辣根过氧化物酶分光光度法测定 黄嘌呤氧化酶的活性
辣根过氧化物酶活性检测方法研究
辣根过氧化物酶活性检测方法研究张挺;何智敏;钟瑞敏;张世伟【期刊名称】《广州城市职业学院学报》【年(卷),期】2017(011)003【摘要】通过单因素实验和正交实验研究了辣根过氧化酶(HRP)活性测定条件:缓冲溶液种类、缓冲溶液离子浓度、pH值、温度对其影响.实验结果表明在25℃下,0.1mol/L,pH=7.0的磷酸盐缓冲溶液中反应,辣根过氧化物酶的酶活力达到最大值1.13×107 U/g;确定辣根过氧化物酶活性的最佳检测方法:1mg HRP溶解于1mL 0.1mol/L磷酸盐缓冲溶液(pH=7.0),反应温度为25℃,检测波长为436nm.该方法简单可靠,操作简便,可有效应用于实验室和常规生化检测.【总页数】4页(P73-76)【作者】张挺;何智敏;钟瑞敏;张世伟【作者单位】广州城市职业学院食品系,广东广州510405;韶关学院英东食品科学与工程学院,广东韶关512005;韶关学院英东食品科学与工程学院,广东韶关512005;深圳市计量质量检测研究院,广东深圳518055【正文语种】中文【中图分类】O657.32【相关文献】1.催化分光光度法测定辣根过氧化物酶新方法研究 [J], 魏永锋;阎宏涛2.基于多指标抗炎活性检测的注射用血塞通生物评价方法研究 [J], 马湘炜;蒋淑敏;赵筱萍3.季胺-辣根过氧化物酶-过氧化氢显色新体系及其在酶活性检测中的应用 [J], 李建国;刘颖;鞠熀先4.基于表面增强拉曼光谱的碱性磷酸酶活性检测方法研究 [J], 江蕾; 甘振飞; 陈华英; 常帅; 李家宾; 李大伟5.基于Ce-BDC的氧化物酶活性检测果汁中抗坏血酸的比色方法研究 [J], 杨阳;刘光勤;杨思龙;艾雪莲;梁秋红;罗林频;汪蓉;王建龙;张文涛因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
过氧化物酶、过氧化氢酶活性测定方法及试剂配制
过氧化物酶（POD ）活性测定【实验原理】过氧化物酶广泛分布于植物的各个组织器官中，在有H 202存在条件下，过氧化物酶能使愈创木酚氧化，生成茶褐色的4-邻甲氧基苯酚，可用分光光度计测生成物的含量来测定活性。
【实验试剂】 愈创木酚、30%过氧化氢、20mmol/LKH2PO4、100mmol/L 磷酸缓冲液（pH6.0）、反应混合液[100mmol/L 磷酸缓冲液（Ph6.0）50mL ，加入愈创木酚28uL,加热搅拌，直至愈创木酚溶解，待溶液溶解冷却后，加入30%过氧化氢19uL ，混合均匀保存在冰箱中]【方法步骤】（1）、粗酶液的提取 称取小麦叶片0.25g ，加20mmol/LKH2PO4 2.5mL ，于研钵中研成匀浆，以4000r/min 离心10分钟，收集上清液保存在冷处，所得残渣再用20mmol/LKH2PO4 2.5mL 提取一次，全并两次上清液，所得的即为粗酶提取液(酶活性过高，稀释10倍)。
（2）、酶活性的测定 取试管3只，于一只中加入反应混合液3mL ，KH2PO41mL ，作为校零对照，另外三只中加入反应混合液3mL ，稀释后的酶液1mL （如表1），立即开启秒表，于分光光度计470nm 波长下测量OD 值，每隔1min 读数一次（4min ）。
以每分钟表示酶活性大小，将每分钟OD 值增加0.01定义为一个活力单位。
表1 紫外吸收法测定POD 酶活性配置表4.结果计算以每分钟吸光度变化值表示酶活性大小，即以 ΔA 470 /[min · g （鲜重） ]表示之。
也可以用每 min内 A 470 变化 0.01 为 1 个过氧化物酶活性单位（ u ）表示。
POD 总活性[u/g(FW)]=式中：POD 总活性以酶单位每克鲜重表示。
其中 △470=ACK-AE比活力单位以酶单位每毫克蛋白表示。
ACK ——照光对照管的吸光度。
AE ——样品管的吸光度。
Vt ——样品液总体积，mL 。
辣根过氧化酶的表达和酶活性测定
辣根过氧化酶的表达和酶活性测定辣根(Garden radish)是一种食用根菜，辣根中含有大量的过氧化酶(peroxidase)，这种酶可以催化物质的氧化还原反应，具有重要的生物学意义和应用价值。
本文将介绍辣根过氧化酶的表达和酶活性测定。
一、植物基因工程的原理和方法植物基因工程是将外源基因导入植物体内，使其表达所需的蛋白质，以达到改良植物性状和提高产量等目的。
主要方法包括以下几个步骤：1.选择载体：通常采用质粒作为载体，其优点是易于操作、成功率高、适用于多种植物等；缺点是获得的转基因植物往往存在多个拷贝数、位置不固定等问题。
2.克隆外源基因：从外源来源中克隆所需要的基因，通常采用PCR或酶切法进行操作。
3.构建基因转化载体：将外源基因与载体进行连接，构建基因转化载体。
4.基因转化：将构建好的基因转化载体通过农杆菌或基因枪等方法导入植物细胞，使其被转化。
经过选育和筛选后，可以选择对应的转化植株进行表达和性状分析。
二、辣根过氧化酶的表达过氧化酶是一种重要的生物催化剂，广泛存在于植物、动物和微生物等生物体内。
辣根中的过氧化酶具有比较高的催化活性，因此对于其表达成为了许多研究的重要方向。
下面就介绍几种常用的表达方法。
1. 转基因植物表达法通过外源基因的转入，使植物细胞内部合成所需的蛋白质。
相比细胞培养和分离提取等方式，这种方法更具有稳定性和可控性。
2. 细胞培养和分离提取法采用感光荧光素光反应，测定培养细胞或组织提取物中的过氧化物酶活性，以此测定过氧化酶的表达。
3. 重组工程菌表达法将辣根过氧化酶基因克隆到大肠杆菌等可表达目的蛋白质的菌株中，使其高效表达，从而为进行治疗和检测等方面提供重要基础。
三、辣根过氧化酶的酶活性测定方法1. 常规方法-光度法光度法是一种基于酶催化产物的吸光度变化的测定方法。
常用的基质是苯酚，产生硫酸化产物。
方法简单，测量结果准确，但是缺点是需要消耗大量的试剂和设备。
此外，在测定过程中也可能出现误差。
辣根过氧化物酶分光光度法测定 黄嘌呤氧化酶的活性
辣根过氧化物酶分光光度法测定黄嘌呤氧化酶的活性李忠琴1 许小平2 杨海麟1 王武#11（江南大学工业生物技术教育部重点实验室，无锡214036） 2（福州大学化学化工学院，福州350002）摘 要 研究了以辣根过氧化物酶-苯酚-4-氨基安替比林反应显色新体系，检测黄嘌呤氧化酶（XOD ）活力的新方法。
确定该酶活性测定的最佳条件为：辣根过氧化物酶（HRP ）7000U /L ，4-氨基安替比林（AAP ）1mmol /L ，苯酚（PA ）6mmol /L ，黄嘌呤（XAN ）1mmol /L 溶于50mmol /L Tris-CL 缓冲液（pH 8.4）；反应温度为37℃，保温时间为20min ；检测波长为508nm 。
本方法测定XOD 酶活的线性范围为5.0～100.0U /L ，线性关系良好（r =0.9992），检出限为1.3U /L 。
该方法操作简单易行，测定结果准确可靠。
可有效应用于普通实验室和临床常规生化检测。
关键词 黄嘌呤氧化酶，辣根过氧化物酶，酶的活力测定，分光光度法2005-08-30收稿；2005-12-05接受本文系福建省自然科学基金（No.C0410006）和工业生物技术教育部重点实验室基金（No.KLIB-KF200502）资助项目1 引 言黄嘌呤氧化酶（xanthine oxidase ，XOD ，EC 1. 2. 3.22）是一种钼羟类胞质缀合酶。
