免疫组化染色的操作技巧和注意事项
免疫组化染色(石蜡切片)操作步骤及结果分析方法(精髓版)
免疫组化染色（石蜡切片）操作步骤及结果分析方法一、原理及应用免疫组化，简单说是用标记的抗体对组织中相应抗原进行定位、定性和部分定量的分析。
二、操作步骤：（1）将石蜡组织切片置于65°C恒温箱，烤片1h左右。
（2）脱蜡：二甲苯I 10min→二甲苯II 10min →梯度酒精（由高到低）各5min。
（3）1×PBS 洗涤3次，每次 5min。
（4）0.5% Triton X-100通透（PBS配制），目的是使抗体能够充分地进入胞内进行结合反应。
Triton X-100 可以溶解细胞膜、细胞核膜、细胞器膜上的脂质而使抗体及大分子结构的物质进入胞浆和胞核内，这样抗体就能顺利进入胞内与相应抗原结合。
当然了，如果检测的是膜抗原无需通透，忽略该步骤。
（4）抗原修复：使用柠檬酸盐缓冲液进行抗原修复，微波炉微波高火 3min，之后转成低火 15-30min。
注：福尔马林或多聚甲醛固定，会导致蛋白交联，而解交联的过程称为抗原修复。
所以冰冻切片不需要抗原修复！！抗原修复方法有多种，一般包括两大类：酶抗原修复(胰蛋白酶、胃蛋白酶、蛋白酶K) 热抗原修复(高压蒸汽法、微波法、水浴加热法)。
微波法最为常用。
（5）1×PBS 洗涤3次，每次5min。
（6）3% H2O2，室温孵育30min，目的是灭活内源性过氧化物酶。
（7）1×PBS 洗涤3次，每次5min。
（8）使用1% BSA 进行室温封闭30min，用于封闭非特异性抗原表位。
（9）根据抗体说明书使用合适浓度的特异性一抗，4°C 湿盒中静置过夜孵育。
（10）次日取出切片，室温下复温30min。
（11）1×PBS 洗涤3次，每次5min。
（12）按照免疫组化二抗试剂盒说明书操作。
（13）DAB 显色：DAB 显色液按说明书配制，使用时滴加到血管组织上，显微镜下观察并计时，待目的蛋白显色呈棕黄色时结束显色。
（14）苏木素染细胞核：苏木素染液5-10min（根据苏木素染液使用时间的长短，来调整染色时间）→ 流水清洗1min→ 1%盐酸酒精分化瞬时→ 流水清洗1 min→1%氨水反蓝瞬时→流水清洗1min。
免疫组化的染色操作的质控管理
1、 标本固定
固定液为 4%中性缓冲甲醛( 10 ml 甲醛 +90 ml PBS 缓冲液) 。要求离体后及时固定，固定液的量为标本体积的5 ～ 10 倍。固定不当，固定时间不够或过长，都可引起抗原丧失，尤其是一些较脆弱的膜抗原( 如 CD20 等) ，故固定应及时并充分。取材后小标本固定时间应 ＞ 6 h，肿瘤标本最好 ＞ 24 h。
复染是为了衬托免疫组化的阳性染色，所以苏木精颜色不宜太深，同时由于操作中使用了吸附玻片，所以建议复染的苏木精应勤于过滤，减少人为的背景染色。
8、 染色中的Biblioteka 些细节在整个染色过程中，切片始终保持湿润，不能干片。滴加一抗时应将切片上的水甩干，以免抗体被稀释。滴加抗体时要确保覆盖全部组织，以免边缘未覆盖到抗体，引起边缘效应。同时孵育盒要放平，以免抗体流至组织一端，造成假阴性或局部弱阳性结果。
6、 显色
如果发现配制好的 DAB 显色液中出现棕色沉淀那么此显色液可能失效，建议重新配制。在显色时，一般阳性局部广泛或阳性定位在胞质的组织，显色非常迅速，1 ～ 3 min 即可见明显的棕色，应及时终止显色。阳性局部稀少且定位在胞核的组织，那么需要显微镜下观察，时间不宜过长以免造成背景染色。
7、 复染
综上所述，质控工作总是发生在实验检测前才能生效。
如标本制作前的处理固定以及制作中的质控流程和切片质量对免疫组化的染色效果，都是相互影响、相互依存的。在免疫组化操作过程中，有许多至关重要的步骤，都是一环扣一环，每走一步都要进行有效监控，才能做出高质量的切片。因此要求操作人员有高度的责任心，严格遵循操作标准，为病理诊断提供表达准确、染色清晰的高质量的免疫组化染色。
免疫组化步骤和注意事项
免疫组化步骤和注意事项免疫组化是一种重要的实验技术，用于鉴定细胞、组织或生物样本中特定抗原的分布和表达情况。
它可以通过对特定抗原与抗体的特异性结合来检测目标分子的存在和定位。
下面将介绍免疫组化的步骤和注意事项。
免疫组化的主要步骤包括抗原脱蜡、抗体反应、显色和染色。
1. 抗原脱蜡：免疫组化的第一步是将组织样本或细胞脱脂、脱蜡和重水化，以去除蜡质，并使抗体更容易与目标抗原反应。
2. 抗体反应：将脱蜡的组织样本或细胞块通过抗原修复处理，以恢复抗原的免疫反应性。
然后，将免疫抗体与待检测的抗原反应，形成免疫复合物。
免疫抗体可以是单克隆抗体或多克隆抗体，可以与组织或细胞中的特定抗原高度特异性地结合。
3. 显色：免疫复合物形成后，可以使用标记有酶（如辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶）或荧光标记的二抗来检测免疫复合物。
