR引物中的其他引物进行多次试验,电泳结果正常,最后对于玉米品种鉴定技术规程SSR标记法中40对引物基因分型中N+1峰的消除,提出三种优化方案。2、以24份高粱材料作为供试品种,对高粱品种鉴定行业标准中40对SSR引物进行筛选,共有15对引物产生了N+1峰。
对于这些引物,采用上一个试验中筛选出的前两种消除方法对N+1峰进行消除,两种方法同样适用于高粱SSR基因分型中N+1峰的消除,最后建立适用于高粱品种鉴定技术规程SSR标记法中40对引物基因分型中N+1峰的两种优化方案。3、利用20对InDel引物对36份玉米品种分别进行单重和多重PCR试验,筛选出玉米InDel单重和多重复合体系中产生N+1峰的引物,第一个试验中方法一和方法二是针对玉米SSR标记单重PCR中N+1峰的消除,证明两种方法同样适用于玉米InDel标记单重PCR,对于玉米InDel多重PCR复合体系中N+1峰的消除,单独使用两种方法时,并没有获得单重PCR中的结果,而两种方法均是促进扩增产物充分加A,因此结合使用两种方法,即在方法二的基础上,增加PCR反应程序最后一步的延伸时间。
试验证明该优化方法适用于InDel标记多重PCR中N+1峰的消除,最后建立玉米InDel多重复合体系中N+1峰的优化方案。
基因内SNP及indel的功能与作用机制
基因内SNP及indel的功能与作用机制在人类基因组中，有大量的单核苷酸多态性（SNP）和插入/删除（indel）变异。
这些变异是遗传学研究的重要对象，也是人类疾病的重要潜在驱动因素。
SNP是指DNA序列中某个单核苷酸的碱基发生变化，而indel则是指DNA序列中插入或删除一个或多个碱基，这些变异可能影响基因功能和表达的调控机制。
在本文中，我们将探讨基因内SNP及indel的功能与作用机制。
1. SNP的功能和作用机制SNP是最常见的基因序列变异，并且是广泛应用于人类基因组研究和医学遗传学诊断的分子标记。
SNP的作用种类多种多样，包括影响编码蛋白质的氨基酸序列（非同义变异）、影响转录因子结合（调控变异）、调节外显子剪接、影响mRNA剪接（剪接变异）等。
非同义变异使得氨基酸序列发生变化，这些变化可能引起蛋白质形态、功能、稳定性、交互作用和酶催化活性的改变。
亚洲人群中发现的非同义变异rs10757274是伴随肥胖、天生性耳聋等疾病的重要分子标记。
此外，非同义变异可能通过影响启动子或增强子的相对位置或转录因子的结合亲和性来调节基因表达水平。
调控变异通过影响转录因子结合来调节基因表达调控。
例如，rs1800468是interleukin-6（IL-6）启动子区域的T/C变异，该变异具有增强转录因子NF-κB结合和IL-6表达的作用，在多种炎症性和肿瘤疾病中发现。
剪接变异是指通过影响mRNA剪接方式来调节基因表达调控。
剪接变异主要发生在外显子/内含子交界处或外显子上。
如新型冠状病毒可能影响ACE2 mRNA剪接，进而影响SARS-CoV-2进入机体细胞的能力。
2. Indel的功能和作用机制indel与SNP类似，也是基因组中常见的一种变异。
indel的作用大多涉及到剪接调节、蛋白翻译后修饰、蛋白结构相互作用等。
indel对基因外显子的剪接调节具有重要的影响。
有没有indel的基因在剪接机器中的不同位置停留，从而产生不同的剪接位点和剪接产物。
基于高通量测序的大麦InDel标记开发及应用
作物学报 ACTA AGRONOMICA SINICA 2020, 46(9): 1340 1350 / ISSN 0496-3490; CN 11-1809/S; CODEN TSHPA9 E-mail: zwxb301@本研究由国家重点研发计划项目(2017YFD0101205, 2017YFD0102005)和江苏省农业科技自主创新项目[CX(18)3001]资助。
This study was supported by the National Key Research and Development Program of China (2017YFD0101205, 2017YFD0102005) and the Jiangsu Agricultural Science and Technology Innovation Fund [CX(18)3001].*通信作者(Corresponding author): 颜伟, E-mail: yanwei@, Tel: 025-********第一作者联系方式: E-mail: 139********@, Tel: 025-********Received (收稿日期): 2019-12-26; Accepted (接受日期): 2020-04-15; Published online (网络出版日期): 2020-05-08. URL: /kcms/detail/11.1809.S.20200508.1410.002.htmlDOI: 10.3724/SP.J.1006.2020.91076基于高通量测序的大麦InDel 标记开发及应用徐婷婷 汪巧玲 邹淑琼 狄佳春 杨 欣 朱 银 赵 涵 颜 伟*江苏省农业科学院种质资源与生物技术研究所 / 江苏省农业种质资源保护与利用平台 / 江苏省农业生物学重点实验室, 江苏南京 210014摘 要: 分子标记是遗传研究的基础工具, 广泛应用于遗传多样性研究、种质鉴定、遗传图谱构建和基因定位等领域。