主要用于痛风、心肌梗塞和细胞损伤后次黄嘌呤和黄嘌呤水平的检测［1～3］。
目前测定黄嘌呤氧化酶活力主要采用NBT /MTS-PMS 比色法、紫外分光光度法、电化学法及放射化学法［4～8］等方法。
但比色法形成的显色物溶解度低，PMS 对XOD 活性有一定的抑制，且NBT 、MTS 和PMS 试剂昂贵。
紫外分光光度法中黄嘌呤和尿酸的紫外吸收波长较接近，直接进行紫外检测，干扰严重。
其余两种方法操作繁琐，仪器设备要求高而难于推广。
本实验根据辣根过氧化物酶（horseradish peroxidase ，HRP ）［9］和黄嘌呤氧化酶的反应特性，提出了用XOD 偶联辣根过氧化物酶，直接测定黄嘌呤氧化酶活力的新方法。
抗氧化酶活性测定方法
抗氧化酶活性测定方法抗氧化酶是一类对抗氧化反应具有重要作用的酶。
其主要功能是清除体内的自由基，抑制过氧化物形成和脂质氧化反应，从而保护细胞免受氧化应激的伤害。
测定抗氧化酶活性有助于评估生物体内的氧化应激水平，为疾病的诊断和治疗提供重要的指导。
本文将介绍几种常见的抗氧化酶活性测定方法。
1.超氧化物歧化酶（SOD）活性测定方法：SOD能够催化超氧阴离子（O2-）的还原反应，将其转化为较为稳定的氧气和过氧化氢。
常见的SOD活性测定方法有：-标准醛缩法：根据SOD催化的还原反应，利用NBT（硝基蓝盐）和醛缩剂的变色反应来测定SOD活性。
-自动化测定法：利用包含其中一种还原物质和pH染料的较为稳定的底物，通过测定底物的氧化程度来确定SOD活性。
-XTT法和WST-1法：由于SOD具有还原型的性质，可以通过测定细胞培养基中的还原型琼脂糖（XTT）或水溶性四硝基噻唑盐（WST-1）的还原动力学来测定其活性。
2.过氧化氢酶（CAT）活性测定方法：CAT主要参与还原过氧化氢（H2O2），将其转化为氧和水。
常见的CAT活性测定方法有：-色素法：利用黄曲霉素作为还原剂，观察黄曲霉素的消费量来测定CAT活性。
-光度法：通过测定样品中H2O2浓度的下降程度来间接测定CAT活性。
-氧化还原电极法：通过测定样品中H2O2浓度的下降速度来测定CAT活性。
3.过氧化物酶（POD）活性测定方法：POD主要参与氧气与还原型供体之间的氧化还原反应，转化为过氧化物（ROO-）。
常见的POD活性测定方法有：-色谱法：利用酚类底物的氧化反应，测定产生的醌类产物的含量来测定POD活性。
-酶标法：POD催化氧化反应会形成有色产物，通过测定产物的吸光度来测定POD活性。
4.谷胱甘肽过氧化物酶（GPx）活性测定方法：GPx主要参与还原过氧化物，将其转化为相对稳定的醇和水。
常见的GPx活性测定方法有：-碳酸盐法：根据GPx还原底物中的碳酸盐，观察样品溶液pH值的变化来测定GPx活性。
抗氧化酶活性测定方法
抗氧化酶活性测定方法抗氧化酶是一类能够帮助生物体减轻或消除自由基对细胞和组织的损伤的酶。
其中三个主要的抗氧化酶分别是超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)和过氧化氢酶(CAT)。
测定这些抗氧化酶的活性可以帮助我们了解细胞和组织内抗氧化能力的变化，从而评估对抗氧化应激的能力。
以下是常用的测定这些抗氧化酶活性的方法。
1.NBT法：超氧化物歧化酶能够催化过氧化脱氢麦角酮（NBT）被还原成紫色水溶性产物，通过测定产物的吸光度来确定SOD的活性。
具体步骤如下：（1）准备反应体系：称取适量的细胞提取液，加入适量的NBT缓冲液。
（2）开始反应：置于适当的温度和时间下。
（3）停止反应：加入硝酸，停止NBT的还原反应。
（4）测定吸光度：使用分光光度计测量产生的相对吸光度。
2.氰化硝酸法：该方法是通过抑制SOD对自由基的清除作用，使过氧化物离子被产生，进而通过测定过氧化物离子的吸光度来间接测定SOD的活性。
具体步骤如下：（1）准备反应体系：称取适量的细胞提取液，加入适量的氰化钾和亚硝酸钠。
（2）开始反应：加入适量的氧化剂，使之和SOD反应生成过氧化物。
（3）测定吸光度：使用分光光度计测量过氧化物离子产生的相对吸光度。
1.亚硫酸盐法：过氧化物酶能够催化亚硫酸盐氧化成差二价铁离子，通过差二价铁离子与硫酸铵生成蓝色络合物来测定POD的活性。
具体步骤如下：（1）准备反应体系：称取适量的细胞提取液，加入适量的亚硫酸铵和硫酸。
（2）开始反应：加入适量的H2O2，使之和POD反应生成差二价铁离子。
（3）停止反应：加入硫酸铵，停止POD对H2O2的催化作用。
（4）测定吸光度：使用分光光度计测量产生的相对吸光度。
2.过氧化氢法：过氧化物酶能够催化过氧化氢分解成氧气和水，通过测定生成的O2的相对浓度来测定POD的活性。
具体步骤如下：（1）准备反应体系：称取适量的细胞提取液，加入适量的过氧化氢。
（2）开始反应：加入过氧化物酶，使之和过氧化氢反应。
一种检测鱼中次黄嘌呤含量的方法[发明专利]
![一种检测鱼中次黄嘌呤含量的方法[发明专利]](https://img.taocdn.com/s3/m/cf5bb17ee418964bcf84b9d528ea81c758f52ebc.png)
(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201710011208.7(22)申请日 2017.01.06(71)申请人 北京物资学院地址 101149 北京市通州区富河大街1号(72)发明人 陈静 沈丽 王超 (51)Int.Cl.G01N 21/33(2006.01)G01N 1/34(2006.01)(54)发明名称一种检测鱼中次黄嘌呤含量的方法(57)摘要本发明公开了一种检测鱼中次黄嘌呤含量的方法，涉及一种次黄嘌呤的检测方法。
本发明的方法简单，完成速度快，设计合理，准确度高，数据参考性强，操作容易，无须特制实验仪器，即使用现有检测仪器就能达到检测目的，有利于大面积推广和使用。
本发明方法是取鱼肉制样品液，用辣根过氧化物酶和黄嘌呤氧化酶偶联催化样品液后用紫外分光光度计进行检测获取次黄嘌呤的含量。
本发明用于判断鱼的新鲜度。
权利要求书1页 说明书6页CN 106855508 A 2017.06.16C N 106855508A1.一种检测鱼中次黄嘌呤含量的方法，其特征在于该检测方法是按下述步骤进行的：步骤一、取鱼肉研磨至泥状，离心取上清液，用过滤膜过滤后去除沉淀蛋白；步骤二、然后离心取上清液，用辣根过氧化物酶和黄嘌呤氧化酶偶联催化，再用紫外分光光度计进行检测获取次黄嘌呤的含量。
2.根据权利要求1所述一种检测鱼中次黄嘌呤含量的方法，其特征在于步骤一中取5g 鱼肉研磨。
3.根据权利要求2所述一种检测鱼中次黄嘌呤含量的方法，其特征在于步骤一中所述去除沉淀蛋白是按下述步骤制备的：向用过滤膜过滤的滤液中加入0.1mL 10％(质量)三氯醋酸，搅拌混匀。
4.根据权利要求3所述一种检测鱼中次黄嘌呤含量的方法，其特征在于步骤二中偶联催化是：向上清液中依次加入3mL的苯酚、3mL 4-氨基安替比林、3mL Tris-HCL缓冲液、3mL 叠氮钠和3mL辣根过氧化物酶，加100μL黄嘌呤氧化酶和10mL样品液，置于37℃的恒温水浴锅内保温8min，然后煮沸2min后加入1mL浓度为71.389mg/mL的Na 2CO 3溶液，放入冰水中冷却，用紫外分光光度计测量。
过氧化物酶、过氧化氢酶活性测定方法及试剂配制
过氧化物酶（POD）活性测定【实验原理】过氧化物酶广泛分布于植物的各个组织器官中，在有H202存在条件下，过氧化物酶能使愈创木酚氧化，生成茶褐色的4-邻甲氧基苯酚，可用分光光度计测生成物的含量来测定活性。