在酶法中，可添加草酰胺基苯酸（DAB）或硫代硝基羟基苯并啶（NBT/BCIP）等底物以产生可见的色素沉积。
在荧光法中，免疫复合物被激光器或荧光灯激发后，会发出特定颜色的荧光信号。
4. 染色：完成显色后，可以通过核染色（如用伊红、伊红和伊蓝）来观察细胞核的形态特征，以配合免疫标记物的定位。
虽然免疫组化是一种有价值的技术，但在实施过程中也需要注意一些问题：1. 选择合适的抗体：在进行免疫组化实验时，选择特异性高、效价好的一抗抗体非常重要。
一抗抗体的选择应基于抗原的特异性和病变的病理生理特性。
2. 优化抗体浓度：免疫组化实验中，抗体浓度的选择是关键因素。
过高的抗体浓度会导致非特异性的染色，而过低的浓度则无法检测到目标抗原。
3. 优化抗原修复处理：抗原修复处理对于免疫组化的成功非常重要。
选择合适的抗原修复方法可以增强组织或细胞中的抗原的免疫反应性。
4. 阴性对照和阳性对照：为了验证实验的可靠性，每次免疫组化实验都应包括阴性对照和阳性对照。
阴性对照不包含待检测的抗原，而阳性对照则确保抗体和显色试剂的正常工作。
5. 切片质量：免疫组化实验的结果直接受到切片质量的影响。
免疫组化的注意事项操作要点和技巧
免疫组化的注意事项、操作要点和技巧一些教训：1、对于多甲灌注固定的标本，如要长期保存，要先脱水后冻存，此法对于采用漂片法IHC 较适合。
正确操作：多甲灌注固定——多甲或甲醛后固定——蔗糖梯度脱水——负70度保存——冰冻切片错误操作：多甲灌注固定——多甲或甲醛后固定——负70度保存——蔗糖梯度脱水——冰冻切片，结果是会有大量冰晶形成。
2、如果能确认使用石蜡切片并使用贴片法进行下一步IHC，多甲或甲醛后固定后应尽快脱水并石蜡包埋。
要点和操作技巧：1.固定：最好用4%的多聚甲醛固定液。
对于冰冻切片，甲醛固定有时比冰冻丙酮好；但对于不同的组织和抗原，可选用不同的固定液。
有时候商品化的抗体会有比较适合而推荐的固定液，请于购置前注意说明书。
Bouin S固定液：饱和苦味酸750ml，甲醛250ml，冰醋酸50ml，其对组织的穿透力较强，固定较好，结构完整，但因偏酸，对抗原有一定损害，且组织收缩明显，不适于组织标本的长期保存。
PLP液：即高碘酸钠-赖氨酸-多聚甲醛，适于固定石蜡切片。
适于富含糖类组织，对超微结构及许多抗原的抗原性保存较好。
2．组织脱水，透明：时间不能太长，否则在切片时容易碎片，切不完整。
3．切片时展片：有些组织在切片后难以在水中展开，这时可适当地在水中加入几滴乙醇。
4．烤片：60℃ 30分钟或37℃过夜，温度太高或时间太长，抗原容易丢失。
5．蜡块及切片的保存：最好在4℃保存6．脱片问题：Poly-L-Lysine(多聚赖氨酸)为目前免疫组化染色工作中最常用的一种防脱片剂，6ml的多聚赖氨酸溶液可按1:10稀释成60ml的工作液，适合于需要酶消化、微波、高温高压的防脱片处理。
如不行，可用双重处理（APES和Poly-L-Lysine）的切片。
在以上两种条件都行不通的情况下，可用如下方法：切片在脱蜡前，放在APES 1：50 丙酮溶液中浸泡3分钟，晾干，即可进行下一步。
7．灭活内源性酶：HRP系统：3%双氧水灭活；AP系统：3%HAc灭活。
免疫组化染色评分方法
免疫组化染色评分方法摘要：一、免疫组化染色评分方法简介二、评分方法的具体步骤1.切片处理2.抗原修复3.抗体孵育4.染色5.洗涤6.复染7.评分三、评分标准及注意事项四、免疫组化染色评分在临床实践中的应用五、总结与展望正文：免疫组化染色评分方法是一种通过检测抗原与抗体反应来评估蛋白质表达水平的实验技术。
该方法广泛应用于生物学、病理学和临床检验等领域，为疾病诊断、疗效监测和疾病研究提供了重要依据。
本文将对免疫组化染色评分方法的具体步骤、评分标准及注意事项进行详细介绍，并探讨其在临床实践中的应用。
一、免疫组化染色评分方法简介免疫组化染色评分方法是一种通过检测抗原与抗体反应来评估蛋白质表达水平的实验技术。
它利用抗原与抗体特异性结合的原理，通过化学反应将蛋白质抗原暴露出来，再与特异性抗体结合，最后通过显色剂显色，从而判断抗原的表达情况。
二、评分方法的具体步骤1.切片处理：将组织样本固定在载玻片上，并进行脱水、透明、浸蜡等处理。
2.抗原修复：采用热或酶消化法对切片进行抗原修复，以恢复抗原活性。
3.抗体孵育：将切片与第一抗体共同孵育，特异性结合抗原与抗体。
4.染色：加入显色剂，使结合的抗体显色。
5.洗涤：去除未结合的抗体和多余的显色剂，以便进行下一步操作。
6.复染：用苏木精或其他染料对细胞核进行复染，使细胞结构清晰。
7.评分：根据染色强度、阳性细胞比例和染色均匀性对免疫组化染色结果进行评分。
三、评分标准及注意事项1.评分标准：通常采用4级评分法，即0分为无染色，1分为弱染色，2分为中等染色，3分为强染色。