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另外，同工酶研究也有助于探讨生物个体发育过程中基因表达与调控。
生化标记具有简便、经济、快速和准确等优点，但是同样具有标记数目
有限的缺点。贮藏蛋白与种子的萌发等发育过程有关，也具有生物种属
的特异性，可以作为遗传标记。例如，马铃薯蛋白是马铃薯块茎中的主
要蛋白（贮藏蛋白），玉米醇溶蛋白是玉米种子内的贮藏蛋白，按其结
的Indel诱变效应，可能是解开肿瘤发生机制的关键；大量Indel的总体诱变效
应，对理解生命的起源具有重要作用；杂合体Indel的放大诱变效应，可使基因
的突变率大大提高，在作物遗传育种中有重大潜在应用价值。
（《自然》（Nature），doi:10.1038/nature07175，Dacheng Tian，Jian-Qun Chen）
当一条序列发生插人或者缺失时，与之比对的另一条序列就会相应地产 生空位；
2)空位的长度表现出一个双峰(bimodal type)的频率分布，短的空位 (20～30核苷酸)主要是由DNA复制过程的错误造成， 比如滑动链的错 配，而长的插入和缺失的发生主要是由不等长的互换或者DNA错位造 成。
生物学上，空位被认为是序列从共同的祖先分化时产生的插入或缺 失。
幻灯片 14 微软用户1
空位1存在于序列A和B中。空位2存在于序 列C和D中。空位3存在于序列A中。空位4存在 于序列c中。空位5存在于序列D中。在数据矩阵 中，序列c和D中对于空位1时缺失的，序列A和 B对于空位2是缺失的，序列c对于空位3和5是 不可编码的。所以当使用简单indel编码时，空位3和5对于这4条序列不是信息位点。
通过以下例子(见图1)说明其编码空位的原理。
微软用户1
(1)
(2)
(1)中①代表空位1，位置从3到9；②代表空位2，位置从7到11；③代表 空位3，位置从21到23；④代表空位4，位置从21到28；⑤代表空位5， 位置从24到28．
(2)数据矩阵中的空位性状．⋯0’表示空位性状缺失，“1”表示空位性状存 在，“-”表示性状不可编码
理论应用
Single-nucleotide mutation rate increases close to insertions/deletions in eukaryotes
在丰富多彩的生命世界，究竟什么原因造就诱人的生命多样性？南京大学教授经多年
潜心研究大胆提出“Indel诱变假说”，用新发现的“遗传突变的普遍机制”破解了生物学上的
③引物序列的GC含量最好在40%--60%，且上下游引物序列GC含量的差异不要 太大，3’端最后5个碱基最好不要富含GC，特别是连续3个的G或C
④DNA双链形成所需的自由能△G，应该以5’端向3’端递减，3’端△G最好不要高 于9.0 kcal/mol .
⑤避免形成稳定的引物二聚体(Dimer and Cross Dimer)和发夹结构(Hairpin) , AG高于4.5 kcal/mol时易引发上述两种结构的产生。
田大成等发现的遗传突变新机制具有重大科学意义，成功破解了生物遗传学
上的很多悬念：第一，基因组各区域的突变率很不相同，自发突变的数量是由
Indel的数量和密度所决定，自发突变的数量在Indel附近并不稀有，远离Indel的
区域是稀有的，但Indel本身是一种点突变，其发生有一定的随机性，因而其诱
发的突变也有一定的随机性；第二，找到了多数自发突变的发生根源，也就是
微软用户, 2009-5-25
Indel标记 How to exploit it？
引物设计的原则和注意事项： ①引物的长度一般为15-30 bp，最好在18-24 bp,因为太短易形成错配(false
priming)降低特异性，而太长也会降低特异性，并且降低产量。
②引物在模板内最好具有单一性，也就是说在模板内部没有错配。特别是3’端， 一定要避免连续4个以上的碱基互补错配。
有限的弱点。
1.3 生化标记（Biochemical Markers）
生化标记是指生物的生化特征特性，主要包括同工酶和贮藏蛋白两
种标记。同工酶是生物体代谢的调节者，与特殊的生理功能和细胞分化
相联系，也与基因进化和物种的演变有关，因此，同工酶既可作为生理
指标又可作为遗传标记在生物群体的遗传进化和分类研究中广为应用。
构和溶解度分为α、β、γ和δ四大类等。
1.4 DNA分子标记（Molecular Markers）
DNA分子标记是能反映生物个体或种群间基因组中某
种差异特征的DNA片段。此DNA片段是将基因组DNA经过
限制性内切酶切割和分子杂交或PCR扩增后在电泳凝胶上
（或杂交膜上）检测到的。它广泛地应用于生物基因组研
⑥引物所在的模板区域应该位于外显子区，最好跨越一个内含子区，这样便于对 扩增出来的片段进行功能鉴定和表型分析。
⑦如果以DNA为模板设计引物，产物长度在100-600 bp比较理想。而以mRNA 为模板设计引物时，产物长度在150-300bp比较理想。5'端对PCR影响不太大， 可以引进修饰位点和标记物.