【实验试剂】愈创木酚、30%过氧化氢、20mmol/LKH2PO4、100mmol/L磷酸缓冲液（pH6.0）、反应混合液[100mmol/L 磷酸缓冲液（Ph6.0）50mL，加入愈创木酚28uL,加热搅拌，直至愈创木酚溶解，待溶液溶解冷却后，加入30%过氧化氢19uL，混合均匀保存在冰箱中]【方法步骤】（1）、粗酶液的提取称取小麦叶片0.25g，加20mmol/LKH2PO4 2.5mL，于研钵中研成匀浆，以4000r/min离心10分钟，收集上清液保存在冷处，所得残渣再用20mmol/LKH2PO4 2.5mL提取一次，全并两次上清液，所得的即为粗酶提取液(酶活性过高，稀释10倍)。
（2）、酶活性的测定取试管3只，于一只中加入反应混合液3mL，KH2PO41mL，作为校零对照，另外三只中加入反应混合液3mL，稀释后的酶液1mL（如表1），立即开启秒表，于分光光度计470nm波长下测量OD值，每隔1min读数一次（4min）。
以每分钟表示酶活性大小，将每分钟OD值增加0.01定义为一个活力单位。
表1 紫外吸收法测定POD酶活性配置表管号S0（对照）S1（实验）S2（实验）反应混合液(ml) 3.0 3.0 3.0KH2PO4 (ml) 1.00.00.0酶液 (ml)0.0 1.0 1.04.结果计算以每分钟吸光度变化值表示酶活性大小，即以ΔA 470 /[min · g （鲜重） ]表示之。
也可以用每min 内 A 470 变化 0.01 为 1 个过氧化物酶活性单位（ u ）表示。
POD总活性[u/g(FW)]=FWtV.VA T⨯⨯⨯⨯147001∆式中：POD总活性以酶单位每克鲜重表示。
超氧化物歧化酶测定方法 黄嘌呤氧化酶
超氧化物歧化酶测定方法黄嘌呤氧化酶摘要：一、引言二、超氧化物歧化酶简介1.定义与作用2.分布与生理功能三、黄嘌呤氧化酶简介1.定义与作用2.与超氧化物歧化酶的关系四、超氧化物歧化酶测定方法1.比色法2.化学发光法3.酶联免疫吸附法五、黄嘌呤氧化酶测定方法1.比色法2.酶联免疫吸附法3.高效液相色谱法六、应用与意义1.在疾病诊断中的应用2.在科研与生产中的应用七、总结正文：一、引言超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase，SOD）和黄嘌呤氧化酶（Xanthine oxidase，XOD）是生物体内重要的氧化还原酶，它们的活性测定在生物学、医学和工业领域具有重要的意义。
本文将介绍这两种酶的测定方法及其应用。
二、超氧化物歧化酶简介1.定义与作用超氧化物歧化酶是一种抗氧化酶，主要作用是清除生物体内产生的超氧阴离子自由基，保护细胞免受氧化损伤。
2.分布与生理功能超氧化物歧化酶广泛分布于动植物细胞、微生物和人体内，具有重要的生理功能，包括抑制脂质过氧化、维护细胞膜稳定性、抗衰老等。
三、黄嘌呤氧化酶简介1.定义与作用黄嘌呤氧化酶是一种存在于细胞胞液和线粒体的酶，主要作用是将黄嘌呤氧化为尿酸，参与嘌呤代谢。
2.与超氧化物歧化酶的关系黄嘌呤氧化酶和超氧化物歧化酶在生理功能上相互关联，黄嘌呤氧化酶的活性增高可能导致超氧化物歧化酶的消耗增加，从而影响生物体的抗氧化能力。
四、超氧化物歧化酶测定方法1.比色法比色法是测定超氧化物歧化酶活性的一种常用方法，通过测定反应体系中酶催化的超氧阴离子清除速率与酶活性之间的关系，从而计算出酶活性。
2.化学发光法化学发光法是一种灵敏、快速的测定超氧化物歧化酶活性的方法，通过监测酶催化反应产生的化学发光信号强度，反映酶活性。
3.酶联免疫吸附法酶联免疫吸附法是一种特异性强的测定超氧化物歧化酶活性的方法，通过抗原-抗体反应及酶标记技术，检测酶活性。
五、黄嘌呤氧化酶测定方法1.比色法比色法是测定黄嘌呤氧化酶活性的一种常用方法，通过测定反应体系中黄嘌呤氧化酶催化的黄嘌呤浓度变化，计算出酶活性。
黄嘌呤氧化酶法测定抗氧化能力
发酵过程产物形成的测定(SOD活性的测定)一、实验目的1、了解SOD活性测定的原理2、学习黄嘌呤氧化酶法测定SOD活性二、实验原理原理：黄嘌呤氧化酶催化黄嘌呤产生超氧阴离子自由基，后者氧化羟胺成亚硝酸盐，亚硝酸盐在对氨基苯磺酸与甲萘胺作用下呈现紫红色，用可见光分光光度计测其吸光度。
当被测样品中含SOD时，则对超氧阴离子自由基有专一性抑止作用，使可形成的亚硝酸盐减少，比色时测定管的吸光度值低于空白管的吸光度值，通过公式计算可求出被测样品中SOD 的活力。
操作步骤：如表2-1。
三、实验试剂硫酸盐缓冲液，盐酸羟胺，黄嘌呤，黄嘌呤氧化酶，醋酸等。
四、实验步骤试剂测定管对照管75mmol/L 磷酸盐缓冲液（pH7.8）0.55 0.55待测样品（ml）A(取样量) 00.1mol/L 盐酸羟胺溶液0.05 0.0575mmol/L 黄嘌呤溶液0.05 0.050.037U/L 黄嘌呤氧化酶0.05 0.05双蒸水0.2－A 0.2用漩涡振荡器充分混匀，置37℃恒温水浴30min。
显色剂（ml） 1 1总体积1.9ml，混匀，室温放置10min，蒸馏水调零，测A530五、计算方法计算公式：每毫升反应液中SOD 抑止率达50％时对应的SOD 量为一个SOD 活力单位（U），待测样品中的SOD 活力由下式计算：SOD抑制率（％）＝（A2-A1）/A2×100%SOD 活力（U/ml）＝（A2-A1）/A2×100%÷50％×反应体系的稀释倍数×样本测试前的稀释倍数式中：A1:测定管的吸光值；A2:空白管的吸光值六、注意事项：1.试管要洗干净，在测定微量样品时尤为重要。
2.要做空白管，并且放在所有测试管的中间做，取平均值。
常用试剂（1）诱导剂：分别配制IPTG 100μmol/mL； CuSO4·5H2O 250μm/mL； ZnSO4 100μm/mL。
平板扩散法测定黄嘌呤氧化酶的活性
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辣根过氧化物酶及其使用介绍
辣根过氧化物酶及其使用介绍酶标记物包括酶标记抗原、酶标记抗体和酶标记SPA等。
酶标记物质量的好坏直接关系到免疫酶技术的成功与否，因此被称为关键的试剂。
酶标记物中最常用的是酶标记抗体，它是将酶与特异性抗体经适当方法连接而成。
酶标记抗体的质量主要取决于纯度好、活性强及亲和力高的酶和抗体，其次要有良好的制备方法。
目前，高质量的酶(如辣根过氧化物酶，简称HRP)国内已有商品供应。
高质量的抗体则可通过提取纯化而获得。
在制备方法上，宜选用产率高、不影响结合物的活性和不混杂干扰性物质且操作简便易行的方法。
(一) 酶制剂及其底物凡无毒性又能呈现有色化学反应的酶，原则上均可作为标记用。
但作为标记抗体用的酶应满足下列要求：(1)来源方便，易于纯化；(2)比活性高，性质稳定；(3)酶活性和量能用简单方法测定。
目前在免疫酶技术中常用的酶为辣根过氧化物酶(HRP)和硷性磷酸酶(AP)，其次还有葡萄糖氧化酶，β-半乳糖苷酶、溶菌酶和苹果酸脱氢酶等。
由于辣根过氧化物酶(Horseradish Peroxidase, HRP)比活性高，稳定，分子量小，纯酶容易制备，所以最常用。
HRP广泛分布于植物界，辣根中含量高，它是由无色的酶蛋白和棕色的铁卟啉结合而成的糖蛋白，糖含量18％。
HRP由多个同功酶组成，分子量为40,000,等电点为PH3～9,酶催化的最适PH因供氢体不同而稍有差异，但多在PH5左右。
酶溶于水和58％以下饱和度硫酸铵溶液。