2.注意事项：a.抗原修复过程中，要根据组织类型和实验目的选择合适的修复方法。
b.抗体孵育时，应确保抗体浓度、孵育时间和温度等条件适宜。
c.染色过程中，要控制显色时间，避免过度染色或染色不均。
d.评分时应充分考虑染色强度、阳性细胞比例和染色均匀性三个方面的因素。
四、免疫组化染色评分在临床实践中的应用免疫组化染色评分方法在临床实践中具有重要意义，如评估肿瘤患者的病情、监测治疗效果和预测疾病预后等。
Mayer'苏木素染液(免疫组化)使用说明及注意事项
Mayer'苏木素染液(免疫组化)使用说明及注意事项
货号：G1080
规格：10mL/100mL
保存：室温避光保存，有效期至少一年。
产品简介：
Mayer'苏木素染液(免疫组化)适合免疫组化中组织切片的复染，染色后细胞核呈蓝色。
本产品为工作液，可直接使用。
染色液可重复使用多次，但染色效果会逐渐降低。
使用方法：
1、免疫组化显色后，将组织切片浸入苏木素染色液，也可以直接滴加到样本上染色
5-10分钟(深染)，或0.5-2分钟（浅染）。
2、浸自来水中冲洗去除多余的染色液。
3、颜色过深可以在分化液（1%盐酸）中分化几秒钟，再用氨水(0.25%)或PBS(pH7.4)
冲洗返蓝，镜下观察结果。
4、染色、分化、返蓝时间都需要预实验优化至最佳，分化和返蓝步骤可选。
5、根据显色液的种类，用水性封片剂直接封片或梯度酒精脱水，二甲苯透明后用中性
树胶封片。
注意事项：
1、第一次使用本试剂盒时建议先取1-2个样品做预实验。
2、室温避光保存，2-8℃保存最佳，至少一年有效。
3、染色过程推荐浅染，通常只需能够分辨细胞核即可，颜色过深有可能影响细胞质颜色。
4、为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。
免疫组化染色（石蜡切片）操作步骤及结果分析方法（精髓版）
免疫组化染色（石蜡切片）操作步骤及结果分析方法（精髓版）免疫组化染色（石蜡切片）操作步骤及结果分析方法一、原理及应用免疫组化，简单说是用标记的抗体对组织中相应抗原进行定位、定性和部分定量的分析。
二、操作步骤：（1）将石蜡组织切片置于65°C恒温箱，烤片1h左右。
（2）脱蜡：二甲苯I 10min→二甲苯II 10min →梯度酒精（由高到低）各5min。
（3）1×PBS 洗涤3次，每次 5min。
（4）0.5% Triton X-100通透（PBS配制），目的是使抗体能够充分地进入胞内进行结合反应。
Triton X-100 可以溶解细胞膜、细胞核膜、细胞器膜上的脂质而使抗体及大分子结构的物质进入胞浆和胞核内，这样抗体就能顺利进入胞内与相应抗原结合。
当然了，如果检测的是膜抗原无需通透，忽略该步骤。
（4）抗原修复：使用柠檬酸盐缓冲液进行抗原修复，微波炉微波高火 3min，之后转成低火 15-30min。
注：福尔马林或多聚甲醛固定，会导致蛋白交联，而解交联的过程称为抗原修复。
所以冰冻切片不需要抗原修复！！抗原修复方法有多种，一般包括两大类：酶抗原修复(胰蛋白酶、胃蛋白酶、蛋白酶K) 热抗原修复(高压蒸汽法、微波法、水浴加热法)。
微波法最为常用。
（5）1×PBS 洗涤3次，每次5min。
（6）3% H2O2，室温孵育30min，目的是灭活内源性过氧化物酶。
（7）1×PBS 洗涤3次，每次5min。
（8）使用1% BSA 进行室温封闭30min，用于封闭非特异性抗原表位。
（9）根据抗体说明书使用合适浓度的特异性一抗，4°C 湿盒中静置过夜孵育。
（10）次日取出切片，室温下复温30min。
（11）1×PBS 洗涤3次，每次5min。
（12）按照免疫组化二抗试剂盒说明书操作。
（13）DAB 显色：DAB 显色液按说明书配制，使用时滴加到血管组织上，显微镜下观察并计时，待目的蛋白显色呈棕黄色时结束显色。
免疫组化染色步骤
免疫组化染色步骤：（两步法）第一天下午一、备片1、5微米厚组织涂有APES的胶片，干燥切片烤片：60℃、60-90min。
至蜡融化组织贴在玻片上。
2、二甲苯脱蜡：15minX3。
至蜡消失。
可第一缸时间较长，第二三缸较快。
需上下提洗，加快速度。
3、水化：梯度酒精水化（100%，90%，80%）入自来水。
如未洗净，则片子看上去有油腻感。
洗至看上去非常干净。
也宜上下提洗。
二、免疫组化染色1、3%双氧水封闭10-15min。
（注：现用现配，30%双氧水用蒸馏水稀释1：10）；蒸馏水洗一次，冲一下即可。
2、依据抗体说明热修复，高火每盒3min，然后低火12min。
过夜。
一些抗体比较特殊：CD68、Vimentin、S－100水化后胰酶消化15min，用TBS冲干净后，放入缓冲液中过夜；Kappa、Lambda需修复两次，即低火12min两次；第二天上午3、擦干背面及组织周围的水（注意：分清正反不要擦掉组织）；加1XTBS稀释后一抗30-50微升/张（注：一般为1：50；多抗1：100；可依据抗体说明书摸索）室温40min，TBS洗5min×3次；4、加A液（聚合物增强剂）20min，TBS洗3min×3次；5、加B液（二抗即酶标抗鼠/兔聚合物）30min，TBS洗3min×3次；6、DAB显色（A液B液15μl/1000μl，现配现用）3-10min。
