自制质控品在实时荧光法HBV-DNA定量室内质控中的应用

自制质控品在实时荧光法HBV-DNA定量室内质控中的应用

发表时间：2014-06-10T14:12:04.890Z 来源：《中外健康文摘》2013年第51期供稿作者：尚小云

[导读] 仪器设备：德国凯杰Rotor-GeneQ实时荧光定量PCR分析仪。高速低温离心机，恒温金属浴，振荡器和加样枪等。尚小云(辽宁省抚顺中心医院检验科 113006)

【摘要】目的研究实时荧光定量(RT-PCR)检测乙肝病毒核酸(HBV—DNA)时，自制质控品的扩增循环阈值(CT)作为靶值在室内质控中应用的可行性。方法留取已知HBV—DNA浓度的患者血清和甲、乙、丙、戊肝和HIV血清学标志物全阴性的患者血清，通过一定比例稀释得到预期浓度的质控物，分装并-70℃保存。分别计算出靶值，标准差和变异系数(OCV％、RCV％)，以CT值在±2S为质控警告线±3S为质控失控线，绘制Levey—Jennings质控图。分析结果质控物最佳条件下的、S和OCV分别为27.5、0.65和2.36％；常规条件下的、S和RCV 分别为28.7、0.73和2.54％。RCV值<2 OCV值，此RCV可以接受。结论自制质控品的CT值作为靶值应用于RT-PCR法HB—VDNA定量的室内质控中，制图方便，结果准确可靠，可以推广。

【关键词】HBV-DNA 扩增循环阈值室内质控

【中图分类号】R446 【文献标识码】A 【文章编号】1672-5085（2013）51-0159-02 实时荧光定量PCR具有特异性强，能有效解决PCR产物污染、自动化程度高等特点。在临床PCR检验中，通常使用质控样本扩增后的“拷贝数／ml”或“U／ml”来进行质控数据的统计分析[1]，但应用起来很不方便，本研究试用自制血清质控品的扩增循环阈值(CT)绘制质控图，研究其在HBV-DNA检测室内质控中的应用价值。

1 材料和方法

1.1材料

1.1.1质控品来源：质控血清来自抚顺市中心医院门诊和住院患者血清，经乙肝五项和甲、丙、戊肝血清学标志物全阴性的患者血清20人份；已知HBV-DNA检测结果为5.67×106IU／ml的血清样本一份。以上血清均无肉眼可见的脂血、溶血和黄疸，将其进行56℃30min灭活处理。

1.1.2仪器设备：德国凯杰Rotor-GeneQ实时荧光定量PCR分析仪。高速低温离心机，恒温金属浴，振荡器和加样枪等。

1.1.3试剂来源：HBV—DNA提取和扩增试剂盒来自凯杰生物技术有限公司。

1.2 方法

1.2.1质控品制备：已知HBV-DNA检测结果为5.67×106IU／ml的血清样本200μL与肝炎血清学标志物全阴性的患者血清19.8ml充分混合，检测预期浓度在5.00×104IU／ml左右。

1.2.2质控品分装：为保证质控品均一性，要将其充分混匀。制备和分装所有操作均在生物安全柜内进行。

1.2.3质控品的检测

1．2．3．1最佳条件下的变异(OCV)：在仪器和试剂均为最佳状态下，由操作熟练的有多年PCR工作经验的技术人员进行操作，连续测定1．2．2中的质控品20次，得到一组CT值数据，经计算可得到其均值(?)、标准差(S)和变异系数(CV)，此变异系数即为OCV。1．2．3．2常规条件下的变异(RCV)：在仪器和试剂均为通常状态下，由经过培训的普通技术人员进行操作，连续测定1．2．2中的质控品20次，得到一组CT值数据，经计算可得到其均值(?)、标准差(S)和变异系数(CV)，此变异系数即为RCV。

1.2.4质控图绘制：以CT值在±2S为质控警告线，±3S为质控失控线，自动得到Levey—Jennings质控图，分析结果。

2 结果

2.1准确性评价：

每批次实验同时做空白对照、阴性对照和弱阳性对照和各一份，标准品4份，分别为107，106，105，104 IU／ml。实验结果空白对照和阴性对照均为阴性结果，弱阳性对照在试剂说明书可接受范围内，标准品呈线性关系(R2>0.98)。表明每次实验均在控。

2.2最佳条件下变异(OCV)与常规条件下变异(RCV)结果：

RCV值与OCV值比较接近，两组均数t检验差异无统计学意义(P>0.05)。并且RCV值<2 OCV值，因此RCV可接受，见表l。

3 讨论

表l 最佳变异与常规变异结果对比

3.1近影响临床基因扩增实验室室内质控的因素很多[2]，本文仅就采用RT-PCR方法进行HBV—DNA定量的室内质控物的制备及质控曲线的绘制进行分析和阐述。

3.2考虑到试剂厂家提供的质控品成本较高，自制血清质控品具有如下优点：A.基质与检测标本一致。B.可单批大量获得。C.有良好的稳定性。D.自定义质控浓度。E.无已知的生物传染危险性。以上符合用于临床PCR实验室内质控理想的质控品应具备的条件[3]。

3.3在实时荧光定量PCR过程中，获得的病毒母数据都很大，通常用对数值做质控分析，较为繁琐。CT值是指每个反应管荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数，与模板起始拷贝数的对数存在线性关系[4]，可以代替定量结果的对数作为质控数据使用，每次实验可直接将获得的质控品CT值录入东软LIS质控管理系统中，分析是否在空。避免了繁琐的数据换算，简单易行，并且结果准确可信，值得推广。

参考文献

[1] 叶应妩，王毓三，申子瑜．全国临床检验操作规程[M]．3版．南京：东南大学出版社．2006：939．

[2]李金明．临床实验室分子诊断的标准化[J]．中华检验医学杂志，2006，29(6)：483—486．

[3]李金明．实时荧光PCR技术[M]．北京：人民军医出版社，2007：148—150．

[4]陈连康，王德明，顾丽华，等．PCR扩增循环数与低拷贝模板DNA的STR分型[J]．中国法医学杂志。2004，20(3)：149-150．