HRP的辅基和酶蛋白最大吸收光谱分别为403nm和275nm，一般以OD403nm ／OD275nm 的比值RZ(德文Reinheit Zahl)表示酶的纯度。
高纯度的酶RZ值应在3.0左右(最高可达3.4)。
RZ值越小，非酶蛋白就越多。
值得注意的是，纯度并不表示酶活性，如当酶变性后，RZ值仍可不变。
HRP的催化反应需要底物过氧化氢(H2O2)和供氢体(DH2)。
供氢体多为无色的还原型染料，通过反应可生成有色的氧化型染料(D)。
平板扩散法测定黄嘌呤氧化酶的活性
平板扩散法测定黄嘌呤氧化酶的活性李忠琴;杨元营;许小平【摘要】通过对Arthrobacter sp.X11菌株所产黄嘌呤氧化酶(XOD)活性测定方法的研究和比较,建立一种简便可行的黄嘌呤氧化酶活性快速检测方法,即平板扩散法.实验结果表明,该方法测得的显色圈直径与辣根过氧化物酶分光光度法测得的酶活力之间有良好的线性关系,通过测量显色圈的直径即可估算出样品的酶活力.%Compared with spectrophotometry for the determination of xanthine oxidase activity by horseradish peroxidase, a quick and simple solid agar plate method of assaying the activity of xanthine oxidase (XOD) produced by Arthrobacter sp. Xl 1 was developed with xanthine as a substrate. The activity of xanthine oxidase was analyzed quickly and roughly according to the diameters of color haloes. This method was used to optimize nitrogen source in a fermentation medium for enzyme production.【期刊名称】《吉林大学学报（理学版）》【年(卷),期】2011(049)003【总页数】4页(P544-547)【关键词】黄嘌呤氧化酶;平板扩散法;显色圈直径;氮源【作者】李忠琴;杨元营;许小平【作者单位】集美大学,水产学院,福建,厦门,361021;福州大学,化学化工学院,福州,350002;福州大学,化学化工学院,福州,350002【正文语种】中文【中图分类】Q55黄嘌呤氧化酶(xanthine oxidase)简称XOD(EC.1.1.3.22), 是生物体内核酸代谢过程中的重要氧化还原酶[1]. 若该酶在内脏器官内含量过高, 将导致痛风、高尿酸血症、缺血性再灌注损伤、风湿性关节炎、心肌梗塞、肝炎等多种疾病发生率的升高[2-5]. XOD也作为一种临床诊断用酶, 应用于检测血清无机磷、血清超氧化物歧化酶活性、细胞损伤后胞外次黄嘌呤和黄嘌呤水平以及次黄嘌呤核苷(肌苷)、鸟嘌呤、鸟苷的含量和鸟嘌呤酶、核苷磷酸化酶的活性等. 黄嘌呤氧化酶活力的测定目前已有多种方法, 如辣根过氧化物酶分光光度法[6]、 NBT/MTS-PMS比色法[7]、紫外分光光度法、电化学法及放射化学法等[8-11]. 这些方法均需借助恒温水浴锅、分光光度计、电导仪等设备检测, 操作较复杂, 一次同时测定的样品个数有限. 本文提出采用平板扩散法检测XOD酶活, 肉眼可直接观察显色圈的大小, 即可判断样品中XOD浓度的高低, 并且可同时测定大批量样品中黄嘌呤氧化酶的活性, 操作简便, 结果可靠.1 材料与方法1.1 黄嘌呤氧化酶样品及其酶活的测定将产黄嘌呤氧化酶的菌株Arthrobacter sp.X11在最适产酶条件下摇瓶发酵, 发酵液经8 000 r/min离心10 min, 收集细胞, 超声破碎后, 再经10 000 r/min离心10 min, 去除细胞碎片, 取上清液即为XOD酶液. 用辣根过氧化酶分光光度法[6]测定酶活.1.2 仪器和主要试剂全温摇瓶柜(HYG-A型, 江苏太仓市实验设备厂)；超速冷冻离心机(IEC MULTI-RR型, 美国IEC公司)；超生波细胞粉碎机(Y92-Ⅱ型, 宁波新芝生物科技股份有限公司)；隔水式电热恒温培养箱(PYX-DHS型, 上海医疗器械一厂)；辣根过氧化物酶(4.168 μkat/mg, BR级, 上海双向西巴斯科技有限公司)； 4-氨基安替比林(AR级, 华东师范大学化工厂)；苯酚(AR级, 国药集团上海化学试剂公司)；黄嘌呤(质量分数为99%, 美国Fluka试剂公司)； Tris(BR级, 国药集团上海化学试剂公司)；HCl(AR级, 国药集团上海化学试剂公司).1.3 培养基及显色液的配制基础产酶培养基：K2HPO4·3H2O, 4.15 g/L； KH2PO4, 0.26 g/L； NaCl, 1.0 g/L； CaCl2, 3 mg/L；FeSO4·7H2O, 0.5 mg/L；MgSO4·7H2O, 0.2 mg/L；乳糖, 1.0 g/L；酵母粉, 2.0 g/L；黄嘌呤, 0.53 g/L；调pH值约为8.0.4-氨基安替比林, 1.0 mmol/L；苯酚, 6 mmol/L；辣根过氧化物酶, 116.67μkat/L; Tris-HCl缓冲液, 100 mmol/L.1.4 固体琼脂平板的制备及平板扩散法测定酶活在三角瓶中加入20 mL Tris-HCl(100 mmol/L, pH=7.6)缓冲溶液, 0.3 g琼脂粉, 再加入36.5 μL黄嘌呤(700 mmol/L)溶液作为底物, 加热溶解. 冷却到约37 ℃, 与放在37 ℃恒温培养箱中的10 mL显色液混合, 混匀制成琼脂平板. 打孔(孔径约为4 mm), 用烧烫的接种针熨润孔壁[12], 在酒精灯上烘烤平皿背面, 使琼脂与平皿底部贴紧[13].将制备的酶液样品定量滴加至琼脂平板的孔中, 置于37 ℃恒温培养箱中反应, 每隔10 min观察孔周围显色圈的大小和颜色深浅变化情况.1.5 氮源优化在基本产酶培养基的基础上, 改变氮源的种类, 分别加入硫酸铵、磷酸二氢铵、氯化铵、钼酸铵、蛋白胨、酵母膏和酵母粉, 使其质量浓度均达到2 g/L. 于32 ℃, 240 r/min摇瓶培养50 h. 收集细胞, 超声破壁(功率400 W, 超声时间3 s, 间隙时间4 s, 超声180次), 10 000 r/min冷冻离心10 min, 取上清液即得粗酶液. 将不同氮源条件下获得的粗酶液40 μL加入孔中, 37 ℃恒温培养箱中反应30 min, 观察显色圈大小.2 结果与讨论2.1 平板扩散法测定酶活标准曲线XOD在催化黄嘌呤氧化的反应过程中, 每氧化1 mol黄嘌呤, 消耗1 mol氧气和水, 生成1 mol尿酸和1 mol H2O2. H2O2再经过氧化物酶作用分解, 可使4-氨基安替比林与苯酚形成亚醌类化合物, 呈红色. 分别将15,20,30,40,45,60 μL的酶液滴加进固体琼脂平板的孔中, 37 ℃恒温孵育30 min后, 测量显色圈大小, 如图1所示, 同时用辣根过氧化酶分光光度法测定各体积酶液对应的酶活. 表1列出了黄嘌呤氧化酶的活力与显色圈直径的相关性. 将表1中显色圈的有效直径对XOD酶活的对数作图, 如图2所示. 由图2可见, 它们之间具有良好的线性关系, 线性方程为y=4.642 5x-3.158(R2=0.981 4). 