7、显微镜下观察显色满意后自来水终止显色。
8、用Mayer’s苏木素复染核（新配1－2min），分化（盐酸酒精），返蓝（自来水）。
三、脱水（80%，90%，100%酒精）；透明（纯二甲苯3X5min）；封片。
免疫组化配液一、1XTBS：(5000ml，1XTris-NaCl，PH=7.6)二、修复液1、0.01M枸橼酸盐缓冲液：（1000ml，PH=6.0）配置前摇匀，配后摇匀测PH值。
2、10XTris-EDTA抗原修复液：（500ml，PH=9.0）用前稀释10倍3、Mayer’s苏木素甲液：苏木精1g，无水酒精20ml。
免疫组化操作方法、原理、步骤以及常见问题处理大总结
免疫组化操作方法、原理、步骤以及常见问题处理大总结1、方法操作不难，最大的难处是出现异常结果时如何解决？这就需要掌握免疫组化实验原理，每一步知道为什么这样做，这样你才敢大胆地改革先前的不对的方法步骤。
如抗体孵育条件主要是抗体浓度、温度、时间，这三者一般是相互成反比的（相对），其中浓度是最重要的先决条件，温度决定反应的速度、时间决定反应的量。
就拿温度来说，可以有4度、室温、37度，我推荐4度最佳，反应最温和，背景较浅；而37度反应速度较快，时间较短；室温我不太提倡，除非你每次都把环境温度控制在一定的范围，否则，尽量选择前两者。
2、免疫组化最大的优势是定位和定性。
相比于其他蛋白检测方法，免疫组化具有定性灵敏度高、定位较直接准确，是定位检测分析首选方法。
尤其对于有些因子的转位研究十分有用。
3、免疫组化结果定量分析的前提是高质量的染色切片。
免疫组化结果也能定量分析，但必须是背景染色浅而特异性染色较深的情况下，分析最为准确，这种原则可能也是我们日常审稿时判定研究结果的必备条件。
4、免疫组化实验一定要设置阳性对照和阴性对照。
阳性对照一般是用肯定表达这种抗原的切片来做；阴性对照一般是用PBS或非一抗替代一抗来进行反应，其余步骤均一致。
前者是排除方法和实验系统有无问题；后者是排除有无一抗外的非特异性染色。
5、免疫组化的应用广泛，是当前实验研究的最重要方法之一。
如今发SCI论文时，明显感觉仅靠量化的数据来发文章很难，加一些形态学数据或图片，老外十分欢迎，可能是怕你学术造假吧。
当然也不能做假阳性或假阴性结果。
6、免疫组化技术掌握与否的鉴定标准是同一切片或不同切片中不同抗原均从摸索浓度或条件而做出优良的染色切片。
我在平时带教中就发现许多研究生把我已经摸索很成熟的反应条件、浓度、方法步骤，重复运用于同一性质的切片和同一种抗体，做出来后就觉得自己已经掌握了免疫组化方法，更换一种抗体后，居然连二抗的种属来源都拿错了。
失败往往促进你去思考试验原理和过程，成功有时也加快你自傲。
做好免疫组织化学染色的几个注意点
做好免疫组织化学染色的几个注意点免疫组织化学染色是一种常用的方法，用于检测组织和细胞中的蛋白质表达。
在进行免疫组织化学染色之前，需要注意以下几个方面，以确保染色的质量和准确性。
一、样本处理样本处理是免疫组织化学染色的关键步骤之一。
前期的样本处理将直接影响后期染色的效果。
一般来说，样本处理包括取材、固定、脱水、透明化、包埋、切片等步骤。
样本应该在取材后立即进行固定以防止蛋白质的损失和蛋白质异构体的变化。
同时，固定液中的药剂成分要根据不同蛋白质的特性进行选择，不同的药剂成分固定时间也应根据蛋白质的大小和分子量来进行优化调整。
二、抗体选择抗体是免疫组织化学染色的核心。
正确选择适宜的抗体对于染色结果至关重要。
在选择抗体时，应该注意以下几点：1、抗体应具有较高的亲和力和特异性，以确保染色的敏感性和选择性。
2、抗体的来源、克隆和浓度也很重要。
来源纯度应高于90%；与生物标本的物种有较高相似度的源（例如，兔、小鼠）的单克隆抗体效果更好。
浓度不能太高，否则会导致非特异性结合。
3、对于多蛋白共存的样本，应选择不同引物或标记抗体，以避免交叉反应。
三、标记物选择标记物的选择也影响到染色的结果。
多种标记物可应用于免疫组织化学染色，如酵素标记、荧光标记和金标记等，根据实验需要选择适当的标记物进行染色。
四、染色方法的优化免疫组织化学染色的过程需要进行优化，包括抗体浓度、背景消除步骤、染色时间和条件、固定剂和诱导剂浓度选取等等。
这些步骤都需要在实验室中进行研究和优化。
其中比较关键的是控制抗体浓度，以及对于背景的消除，可进行多次亲和吸附过程，获得更好的染色结果。
总之，免疫组织化学染色是一种重要的实验技术，它能够让我们观察到细胞和组织中蛋白质的分布和存在情况。
