不同限制性核酸内切酶对质粒DNA的切割1

不同限制性核酸内切酶对质粒DNA的切割

——PvuⅡ和HindⅢ对pUC19-P35S:ARF8双酶切

费欢 1014100060

广州大学生命科学学院生物科学2010级

摘要为加深对限制性内切核酸酶切割质粒DNA的位点特异性和其专一性的认识，采用Pvu

Ⅱ和HindⅢ两种酶双酶切质粒DNA，从而验证不同限制性核酸内切酶对质粒DNA具有不同的切割结果。采用限制性内切酶PvuⅡ和HindⅢ共同对pUC19-P35S:ARF8进行切割，再用琼脂糖凝胶电泳加以分离，得到电泳图谱，对照分子量标样加以鉴定。结果获得6条带，大小分别为2366bp,2264bp,499bp,436bp,370bp,179bp。

关键词限制性核酸内切酶PvuⅡ和HindⅢ、质粒DNA、双酶切、琼脂糖凝胶电泳

引言：

限制性核酸内切酶主要存在于原核生物，它能将外来的DNA 切断，即能够限制异源DNA 的侵入并使之失去活力，但对自己的DNA 却无损害作用，这样可以保护细胞原有的遗传信息。它不同于一般的脱氧核糖核酸酶（DNase），限制性核酸内切酶的切点大多很严格，要求专一的核苷酸序列。限制性核酸内切酶按其性质可分为三大类，即所谓Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型酶。[1]其中Ⅰ型和Ⅲ型水解核酸要消耗ATP，它既特异性切割核酸又能给特殊碱基加上甲基基团进行修饰，但特异性弱，切割位点不固定; Ⅱ型水解核酸不需要消耗ATP，它只特异性切割核酸并不修饰碱基，其特异性强，切割位点固定。[2]限制性核酸内切酶是一类能识别双链DNA 分子特异性核酸序列的DNA水解酶。它是基因工程中用于体外剪切基因片段的重要工具酶。本实验可加深对限制性内切核酸酶切割质粒DNA的位点特异性的认识，通过实践充分了解PvuⅡ和HindⅢ两种酶双酶切质粒DNA产生的片段。

研究人员通过使用15种限制性内切酶酶切重组质粒pBKrsv-MLCK，探讨了限制性内切酶的应用和限制性内切酶酶切图谱分析的方法。[3]近几年，各种动物体内线粒体DNA的酶切分析的研究十分广泛，并取得了一定的成果(宋平,李小迎,熊全沫,1994[4]；戴建华,殷文莉，2004 [5]；关海红,石连玉,刘明华等，2000 [6])，采用Tru 9Ⅰ/EcoRⅠ和TaqⅠ/Pst Ⅰ两种限制性内切酶酶切组合对细鳞鱼的遗传多样性进行研究同样有所帮助（王荻,徐革锋,刘洋等，2009）[7]。没有限制性核酸内切酶的发现和应用，就没有分子生物学的兴旺发展，在基因工程和分子生物学中，限制性核酸内切酶起着其足轻重的作用。因此研究限制性核酸内切酶对质粒DNA的切割具有重要的意义。

1.材料和方法

1.1材料

1.1.1实验材料

重组质粒pUC19-P35S:ARF8由广州大学生命科学学院生化楼分子生物学实验室构建；

限制性内切酶：EcoRI购自TaKaRa等生物工程公司；

琼脂糖：进口分装。

1.1.2实验设备

水平式电泳装置，电泳仪，台式高速离心机，微量移液枪，PCR热稳定仪，微波炉，凝胶成像系统等。

1.1.3试剂

5 x TBE电泳缓冲液；

无菌水；

M缓冲液；

10×loading buffer；

溴化乙锭溶液母液：将EB配置成10mg/ml，用铝箔或黑纸包裹容器，储于室温；

DNA分子量标准：从小到大为100bp、250bp、500bp、750bp、1000bp、2000bp。

1.2方法

1.2.1 DNA酶切反应

1.2.1.1将清洁干燥并经灭菌的eppendorf管编号，用微量移液枪分别加入DNA 10µl和M

缓冲液2µl，再加入无菌水使总体积为19µl，将管内溶液混匀后加入酶液PvuⅡ和Hind Ⅲ各1µl，用微量离心机离心数秒使溶液混匀并集中在管底。

1.2.1.2混匀反应体系后，将eppendorf管置于适当的支持物上，37℃水浴保温3小时，使

酶切反应完全。

1.2.1.3每管加入5µl10×loading buffer，混匀，以停止反应。

1.2.2 琼脂糖凝胶的制备

1.2.2.1取5xTBE缓冲液20ml加水至200ml，配置成0.5xTBE稀释缓冲液，待用。

1.2.2.2胶液的制备：

称取0.4g琼脂糖，置于200ml锥形瓶中，加入50ml 0.5xTBE稀释缓冲液，放入微波炉里加热至琼脂糖全部融化，取出摇匀，此为0.8%琼脂糖凝胶液。加热过程中要不时摇动，使附于瓶壁上的琼脂糖颗粒进入溶液。加热时应盖上封口膜，以减少水分蒸发。

1.2.2.3胶板的制备：

将封好的胶槽置于水平支持物上，插上样品梳子，注意观察梳子齿下缘应于胶槽底面保持1mm左右的间隙。向冷却至0-60℃的琼脂糖液中加入溴化乙锭（EB）溶液使其终浓度为0.5μg/ml。

用移液枪吸取少量融化的琼脂糖凝胶封橡皮膏内侧，待琼脂糖溶液凝固后将剩余的琼脂糖小心地倒入胶槽内，使胶液形成均匀的胶层。倒胶时的温度不可太低，否则凝固部均匀，速度也不可太快，否则容易出现气泡。待胶完全凝固后拔出梳子，注意不要损伤梳底部的凝胶，然后想槽内加入0.5×TBE稀释缓冲液至液面恰好没过胶板上表面。因边缘效应样品槽附近会有一些隆起，阻碍缓冲液进入样品槽总，所以要注意包装样品槽中应注满缓冲液。1.2.3 电泳分离DNA片段

1.2.3.1加样：

用微量移液枪取13µl酶解液小心加入样品槽一上样孔，再取9.5µl酶解液加入另一上样孔。上样时要小心操作，避免损坏凝胶或将样品槽底部凝胶刺穿。

1.2.3.2电泳：

加完样后，合上电泳槽盖，立即接通电源。控制电压保持在60-80V，电流在40mA以上，电泳28分钟。

1.2.3.3观察和拍照：

在长波长紫外灯下观察已加有EB的电泳胶板，DNA存在处显示出肉眼可辨的荧光条带。2.结果和分析