通过测量显色圈的直径即可估算出样品的酶活力.2.2 温浴时间对显色圈的影响将不同体积的粗酶液加到固体琼脂平板孔中, 适时观察变色圈直径的变化. 实验表明, 37 ℃温浴10 min时开始出现显色圈；随时间延长颜色逐渐加深, 显色圈逐渐扩大；至30 min后显色圈颜色鲜明, 显色圈直径没有明显变化, 可以较精确地表示酶活性的大小；但继续恒温放置时间延长至1 h后, 显色圈开始变模糊, 不利于比较酶活性的大小, 显色圈直径与酶活对数值的线性关系变差(见图2). 由此确定30 min可作为显色反应的终止时间, 立即进行拍照和显色圈直径的测量. 此外, 通过比较不同体积酶液产生的显色圈颜色和直径长度, 表明加入酶液量为40 μL时观察和测量效果均较佳.表1 黄嘌呤氧化酶的活力与显色圈直径的相关性*Table 1 Correlation between diameter of color halo with xanthine oxidase activity每孔滴加酶液量/μL显色圈直径/mm有效直径/mm酶活/(μkat·mL-1)lg A 158.04.0525.941.499 208.54.5759.651.659 309.15.11 051.711.780 4010.26.21 986.402.076 4510.76.72 278.462.136 6012.08.03 680.402.344* 表中的酶活根据辣根过氧化物酶分光光度法[6]测得.图1 黄嘌呤氧化酶不同体积酶液在琼脂平板上形成的显色圈Fig.1 Color circles with different volumes of XOD enzyme solution in agar plate图2 温浴时间对黄嘌呤氧化酶显色圈直径的影响Fig.2 Impact of incubation time on the correlation between diameter of color halo with XOD activity 2.3 平板扩散法的应用采用平板扩散法测定XOD酶活, 并比较在基础产酶培养基中分别添加2 g/L不同氮源对Arthrobacter sp.X11发酵产酶的影响, 进行培养基的氮源优化. 取各氮源培养基发酵50 h后所产粗酶液各40 μL加入到固体琼脂平板孔中, 37 ℃温浴反应30 min, 观察显色圈直径的变化, 如图3所示. 结果表明, 本文方法与采用辣根过氧化物酶分光光度法测得的结果一致, 如图4所示. 由图3和图4可见, 有机氮源(酵母粉、酵母膏、蛋白胨)的发酵产酶水平明显不如无机氮源(硫酸铵、氯化铵、钼酸铵、磷酸二氢铵)的发酵产酶水平. 其中硫酸铵为最佳氮源, 平板扩散法测得的显色圈直径最大, 与辣根过氧化物酶分光光度法测得酶活力最大的实验结果一致. 以蛋白胨为氮源的发酵产酶水平最低, 在平板扩散法检测中几乎未出现显示圈, 与辣根过氧化物酶分光光度法测得的酶活低于1.667 μkat/mL的结果基本一致. 本实验验证了采用平板扩散法测定酶活的可行性和可靠性.综上可见, 采用平板扩散法测定黄嘌呤氧化酶的活力, 是一种简便可行的方法, 可以快捷地测定大批量样品的酶活. 适合于实验研究中利用离子交换层析、疏水层析、凝胶过滤等色谱方法分离纯化XOD时, 检测收集的每管样品中是否含有XOD, 以确定其洗脱峰的出峰时间；此外, 也可以用于XOD产生菌Arthrobacter sp.X11发酵培养基的优化过程中, 比较不同培养基成分和发酵条件对产酶活力的影响, 即时取样跟踪发酵过程酶活的变化情况. 与其他测定XOD酶活的方法相比, 本方法无需特殊设备, 一个平板最多可检测12个样品, 一次可同时处理几十至上百个样品, 并简化了实验操作步骤, 缩短了操作时间.1: 硫酸铵； 2: 氯化铵； 3: 磷酸二氢铵； 4: 钼酸铵；5: 蛋白胨； 6: 酵母膏； 7: 酵母粉.图3 添加不同氮源发酵Arthrobacter sp.X11产酶的显色圈变化Fig.3 Diversification of color halo for enzyme production in Arthrobacter sp.X11 after fermentation by adding different nitrogan sources1: 硫酸铵； 2: 氯化铵； 3: 钼酸铵； 4: 磷酸二氢铵；5: 酵母粉； 6: 酵母膏； 7: 蛋白胨.图4 辣根过氧化物酶分光光度法测定不同氮源对产酶的影响 Fig.4 Effects of different nitrogen sources on XOD production by horseradish peroxidase spectrophotometry参考文献【相关文献】[1] Bray R C, Palmer G, Beinert H. Direct Studies on the Electron Transfer Sequence on Xanthine Oxidase by Electron Paramagnetic Resonance Spectroscopy.Ⅱ. Kinetic Studies Employing Rapid Freezing [J]. J Biol Chem, 1964, 239: 2667-2676.[2] Giler S H, Sperling O, Brosh S, et al. Serum Xanthine Oxidase in Jaundice [J]. Clin Chim Acta, 1975, 63(1): 37-40.[3] Giler S H, Eshel Y, Pinkhas J, et al. Elevation of Serum Xanthine Oxidase Activity Following Halothane Anesthesia in Man [J]. Cellular and Molecular Life Science, 1977,33(10): 1356-1358.[4] Tan S, Radi R, Gaudier F, et al. Physiologic Levels of Uric Acid Inhibit Xanthine Oxidase in Human Plasma [J]. Pediatr Res, 1993, 34(3): 303-307.[5] ZHAO Yuan-hong, SHAO Feng-zhen. The Relationship between Xanthine Oxidase andthe Liver [J]. Chinese Journal of Integrated Traditional and Western Medicine on Liver Diseases, 2005, 15(3)： 188-190. (赵远红, 韶凤珍. 黄嘌呤氧化酶与肝病关系的探讨 [J]. 中西医结合肝病杂志, 2005, 15(3)： 188-190.)[6] LI Zhong-qin, XU Xiao-ping, YANG Hai-lin, et al. 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荧光光度法测定维生素 B1 使用辣根过氧化物酶作为催化剂作用下的过氧化氢