在实际应用中，我们需要注意样本的处理、抗体和标记物的选择以及染色方法的优化等关键步骤，以获得高质量的染色结果。
免疫组化染色的注意事项
免疫组化染色方法已不是什么很难的问题，操作步骤简单也易掌握，但要染好免疫组化，其中方法的技巧将是每位操作者在实际工作中不断摸索和探讨的事，但最基本的应从以下方面加以注意：（1）去除内源酶及内源性生物素一般我们进行免疫组化标记的都是一些生物体组织，其中自身含有一定量的内源酶和内源性生物素，而免疫组化各种染色大部分是用过氧化物酶来标记抗体的，酶的作用是催化底物，使显色剂显色，而组织中的内源性酶同样也能催化底物，使其显色，这就影响免疫组化的特异性，所以在标记抗体的过氧化酶进人组织切片之前就应设法将组织内的内源性各种酶灭活，以保证免疫组化染色在特异性情况下进行。
1) 去除内源酶常用的去除内源性酶的方法是3%过氧化氢水溶液。
但在含有丰富血细胞的标本中，由于其中含有大量的具有活性的过氧化物酶，能与过氧化氢反应，出现气泡现象，易对组织结构和细胞形态产生一些不良影响，但用3%过氧化氢的方法，能够去除大部分内源性酶，即使有些血细胞在显色后也出现棕黄色反应，但由于其形态结构与组织细胞不同，也易鉴别，而且此方法比较通用易操作，但应注意过氧化氢的浓度不能过高，一般为3%一5%，时间不宜过长，最好室温10min。
2) 去除内源性生物素在正常组织细胞中也含有生物素，特别是肝、脾、肾、脑，皮肤等组织中，在应用亲和素试剂的染色中，内源性生物素易结合卵白素，形成卵白素一生物素复合物，导致假阳性，所以在采用生物素方法染色前也可以将组织切片进行0.01%卵白素溶液室温处理20min，使其结合位点饱和，以消除内源性生物素的活性。
3) 灭活碱性磷酸酶最常用的方法是将左旋咪挫(以每毫升加24mg)加入底物液中并保持pH 值为7.6~8.2，能除去大部分内源性碱性磷酸酶，对于仍能干扰染色的酸性磷酸酶可用0.05mo1/L酒石酸抑制。
（2）抑制非特异性背景着色非特异性着色最常见的情况是抗体吸附到组织切片中高度荷电的胶原和结缔组织成分上，而出现背景着色，为了防止这种现象，最好用特异性抗体来源的同种动物灭活的非免疫血清在特异性抗体之前进行处理，以封闭荷电点，不让一抗与之结合，但这种方法一般实验室很难实现，一般常见实用的血清是2%~10%羊血清或2%牛血清白蛋白在室温下作用10~30min即可，但应注意此种结合是不牢固结合，所以最好不要冲洗，倾去余液直接加一抗，对于多克隆抗体来讲，易产生背景着色，在稀释特异性抗体时可采用含1%非免疫血清的pH7.4的PBS液。
免疫组织化学染色的实验步骤及注意事项
十五、免疫组化流程
1、65℃烤片1-2h
2、从65℃烤箱中拿出切片立即放入二甲苯Ⅰ中脱蜡15min，二甲苯Ⅱ15min，无水乙醇Ⅰ5min，无水乙醇Ⅱ5min，95%乙醇5min，85%乙醇5min，75%乙醇5min。
3、自来水冲洗5min。
4、蒸馏水冲洗3遍。
5、高压修复（先将修复液煮沸后，将片子放入煮沸溶液中，将压力锅盖盖好，当气阀冒气时，开始计时2分40秒，此时将温度调至140℃）。
6、将电磁炉电源关闭，用自来水冲洗压力锅锅盖，至气阀自然落下，将锅盖打开，自然降至室温（约40min左右）。
7、PBS浸泡5min*3次。
8、3%的H2O2封闭30min。
9、蒸馏水冲泡2次。
10、PBS浸泡5min*3次。
11、加Ⅰ抗8张片子，每片80μl8*80=640μl
配700μl700μl（释液）+7μl（Ⅰ抗）
12、室温放置30min，放4℃过夜。
13、第二天拿至室温平衡30min（提前准备PBS）
14、PBS洗5min*3次
15、加Ⅱ抗 50-100μl张37℃ 30min，或室温1小时
16、PBS洗5min*3次
17、DAB显色（2min）。
18、流水中止，流水冲洗5min。
19、苏木素复染（2min），流水中止，流水冲洗5min。
20、梯度酒精脱水各5min（从无水乙醇拿出风干片子，再放入二甲苯中）。
21、二甲苯透明各15min。
22、用中性树胶封片。
盐酸酒精500ml无水乙醇+250ml蒸馏水+6ml盐酸
氨水600ml蒸馏水+2m氨水
氨水作用：返蓝。
免疫组化染色操作步骤
免疫组化染色操作步骤
1.准备染色：将需要染色的组织切片用4%-10％的甲醛溶液处理，然后放入0.2%的甲醛溶液中浸泡10-15分钟，除去水分后，用石蜡或玻璃滑片冰冻干燥后备用；
2.细胞选择：将滑片放在温度为60℃的预处理室内，经过5分钟的预处理，清除细胞的表面活性物质；
3.免疫化学染色：选择适宜的免疫染色培养液，将其放入干燥的滑片上，放入正常培养的锅炉内，温度在37℃；持续室温处理60min，以停止免疫反应；
4.洗涤：将染色滑片放入PBS洗涤3次，每次洗涤10min，使抗体与反应物完全稳定，以避免多余的洗涤对结果的干扰；