本文以水稻Indel标记的开发为例
水稻是最重要的粮食作物，也是单子叶模式植物。水稻重要基因的 精细定位和克隆已成为当前植物功能基因组学研究的热点之一，而功能 基因克隆的最基本和最重要的方法是图位克隆。图位克隆的关键是寻找 与目标基因紧密连锁的分子标记，然而，目标基因周围已有的分子标记 密度常常不能满足需要。因此，合理地利用亲本之间DNA 序列的多态性 来发展新的分子标记，是提高图位克隆效率的重要方法。双亲间DNA序 列的多态性是发展分子标记的基础，基于PCR的共显性分子标记是现在 最常用的标记类型。通常用于发展这类分子标记的DNA序列多态性有3 种基本的形式：简单序列重复长度多态性(simple sequence repeat length poly—morphism，SSR)、插入缺失长度多态性 (insertiondeletionlength polymorphism，InDel)和单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism，SNP)，由这3种基本的多态性产生的分子标 记分别为SSR标记、InDel标记和SNP标记。
说，生物多样性的最初变异来源，主要是由Indel诱导产生；第三，自然选择在
很大程度上是通过对Indel的选择而实现，而自发突变率的高低很大程度上也是
自然选择的结果；第四，生物通过调节自身变异能力而适应环境的能力，比人们
原先想象的要大得多，即突变在进化中的作用相当巨大。
该研究成果不仅引发了大量科学问题，还具有潜在的应用前景，如体细胞中
1.1 形态标记（Morphological Markers）
形态标记是指生物的外部特征特性。包括质量性状作遗 传标记和数量性状作遗传标记，例如人的肤色、作物的株 高、种子的粒形和动物的体重等。它是最早被使用和研究的 一类遗传标记。在遗传的分离规律、自由组合定律和连锁交 换定律以及群体遗传学和数量遗传学的研究和应用等方面发 挥着重要作用。它具有易于识别和掌握、简单直观等优点， 但也具有标记数量少、多态性差和易受环境因素影响等不 足。
究、进化分类、遗传育种、医学和法学等方面，成为分子遗
传学和分子生物学研究与应用的主流之一。
与其它遗传标记相比较，DNA分子标记具有诸多优点：1）能对生 物各发育时期的个体、各组织、器官和细胞进行检测，直接以DNA的 形式表现，不受环境影响，不存在基因表达与否的问题；2）数量丰 富，遍及整个基因组；3）遗传稳定，多态性高；4）对生物体的影响 表现为“中性”，不影响目标性状的表现，和不良性状无必然连锁；5） 多为共显性，能为鉴别纯合基因型和杂合基因型提供完整的遗传信 息；6）操作简便等等。这些优点使其广泛地应用于生物基因组研 究、进化分类、遗传育种、医学和法学等方面，成为分子遗传学和分 子生物学研究与应用的主流之一，并且对社会产生巨大冲击。目前， 被广泛应用的DNA分子标记主要有RFLP（限制性片段长度多态 性）、RAPD（随机扩增多态性DNA）、ALFP（扩增片段长度多态 性）、STS（序列标记位点）、SSR or SSLP（简单重复序列）、 Indel（插入缺失序列）DNA指纹技术等。
Indel Markers
汇报人：郎需勇 学号：2008202040083
引言 Indel标记
Outline
引言
遗传标记（Genetic Markers）是基因型特殊的易于识别的表现形 式。它一般具有较强的多态性、表现的共显性、不影响重要的农艺性 状和经济方便、易于观察记载等优点。它在遗传学的建立和发展过程 中起着重要作用。随着遗传学的发展，遗传标记也在不断的发展。从 遗传学的建立到现在，遗传标记的发展主要经历了4个阶段，表现出了 4种类型。 1 形态标记（Morphological Markers） 2 细胞标记（Cytological Markers） 3 生化标记（Biochemical Markers） 4 DNA分子标记（Molecular Markers）
假说可用不同物种的基因组作参照系加以检验，并得到多种检验结果的支持。
田大成解释说，基因突变主要是指DNA中核苷酸顺序、种类和数量的改变，而DNA序
列中普遍存在的点（碱基）突变是遗传变异的基本来源。点突变又分为自发突变和诱发突
变。长期以来，学术界对自发突变机制的经典认识是，自发突变受一系列因素的影响，是 一系列变化的结果，具有随机性和稀有性。但随着上个世纪90年代以来DNA测序技术的突 破性进展，研究者们对自发突变在基因组中的数量和分布有了精确估计，并普遍认为“自发 突变在基因组中不是随机分布的，突变热点普遍存在于基因组中”。这一结论对传统的自发 突变随机性和稀有性的认识形成巨大挑战，而这种现象也引起了各国科学家的极大关注， 但遗憾的是始终没有找到一种普遍的机制来解释这一重大的科学疑问。