荧光光度法测定维生素B1 使用辣根过氧化物酶作为催化剂作用下的过氧化氢阿扎姆汗【摘要】在这项工作中一种新的维生素B1，基于辣根过氧化物酶(HRP) 过氧化氢(H2O2) 存在下的催化活性测定荧光法方法已经完成。
非荧光维生素B1 是很容易转化为通过在碱性介质中催化氧化荧光化合物，即使没有暴露在光线。
观察到的维生素B1 的线性范围是0.026–16.83 毫克/毫升(RSD = 1.75%)。
相关系数的校准表头偏差扬天曲线和极限的检测发现，分别为0.9964 和0.015 毫克/毫升。
发达的方法实用、简单、敏感、相对自由从共存物质的干涉，并已成功应用在药物制剂中的维生素B1 的测定。
【关键字】荧光法维生素B1 辣根过氧化物酶过氧化氢1、引言维生素B1 (硫胺素) 分子包括嘧啶-和噻唑份额、4-氨基-5-羟甲基-2-甲基- 嘧啶和5-(2-羟乙基)-4-甲基噻唑，分别由亚甲基桥（图1）的链接。
人类和其他mam 历史学不能合成硫胺并因而依靠外源供应的维生素(1)。
硫胺是亲水的性质，其活动二磷酸形式作为-辅酶的几种酶(2)。
维生素B1 在复杂酶达 3.16 亿-定于线粒体能量解放中的中心作用和NADPH 生产为维持细胞氧化还原、谷胱甘肽(GSH)水平、蛋白巯组、核酸和脂肪酸合成(3)维生素B1 必要紧张(4)和人体心血管(5)系统的正常运作。
严重饮食不足的维生素B1会导致脚气病或韦尼克- 科尔萨科夫综合征(6)。
维生素B1的身体的正常功能，复杂剂量形式（7）和稳定性因素(8，9)使维生素B1的检定扬天重要临床分析、食品加工、制药工业和生物技术过程中的常见用途。
许多方法已测定的维生素B1，包括古典重量10-12)、滴定法(15)、电化学分析(16-23 ）、薄层法(24至第31)为调查、气相色谱法(1000mg)毛细管电泳(37–43)、高性能液相色谱(44–57)、(62) 荧光分光光度法(63-68）。
过氧化物酶活性测定方法
过氧化物酶活性测定方法过氧化物酶活性的测定(比色法)过氧化物酶是植物体内普遍存在的、活性较高的一种酶，它与呼吸作用、光合作用及生长素的氧化等都有密切关系，在植物生长发育过程中，它的活性不断发生变化，因此测量这种酶，可以反映某一时期植物体内代谢的变化。
一、原理在有过氧化氢存在下，过氧化物酶能使愈创木酚氧化，生成茶褐色物质，该物质在 470 nm 处有最大吸收，可用分光光度计测量 470 nm 的吸光度变化测定过氧化物酶活性。
二、实验材料、试剂与仪器设备(一)实验材料:马铃薯块茎。
(二)试剂1 ( 100 mmol , L 磷酸缓冲液 pH7.0 (见附录)。
磷酸氢二钠。
磷酸二氢钠。
2 (反应混合液: 100 mmol , L 磷酸缓冲液( pH7.0 ) 50 mL 于烧杯中，加入愈创木酚((邻甲氧基苯酚) 28 μl ，于磁力搅拌器上加热搅拌，直至愈创木酚溶解，待溶液冷却后，加入 30 % 过氧化氢19 μl ，混合均匀，保存于冰箱中。
(三)仪器设备分光光度计，研钵，恒温水浴锅， 100 mL 容量瓶，吸管，离心机。
三、实验步骤1 (称取植物材料 1 g ，剪碎，放入研钵中，加适量的磷酸缓冲液研磨成匀浆，以 4000 r , min 离心 10 min ，上清液转入 100 mL 容量瓶中，残渣再用 5 mL 磷酸缓冲液提取一次，上清液并入容量瓶中，定容至刻度，贮于低温下备用。
2 (取光径 1 cm 比色杯 2 只，于 1 只中加入反应混合液3 mL 和磷酸缓冲液 1mL ，作为对照，另 1 只中加入反应混合液 3 mL 和上述酶液 1mL (如酶活性过高可稀释之)，立即开启秒表记录时间，于分光光度计上测量波长 470 nm 下吸光度值，每隔 1min 读数一次。
四、结果计算以每分钟吸光度变化值表示酶活性大小，即以ΔA 470 /[min ? g (鲜重) ] 表示之。
也可以用每 min 内 A 470 变化 0.01 为 1 个过氧化物酶活性单位( u )表示。
分光光度法测定植物过氧化氢酶活性的研究
分光光度法测定植物过氧化氢酶活性的研究引言过氧化氢酶（catalase）是一种催化分解过氧化氢（H2O2）为水和氧气的酶，在植物细胞的抗氧化防御系统中起着重要的作用。
过氧化氢是由于氧化还原反应过程中产生的副产物，对细胞结构和功能造成损害。
因此，了解植物过氧化氢酶的活性对于研究植物抗氧化防御系统以及应对环境胁迫具有重要意义。
本实验采用分光光度法测定植物过氧化氢酶活性。
该方法基于过氧化氢与酶催化下的酚酞（phenolphthalein）反应。
过氧化氢与酚酞反应生成的产物具有特定的吸收峰，根据产物的颜色变化可以间接测定过氧化氢酶活性。
实验方法材料准备：-植物样品：从植物叶片中采集新鲜样品，并切成小片。
-植物提取液：将植物样品置于离心管中，加入适量的磷酸盐缓冲液并研磨。
离心后，将上清液收集并过滤以获得植物提取液。
过氧化氢酶活性的测定步骤：1.预处理样品：将植物提取液稀释至合适的浓度，使得产生的吸光度在仪器检测范围内。
2.准备反应体系：将稀释后的植物提取液（500μL）放入试管中，加入适量的过氧化氢溶液（100μL）。
3. 开始反应：将试管放入分光光度计，设置适当的波长（通常为546 nm）并开始监测吸光度的变化。
4.计算反应速率：根据实验期间记录的吸光度数据，绘制出反应曲线，并计算反应速率。
结果与讨论通过分光光度法测定植物过氧化氢酶活性的实验结果可以得出如下结论：-过氧化氢酶活性随着时间的增加而逐渐升高，表明其在反应体系中展现了催化效应。
-利用吸光度数据绘制的反应曲线，可以确定反应速率，据此可以定量分析过氧化氢酶活性。
然而，需要注意的是，分光光度法测定植物过氧化氢酶活性的实验仅仅提供了该酶活性的定性或近似定量信息。
为了得到更精确的结果，还需要使用其他具体的分析方法，比如酶动力学方法。
结论本实验采用分光光度法测定植物过氧化氢酶活性，通过分析吸光度数据可以定量测定该酶的活性。
这一方法操作简便，结果快速且可靠。
辣根过氧化物酶的制备及活力测定
实验步骤
3.丙酮分级分离：将上清液倒入烧杯并置冰盐
浴中，在不断搅拌下，用细滴管沿杯壁加入1 倍体积预冷至－15℃的丙酮，放置片刻，在 冰冻离心机中以4 000r/min离心15min，弃去 沉淀。上清液再加入0.8体积(按原上清液体积) －15℃丙酮，(操作同上)，静置后，在冰冻 离心机中离心收集沉淀。将沉淀溶于少量蒸
RZ 值近于1的 酶溶液。
实验步骤
4.精制：将上步酶液适当稀释，滴加
1mol/L硫酸锌溶液，使酶液中锌离子
浓度为10 -3 mol/L，5 000r/min离心
10min，得上清液。再将沉淀用少量
蒸馏水洗涤，离心，洗液与清液合并，
分装于透析袋内，用水透析除盐，用
微孔滤膜过滤，进行真空冰冻干燥(约
得20mg)，产品呈米黄色纤维状松软
辣根过氧化物酶是一种含亚铁血红素的蛋白质 ,Mr在40
000左右，等电点7.2。溶于水，溶解度为5%(W/V)，溶液呈棕
红色，透明。HRP可溶于0.58饱和度以下的硫酸铵溶液，而
0.62饱和度以上则不溶。该酶最适pH7.0(对愈创木酚为氢给体
而言)。在室温下，HRP几周内稳定，加热到63℃，在15min内
2.蛋白质含量的测定：将酶液适当稀释后，用Bradford法比色测定蛋白质 含量，
实验结果
1.计算产品的RZ值及k4 2.计算产品的比活力。
思考题
1.盐析法制备辣根过氧化物酶的原理是什么? 2.愈创木酚法测定辣根过氧化物酶的原理是什么? 3.测定辣根过氧化物酶的活力时，要求什么样的pH和
温度?是否需要先测定酶液的蛋白质含量?