5.染色：将抗体连接到细胞上，使用应用适当的洗涤液将染色滑片淋洗；然后使用适当的染料进行染色，建议使用DAPI染色，因为其能够在高度细胞存在下染色，或者使用其他染色方法，比如无铁紫藤染色，铜绿假单胞菌染色等；
6.滤过：将染色滑片分批放在滤纸上，进行滤过，以减少染料在细胞上积累的可能性；
7.拍摄：使用荧光显微镜拍摄染色细胞，绘制免疫组化染色的结果图片，为最终研究结果的分析提供数据支持。
免疫组化操作流程及注意事项
免疫组化操作流程及注意事项免疫组化是一种常用的生物技术方法，在医学、药物研发、疾病诊断等领域有着广泛的应用。
在进行免疫组化实验时，需要遵循一定的操作流程和注意事项，以确保实验结果的准确性和可靠性。
一、实验前准备1.检查仪器和试剂：在进行实验前，需要检查使用的仪器和试剂是否正常工作，以避免实验出现错误。
2.样本处理：选择合适的样本来源，并根据实验要求进行样本处理和处理，如组织切片、蛋白抽提等操作。
3.实验区域准备：为了避免实验中的交叉污染，需要保持实验区域的清洁和干净，避免灰尘、细菌等干扰实验结果。
二、抗体处理1.抗体选择：根据实验需要选择合适的抗体，包括一抗和二抗，并进行正确的防止步骤。
2.抗体稀释：需要根据实验所需稀释抗体浓度，以确保实验中的可靠性和准确性。
3.透析：透析是为了去除抗体中的杂质和保持抗体的活性，可以使用多种透析方法，如葡萄糖、盐溶液透析等。
三、标记和显色1.标记：将选择好的一抗和二抗进行标记，例如利用荧光标记、酵素标记等。
2.显色：根据实验需要，将标记好的抗体显色，可以使用多种方法，如荧光染色、染色素染色、酶标记染色等。
四、防止步骤1.防止非特异性结合：在实验过程中需要使用防止多余的非特异性结合，如使用BSA、牛奶等进行防止。
2.防止地基自身活性：在实验中需要使用防止地基自身活性的方法，如将地基胶体蛋白进行处理。
3.防止非特异性染色：在实验中需要使用防止非特异性染色的方法，如对实验组和对照组进行多次染色。
五、实验数据分析1.图像采集：采用高清数码系统进行图像采集。
2.数据分析：使用统计软件进行实验数据的处理，进行可靠性检测、误差范围的确定、结果的图表化呈现等等。
以上就是免疫组化操作流程及注意事项的一些基本介绍，虽然操作流程较为复杂，但是只有遵循操作流程和注意事项，才能够稳定的获得实验结果并进行进一步的研究分析。
免疫组化实验注意事项
免疫组化实验注意事项
免疫组化实验注意事项如下：
1. 样本处理：确保样本的新鲜度，避免长时间的暴露在空气中，以防样本的退化。
同时，样本的切割要尽可能的薄，以便于抗体的渗透。
2. 抗体选择：选择特异性强、质量好的抗体，以保证实验结果的准确性。
同时，要注意抗体的稀释比例，过高或过低的稀释比例都可能影响实验结果。
3. 染色过程：染色过程中要保持湿润，避免干燥。
同时，要避免过度染色，以免背景过深，影响结果的观察。
4. 洗涤过程：洗涤过程要充分，以去除未结合的抗体，减少非特异性染色。
5. 对照设置：实验中应设置阳性对照和阴性对照，以验证抗体的特异性和实验操作的正确性。
6. 结果解读：结果的解读要结合实验设计、样本特点和染色结果，不能仅凭单一指标进行判断。
7. 实验记录：详细记录实验过程和结果，以便于后期的数据分析和问题追溯。
8. 实验室安全：遵守实验室安全规定，正确使用和处理化学试剂，避免可能的安全风险。
常用免疫组化染色要点
常用免疫组化染色要点1、取材对于活检或手术切除标本应在2小时内取材或固定，避免组织自溶及抗原变性等影响免疫组化结果。
取材时为避免挤压组织，尽量使用锋利刀片，并且避开坏死组织。
取有代表性的肿瘤组织。
2、固定标本用10%中性缓冲福马林固定液 (甲醛10ml + 0.01M ph7.4 PBS 90ml)固定12-18小时，不超过24小时。
有些单位采用先固定标本后取材的工作程序。
此时要注意，比较大的肿瘤应该切开固定，避免肿瘤中心部分固定不及时。
3、脱水．透明、浸蜡、包埋、切片等按照常规方法用自动脱水机脱水、透明、浸蜡。
注意温度不要超过60℃。
玻片处理：彻底清洗，烤干后1:10多聚赖氨酸涂抹玻片，风干。
组织切片厚度4-5微米。
烤片50-60℃，2-3小时以上。
常规脱蜡入水。
4、常用检测系统选择SP三步法：敏感度大于EnVision、EliVision约1-2倍，但不宜用于富含亲生物素物质的组织，尤其对肝、肾组织很容易造成非特异性着色。
EnVision、EliVision两步法：特异性强，可以避免生物素非特异性结合。
5、免疫组化步骤抗原修复高温高压pH6.0柠檬酸盐缓冲液修复，适用于绝大多数抗原。
需要用95℃热水浴EDTA（pH9.0）修复20分钟。
适合于：CD10、CD138、Bcl-6、MuM1、VEGF、CD31、CD117、CD30、Cyclin D1、TdT、ALK。
不需要修复的抗体：GST-π等。
需要胃蛋白酶消化的抗体：EGFR，EBV。
在此后整个染色过程中，切片不能干燥，否则会造成非特异着色。
pH7.4 0.01M PBS（或者TBS）缓冲液浸洗切片5分钟×3次（下同）。
室温下将切片浸入 3% H2O2溶液10分钟，以阻断内源性过氧化物酶作用（显色后红细胞如果着色，说明H2O2 浓度不够，不能抑制内源性酶）。
PBS洗后拭去组织周围多余的水分，离组织切片周围约2mm处以防渗笔圈定。
注意细节: 组织切面上水分不要过多；抗体液量适当；液体不能流离到组织外，玻片平置，等。
做好免疫组化染色的必知事项
做好免疫组化染色的必知事项来源：生物秀免疫组织化学染色法是指在抗体上结合萤光或可呈色的化学物质，利用免疫学原理中抗原和抗体间专一性的结合反应，检测细胞或组织中是否有目标抗原的存在，此方式不只可以用来测知抗原的表现量也可观察抗原所表现的位置。
只要是能够让抗体结合的物质，也就是具有抗原性的物质包括蛋白质、核酸、多糖、病原体等都可侦测。
一、为达到免疫组织化学技术的要求，组织固定越新鲜越好在免疫组化最后结果的判断时，常可见到均匀一片的似非特异性染色的现象，经多方研究认为，它是一种假性非特异性的染色。
因为肿瘤组织中含有的抗原较易发生扩散弥散，肿瘤细胞无限制的生长和生长过速，导致肿瘤中间部分组织血液供给困难，造成缺血坏死，坏死细胞中的抗原由于机体的作用，可以被均匀地散布于细胞与细胞间的间质，这是抗原发生弥散的一种方式。
另一种抗原弥散的方式就是，由于组织没有及时的固定所引起的。
离体的组织不及时固定，组织就会自溶，抗原就会扩散，这是一非常普通的常识，但要做好却是极不容易。
标本从外科切除到浸入固定液需要经过一段时间，在这段时间里，有的抗原就可以发生扩散。
虽然已浸入了固定液，但标本较大，固定液的量又不足，当然由于固定液的渗透需要时间，当渗入到组织之中时，中间的细胞已发生了变化，抗原也随着发生扩散，这种现象在产酶多的器官是比较明显的。
因此，为了达到免疫组织化学染色的要求，对于离体的组织尽量快的进行固定，有条件的应将其剖开，早取材，早固定。
二、组织脱水必须彻底干净组织块取材不能太大过厚，才能较好地完成脱水的过程。
如果取材太厚，在较短的时间内脱水不完全，将可引起一系列的问题，比如浸蜡不彻底，切片不好完成，切不完整。
由于先天不足，导致后来切片染色的脱落，造成染色的失败，或者由此反复操作，造成人力物力的浪费，造成病理报告的延期发出等。
因此，对取材的要求是除了要求要有艺术性外，即平整、外观好看，还要求适中。
三、切片必须完整、均匀、平展、无皱折应用于免疫组织化学染色的切片，对切片的质量要求较高，切片必须完整，平展、无汽泡，无皱折，这样有利于染色时的冲洗，有利于切片的牢固附贴。
免疫组化技术及注意事项
免疫荧光染色法常用的有直接法和间接法
延髓A2区中Fos和TH荧光染色
大 脑 神 经 干 细 胞
亲和组织化学法
是以一种物质对某种组织成分具有高度亲合力 为基础。
这种方法敏感性更高，有利于微量抗原(抗体) 在细胞或亚细胞水平的定位。
常用的有：亲和素-生物素-过氧化物酶复合物 技术 (ABC法)、链亲和素-生物素-过氧化物酶
抗体的实际使用范围：IHC-P, IHC-Fr, ICC, IF, IP, WB, E
特异性，交叉反应 一抗、二抗都能找到对应动物源后再订购
索取抗体
一般已发表文献中描述的抗体，只需向作者礼 貌地提出申请均能获得，只有当多抗已用尽或 供应非常短缺，作者才会婉转拒绝。
制备抗体 多克隆抗体的制备 多克隆抗肽的抗血清是用天然蛋白抗原或肽 -载体蛋白偶联物作为抗原来制备得来的。 可应用肌肉注射和皮下组织注射免疫法制备 抗血清，然后用亲和层析法进行特异性抗体 纯化 制备抗肽抗体的流程图
脑立体定位 冰冻切片
减少冰晶:速冻或20~30%蔗糖溶液4 ℃脱水 防止切片脱落：清洗载玻片，粘附剂处理
脑切片染色：中性红、焦油紫、苏木精等
中 性 红 染 色 的 大 鼠 脑 切 片
2.2 免疫组化的方法
贴片法： 孵育盒放平，防止切片干涸
漂片法：轻摇小瓶或培养板，使切片充分接触抗 体，冲洗充分
2.3 抗体最佳稀释度确定
直接测定法：用已知阳性抗原切片进行免疫染色，标 准是该浓度可使抗原特异且明显染色但背景无染色
一抗稀释度 1:100 1:500 1:1000 1:2000 1:3000
阴性对照
特异性染色 ++++ ++++ ++++ +++ ++ (-)
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免疫组化染色的操作技巧和注意事项
【摘要】目的本院对免疫组化染色过程中存在的问题及对策进行深入的探讨以及仔细的分析。
方法自从2010 年6 月~2011 年7 月期间, 本院共收治免疫组化染色标本患者有200 例, 对其中存在问题的60例患者标本进行了仔细的分析, 并且要提出科学的应对措施。
结果本院对疫组化染色过程提出了主要的积极应对措施和科学的建议。