实验步骤
加好反应物，摇匀，在 470nm读出A470nm值，为t=0时的读数。立 即加0.01mL40mmol/L过氧化氢溶液于2个比色池中，即刻摇匀并记时，每 隔30s读数1次，约5min
黄嘌呤氧化酶(XOD)活性检测试剂盒说明书 紫外分光光度法
黄嘌呤氧化酶（XOD）活性检测试剂盒说明书紫外分光光度法注意：正式测定之前选择2-3个预期差异大的样本做预测定。
货号：BC1090规格：50T/48S产品内容：提取液：液体60mL×1瓶，4℃保存；试剂一：液体60mL×1瓶，4℃保存；试剂二：粉剂×4瓶，4℃保存。
产品说明：XOD（EC 1.17.3.2）催化黄嘌呤氧化生成尿酸和超氧阴离子，是活性氧主要来源之一；同时也是核苷酸代谢的关键酶之一。
XOD主要分布于哺乳动物的心，肺，肝脏等组织中，当肝功能受损时，XOD大量释放到血清中，对肝损害的诊断具有特异性的意义。
XOD催化黄嘌呤产生尿酸，尿酸在290nm下有特征吸收峰。
需自备的仪器和用品：紫外分光光度计、台式离心机、可调式移液器、1mL石英比色皿、研钵、冰和蒸馏水。
操作步骤：一．粗酶液提取：1、细菌、细胞或组织样品的制备：细菌或培养细胞：先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照细菌或细胞数量（104个）：提取液体积（mL）为500~1000：1的比例（建议500万细菌或细胞加入1mL提取液），超声波破碎细菌或细胞（冰浴，功率20％或200W，超声3s，间隔10s，重复30次）；8000g4℃离心10min，取上清，置冰上待测。
组织：按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g组织，加入1mL提第1页，共3页取液），进行冰浴匀浆。
8000g4℃离心10min，取上清，置冰上待测。
或者直接用0.5mg/mL的酶液直接测定，为保证实验准确性建议用提取液梯度稀释后测定。
2、血清（浆）样品：直接检测。
二．操作步骤：1、分光光度计预热30min以上，调节波长至290nm，蒸馏水调零。
2、XOD检测工作液的配制：用时在每瓶试剂二中加入15mL试剂一，充分混匀，待用；用不完的试剂4℃可保存一周。
3、测定前按需取出一定量的XOD检测工作液37℃(哺乳动物)或25℃（其它物种）水浴30min以上。
辣根过氧化物酶分光光度法测定黄嘌呤氧化酶的活性
辣根过氧化物酶分光光度法测定黄嘌呤氧化酶的活性李忠琴;许小平;杨海麟;王武【期刊名称】《分析化学》【年(卷),期】2006(34)6【摘要】研究了以辣根过氧化物酶-苯酚- 4-氨基安替比林反应显色新体系,检测黄嘌呤氧化酶(XOD)活力的新方法.确定该酶活性测定的最佳条件为:辣根过氧化物酶(HRP) 7000 U/L,4-氨基安替比林(AAP) 1 mmol/L,苯酚(PA) 6 mmol/L,黄嘌呤(XAN) 1 mmol/L溶于50 mmol/L Tris-CL缓冲液(pH 8.4);反应温度为37℃,保温时间为20 min;检测波长为508 nm.本方法测定XOD酶活的线性范围为5.0～100.0 U/L,线性关系良好(r=0.9992),检出限为1.3 U/L.该方法操作简单易行,测定结果准确可靠.可有效应用于普通实验室和临床常规生化检测.【总页数】4页(P821-824)【作者】李忠琴;许小平;杨海麟;王武【作者单位】江南大学工业生物技术教育部重点实验室,无锡,214036;福州大学化学化工学院,福州,350002;江南大学工业生物技术教育部重点实验室,无锡,214036;江南大学工业生物技术教育部重点实验室,无锡,214036【正文语种】中文【中图分类】O6【相关文献】1.催化分光光度法测定辣根过氧化物酶新方法研究 [J], 魏永锋;阎宏涛2.酶偶联分光光度法测定胞内黄嘌呤氧化酶活性 [J], 李忠琴;王武3.以1-氯萘酚为底物的分光光度法测定辣根过氧化物酶 [J], 王彤;魏西莲;尹宝霖;张媛媛4.预混合自组装辣根过氧化物酶生物活性膜及其催化活性研究 [J], 江秀明;陈志春;杨绍明;林贤福5.紫外分光光度法测定中药中黄嘌呤氧化酶抑制活性研究 [J], 罗六保;谢志鹏因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
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辣根过氧化物酶分光光度法测定黄嘌呤氧化酶的活性李忠琴1 许小平2 杨海麟1 王武#11（江南大学工业生物技术教育部重点实验室，无锡214036） 2（福州大学化学化工学院，福州350002）摘 要 研究了以辣根过氧化物酶-苯酚-4-氨基安替比林反应显色新体系，检测黄嘌呤氧化酶（XOD ）活力的新方法。
确定该酶活性测定的最佳条件为：辣根过氧化物酶（HRP ）7000U /L ，4-氨基安替比林（AAP ）1mmol /L ，苯酚（PA ）6mmol /L ，黄嘌呤（XAN ）1mmol /L 溶于50mmol /L Tris-CL 缓冲液（pH 8.4）；反应温度为37℃，保温时间为20min ；检测波长为508nm 。
本方法测定XOD 酶活的线性范围为5.0～100.0U /L ，线性关系良好（r =0.9992），检出限为1.3U /L 。
该方法操作简单易行，测定结果准确可靠。
可有效应用于普通实验室和临床常规生化检测。
关键词 黄嘌呤氧化酶，辣根过氧化物酶，酶的活力测定，分光光度法2005-08-30收稿；2005-12-05接受本文系福建省自然科学基金（No.C0410006）和工业生物技术教育部重点实验室基金（No.KLIB-KF200502）资助项目1 引 言黄嘌呤氧化酶（xanthine oxidase ，XOD ，EC 1. 2. 3.22）是一种钼羟类胞质缀合酶。
主要用于痛风、心肌梗塞和细胞损伤后次黄嘌呤和黄嘌呤水平的检测［1～3］。
目前测定黄嘌呤氧化酶活力主要采用NBT /MTS-PMS 比色法、紫外分光光度法、电化学法及放射化学法［4～8］等方法。
但比色法形成的显色物溶解度低，PMS 对XOD 活性有一定的抑制，且NBT 、MTS 和PMS 试剂昂贵。
紫外分光光度法中黄嘌呤和尿酸的紫外吸收波长较接近，直接进行紫外检测，干扰严重。
其余两种方法操作繁琐，仪器设备要求高而难于推广。
本实验根据辣根过氧化物酶（horseradish peroxidase ，HRP ）［9］和黄嘌呤氧化酶的反应特性，提出了用XOD 偶联辣根过氧化物酶，直接测定黄嘌呤氧化酶活力的新方法。
2 实验部分2.1 仪器和试剂U-300型紫外-可见分光光度仪（日本日立公司）；H.H.S 11-2R 恒温水浴锅（上海医疗器械五厂）；高速冷冻离心机（日本Hitachi CR22G 型）。
0.67U /mg 黄嘌呤氧化酶（Sigma 公司）；250U /mg 辣根过氧化物酶（上海双向西巴斯科技有限公司）；4-氨基安替比林（AR ，华东师范大学化工厂）；苯酚（AR ，国药集团上海化学试剂公司）；黄嘌呤（99%，Fluka ）；Tris （BR ，国药集团化学试剂有限公司）；HCL （AR ，国药集团上海化学试剂公司）；叠氮钠（BR ，厦门新隆达试剂有限公司）。