结论对于每一个步骤以及环节, 都会影响到染色的最终后果, 对此, 要尽量避免在染色过程中会出现一些问题, 会使免疫组化染色的质量有所提高。
【关键词】免疫组化；技术方法；质量控制；抗原修复；原因分析对于免疫组化(IHC) 技术在上世纪的80 年代之后, 在我国就迅速的开展, 至今已经有20 年快速发展的历程, 现在已经逐渐的成为病理科工作中主要的组成要素。
综合性操作技术主要是导致免疫组化, 这样会使其反应步骤增加, 出现复杂的影响因素, 技术员在基础技术上的操作要求是相对较高的, 对免疫组织学习要进行不断的提高, 了解这种技术在病理诊断方面是主要的辅助方式, 在对疾病诊断、分析、预后以及指导临床个体化治疗等方面, 都有着主要的作用。
在免疫组化的技术方面, 也存在着各种实质性的问题, 收治免疫组化染色标本200 例, 其中有60 例标本存在着问题, 本院对其进行仔细的分析, 并且提出相应的科学对策治疗方式。
1 免疫组化染色不理想的原因分析及改进措施
1. 1 由于大分子的化学结构相对稳定, 它在水中呈现胶状体, 不易被机体破坏或排除, 这样在体内存留时间就很长, 有利于持续刺激淋巴细胞。
抗体是人体抵抗感染的一种重要武器, 抗体是人或动物受抗原物质刺激后, 由浆细胞合成和分泌的一种特异性蛋白质, 并具有疏水性, 因此当对抗体进行稀释时可降低它的疏水性, 当pH 接近抗体的等电点时, 抗体的疏水性能十分巨大。
1. 2 抗体与抗原的交叉反应抗原是一类能诱导免疫系统发生免疫应答, 并能与免疫应答的产物发生特异性结合的物质；抗体是人或动物受抗原物质刺激后, 由浆细胞合成和分泌的一种特异性蛋白质。
组织中其它蛋白质存在相同的抗原, 就能与抗体直接产生反应, 会有其它反应, 临床由于多克隆抗体适应性强, 极容易有交叉反应单克隆抗体也能产生交叉反应, 所以对克隆抗体的应用必须谨慎, 使交叉反应降到最低。
1. 3 抗原修复不足对于固定的组织, 会导致抗原之间有相交的联系, 是抗原决定簇被封闭, 对此, 要尽早的对抗原进行有效的修复。
应根据需要进行选择在修复时所用
的方式, 通常可以使用酶消化修复以及热修复等方式。
在使用微波修复还是高压高温进行修复, 热修复都能达到有效的修复作为实验的科学依据。
1. 4 组织固定不恰当当试验的组织固定的位置是否正确时对试验结果有很大影响, 它的好与坏与抗原的保存有直接关系；当固定不及时会出现组织自行溶解或者干硬变形, 一旦出现自溶就会造成抗原丢失, 而干硬就是蛋白质变性的结果, 就会出现大量抗原性功能消失, 极易脱色即便染上也会是棕色的, 所以对体积的要求就更严格了。
2IHC 过程及注意事项
2. 1组织准备对于IHC 先决条件是进行良好的组织处理组织固定要确保能够做到最好, 包括对保存细胞以及组织的形态的结构, 并且在最大限度方面, 能够保存其抗原的免疫活性值。
这样, 在组织和固定反方面必须进行即时、必要处理。
2. 2 蜡块选择与切片质量对于脱水和包埋质量好的蜡块在选择上, 能够充分的保证蜡膜的完整、均匀程度。
通常, 切片的厚度要确保在3卩m之内，对于出现过厚的切片会导致与载玻片的粘附性不牢固, 对于乳腺组织是人体中脂肪含量最多的部位之一, 在高温和高压的修复处理作用时, 容易产生脱片现象［1］。
2. 3 抗原修复在整个修复的过程中, 逐渐的减弱多聚
赖氨酸分子和组织切片之间的有效结合力, 这样, 修复是免疫组化最常出现的脱片现象。
对于适当将修复
液是非常重要的可以选择相对比较温和药物, 比如是
枸橼酸修复液等。
2. 4 染色中应注意的一些细节把孵育盒放置在一个比较平稳的地方, 不要使抗体液流到组织的另一侧, 这会使结果呈现假阴性反应；另外抗体孵育盒里面要留有适量的蒸馏水但水不宜过多, 防止因水蒸汽在盒盖聚成水滴, 掉落在切片上, 造成抗体稀释；再有就是保持切片在整个染色过程中, 一定要保持湿润, 不要出现干片的现象。
最后在加入抗体的时候, 要把组织上的水弄干, 避免抗体稀释影响检测结果。
3 结果对于免疫组化染色过程, 提出了主要的应对措施以及科学合理的建议。
4 讨论因为人体的抗体和抗原之间的结合具有高度的特异性而免疫组织化学正是通过这种原理。
它先将组织或细胞中的某种化学物质提取出来, 以此作为抗原或半抗原, 并通过免疫动物后获得特异性的抗体, 在用抗体去检测组织或细胞中的同类的抗原物质。
由于免疫组化技术是一个貌似单一的技术, 但其中千变万化的环节却很难掌握。
只有在关键的地方达到标准化, 才能取得较好好的检测结果。
现在科技更新较快, 结合大量的临床先进经验要求医护人员熟练的掌握操作技能, 只有认真的规范和严格遵守各项标
准, 才能让免疫组化技术在临床发挥更完善、更彻底、更好的为患者治疗。
参考文献
[1] 李德本, 王涛, 姜骏.免疫组化染色的操作技巧和注意事项.临床与实验病理学杂志, 2011, 27(11):1260-1261.
[收稿日期：2014-04-01 ]。