2.2 实验方法配制反应显色液：4-氨基安替比林（4-Aminoantipyrine ，AAP ），1mmol /L ；苯酚（phenic acid ，PA ），6mmol /L ；Tris-HCL 缓冲液，50mmol /L ；叠氮钠，0.02%；辣根过氧化物酶（horseradish peroxidase ，HRP ），7000U /L 。
在具塞试管中，依次加入3mL 反应显色液，黄嘌呤（xanthine ，XAN ）溶液100µL ，黄嘌呤氧化酶（XOD ）酶液50µL 。
混匀，在37℃下加热20min ，煮沸5min 终止反应。
以不加XOD 反应体系作为参比，测定UV-Vis 谱。
2.3 样品处理Arthrobacter g-X 菌株液体发酵48h 后，在10000r /min 转速下离心15min ，收集细胞。
再将其悬浮于50mmol /L Tris-HCL 缓冲液（pH 7.5）中，采用250W 超声处理15min 。
然后用12000r /min 转速离心10min ，取其上清液测定酶活。
第34卷2006年6月分析化学（FENXI HUAXUE ） 研究简报Chinese Journal of Analytical Chemistry第6期821～8243 结果与讨论3.1 酶法测定原理黄嘌呤氧化酶在催化黄嘌呤氧化的反应过程中，每氧化1mol 黄嘌呤，将消耗1mol 分子氧和水，产生1mol 尿酸和1mol H 2O 2。
H 2O 2再经过氧化物酶作用分解，可使4-氨基安替比林与苯酚形成亚醌类呈红色的化合物（chromogen ）［10］。
在可见光范围内测定该显色化合物的吸光度，即可推算出XOD 的酶活。
总反应式如下：Xanthine +O 2+H 2O 7%XODUric acid +H 2O （1）H 2O 2+AAP +PA 7%HRD chromogen +H 2O（2）3.2 反应体系主要参数的确定3.2.1 吸收光谱全波长扫描分析 按实验方法依次加入除XOD 的所有试剂，以Tris-HCL 缓冲液为参比，扫描该体系的UV-Vis 图谱。
如图1曲线1所示，仅在紫外区有1个吸收峰。
加入XOD 反应后再扫描体系的UV-Vis 谱。
从谱图曲线2可看出产物在可见光区450～650nm 之间只有1个吸收峰，选择吸收峰值最高的波长508nm 作为XOD 酶活检测波长，可降低干扰。
图中曲线3在可见光区没有任何吸 图1 XOD 检测反应体系的UV-Vis 扫描图谱Fig.1 Absorption spectra for system of anthine oxidase catalyzing reaction1.加黄嘌呤氧化酶前的体系（without xanthine oxidase ）；2.加黄嘌呤氧化酶后的体系（with xanthine oxidase added ）；3.不加辣根过氧化物酶的体系（without horseradish peroxidase ）；检测条件（determination conditions ）：辣根过氧化物酶（horseradish peroxidase ，HRP ）7000U /L ，4-氨基安替比林（4-aminoanti-pyrine ，AAP ）1mmol /L ，苯酚（phenic acid ，PA ）6mmol /L ，黄嘌呤（xanthine ，XAN ）1mmol /L ，黄嘌呤氧化酶（xanthine oxidase ，XOD ）49.3U /L 。
收峰，说明若不添加辣根过氧化物酶，体系无法形成红色亚醌类化合物，即不能进行XOD 的检测。
3.2.2 酶促反应温度的确定 在相同反应条件下，考察了不同反应温度对XOD 酶活的影响。
结果表明（表1），随着温度的升高，体系吸光度先增大后减少，即显色物的生成量先增后减。
在37℃时，显色物的吸光度最高。
因而选择37℃作为检测温度，可获最佳反应效果。
表1 温度对XOD 酶促反应体系的影响Table 1 The effect of temperature on the XOD reaction system温度（℃）Temperature3235374048A 5800.23280.27970.31930.28050.2631反应条件（reaction conditions ）：t =20min ；pH 8.6。
3.2.3 酶催化反应动力学性质 分别按3.2实验方法同时进行反应，在反应后1、3、6、9、10、12、13、18、20、25及30min 时终止反应，测其吸光度，结果见图2。
由图2可以看出，在XOD 加入测定体系后，吸光度值随反应时间增加逐渐增大。
在20min 后，吸光度值达到最大，用A max 表示。
用一级动力学方程描述吸光度与时间之间的关系曲线得到图3，结果显示该体系反应很好地符合一级反应，动力学方程为：ln （A max -A t ）=-0.1724t -1.2326，相关系数r =0.9973。
虽然体系中包含两步酶反应，但是由于HRP 的催化效率极高，H 2O 2一经生成立刻分解出初生态氧，而且H 2O 2氧化苯酚反应比黄嘌呤的氧化反应要快得多，故该体系的综合反应是准一级反应。
3.2.4 酶促反应体系pH 的选择 在XOD 和HRP 两种酶的稳定pH 范围内，考察了6个不同pH 对酶活力的影响。
结果表明（表2），pH 对反应体系有明显的影响。
在pH8.0～8.4范围内，随着pH 的提高，显色吸光度增大。
故确定该反应体系的最适pH 为8.4。
表2 体系pH 对XOD 酶活检测的影响Table 2 The effect of pH on the determination of XOD reac-tion systempH 7.58.08.28.48.69.0A 5080.13390.13850.17540.18010.15270.1262反应条件（reaction conditions ）：T =37℃，20min 。
228分析化学第34卷图2 反应体系测定XOD 的吸光度随时间变化的曲线Fig.2Curve of absorbance versus time in reaction system反应条件（reaction conditions ）：T =37℃，pH 8.6。
图3 XOD-HRP-PA-AAP-XAN 反应体系的动力学曲线Fig.3 Kinetic curve of the XOD-HRP-PA-AAP-XAN re-action system反应条件（reaction conditions ）：T =37℃，pH 8.6。
3.2.5 根据米氏常数选择黄嘌呤底物浓度 分别以0.062、0.099、0.308、0.615和1.231mmol /L 等不同浓度的黄嘌呤为基质对相同浓度XOD （49.3U /L ）的酶活进行测定，观察底物对酶促反应速度的影响。
根据Lineweaver-Burk 双倒数作图法，线性方程为（1/S ）=2.9619×（1/V ）+60.896，相关系数r 为0.9987，求得黄嘌呤氧化酶的米氏常数为K m =0.049mmol /L 。
在酶活测定中，要求底物浓度过量，一般应大于10倍K m 值［11］。
根据该实验结果说明在本文中采用的1mmol /L 黄嘌呤作为测定体系的底物浓度是适宜的。
3.2.6 测定方法的建立 首先取3mL 反应显色液（pH8.4）于具塞试管中，加入100µL 黄嘌呤溶液（1mmol /L ），在37℃水浴中预热1min 。
然后加入50µL 标准XOD 酶液或发酵XOD 酶提取液，混匀保温20min ，沸水煮5min 终止反应。