枯草芽孢杆菌发酵过程控制及最优碳源筛选

枯草芽孢杆菌发酵过程控制及最优碳源筛选

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（+++++农业与生物技术学院++ 111111）

摘要：本实验通过福林试剂法检测枯草芽孢杆菌中碱性蛋白酶的活性，旨在筛选出培养枯草芽孢杆菌时的最优碳源和掌握培养枯草芽孢杆菌基本的发酵过程控制，为今后进一步提高枯草芽孢杆菌产碱性蛋白酶提供可靠地参考数据。

关键词：酶活、最优碳源、碱性蛋白酶。

引言：碱性蛋白酶是指在pH值为碱性的条件下水解蛋白质肽键的酶类,其最适pH值一般为9～11,属内肽酶中的丝氨酸蛋白水解酶类,除可催化蛋白质水解为氨基酸外,在有机溶剂中还可催化多肽的合成[1]。它在商业中的巨大应用前景及在基础研究中的重要作用,吸引着国际国内的许多公司及研究单位竞相对其进行多方面的研究[2]。微生物蛋白酶均为胞外酶,与动、植物源蛋白酶相比具有下游技术处理相对简单、价格低廉、来源广、菌体易于培养、产量高、高产菌株选育简单、快速、具有动植物蛋白酶所具有的全部特性,同时易于实现工业化生产[3]。而且碱性蛋白酶比中性蛋白酶具有更强的水解能力和耐碱能力,有较大耐热性且有一定的酯酶活力[4]。枯草芽孢杆菌是生产碱性蛋白酶的传统菌株,具有产蛋白酶量大,耐高温、高碱等特点,因此对枯草芽孢杆菌碱性蛋白酶的研究成为蛋白酶研究的热点[5]。我国研究和生产的碱性蛋白酶的活力水平虽然不断提高,但大多数采用进口的碱性蛋白酶制剂,并且大规模工业生产中用的碱性蛋白酶还是主要依赖进口

[6]。本实验通过碳源优化枯草芽孢杆菌发酵培养基和探究培养枯草芽孢杆菌基本的发酵过程控制,以期进一步提高枯草芽孢杆菌所产碱性蛋白酶粗酶的活力。

1.材料与方法

1.1菌株：枯草芽孢杆菌

1.2材料与试剂

酪氨酸、福林试剂、三氯乙酸、无水碳酸钠、干酪素、氯化钙、酵母浸粉、柠檬酸钠、磷酸氢二钾、蛋白胨

1.3仪器与设备

恒温水浴锅、分光光度计、高速离心机、摇床、超净工作台、15L 发酵罐、PHS-25型酸度计、振荡培养箱、压力灭菌锅。

1.4 培养基

种子培养基(g/L)：胰蛋白栋5g/L、葡萄糖10g/L、酵母浸粉5g/L、K2HPO4 18g/L ,pH 值自然，121℃蒸气灭菌20min；

发酵培养基(g/L)：酵母浸粉10 g/L、糊精100 g/L、柠檬酸钠3 g/L、蔗糖20 g/L 、K2HPO4 18g/L 、CaCl2 3 g/L, pH 值自然，115℃与发酵罐一起进行实消，20min。

1.5方法

1.5.1 不同碳源对枯草芽孢杆菌的影响

1.5.1.1配制培养基（20mL/150mL）

准确秤取0.2g酵母浸粉、0.06g柠檬酸钠、0.2g磷酸氢二钾、0.06g 氯化钙5份分别加入0.6g蔗糖、0.6g麦芽糖、0.6g葡萄糖、1.1g乳

糖、1.1g糊精，最后取20mL自来水，PH自然，配制成20ML/150mL 的培养基，塞好棉塞，包扎后进行高压真气灭菌（121℃蒸气灭菌20min）

1.5.1.2 接种

用移液枪吸取0.62mL菌种至培养基上，置摇床35℃，200r/min 恒温培养48h。将发酵液12000r/min离心10min，上清液即为粗酶液。

1.5.1.3 酶活力的测定

1.5.1.3.1标准曲线的制作

取12支试管，按表1加入试剂（每支重复一次），混匀，再加入1mL福林试剂摇匀，置40℃水浴20min，于分光光度计680nm处测定样品的A680值。以不含酪氨酸的0号管作为空白。

表1 标准曲线制备试剂

管号酪氨酸浓度酪氨酸使用水/mL0.4moL/L

( µg/ML )溶液( µg/ML )NaCO3

0 0 0.0 1.0 5

1 10 0.1 0.9 5

2 20 0.2 0.8 5

3 30 0.3 0.7 5

4 40 0.4 0.6 5

5 50 0.5 0.5 5

1.5.1.3.2样品酶活测定方法

取碱性蛋白酶的菌种发酵液10mL于离心管中，12000r/min离心15min后，分别吸取上清液1mL稀释至10、25、50倍。取试管7

支（一支为空白管，样品重复2次），各加入稀释好的样品1mL，40℃水浴预热3min,再加入同样预热过的1%酪蛋白液1mL,精确反应10min,加0.4moL/L三氯乙酸2mL终止反应混匀，水浴沉淀15min后过滤，吸滤液1ML,加入0.4moL/L Na2CO3 5mL混匀，再加入1mL福林试剂摇匀，置40℃水浴20min。

空白测定同上，但在加酪蛋白之前先加0.4moL/L三氯乙酸2mL。以空白对照，用分光光度计680nm波长下测样品的A680，选出最优碳源。

1.5.2 对枯草芽孢杆菌发酵过程控制的探究

1.5.

2.1按实验材料中种子培养基的组分制备好种子培养基，控温到接菌温度时，进行接菌。接菌后置于摇床上培养24h，备用。

1.5.

2.2按实验材料中发酵培养基的组分制备好发酵培养基，进行电极（PH电极、溶氧电极）标定。将制备好的发酵液由进料口加料，然后在115℃下实消20min。

1.5.

2.3降温到接菌温度接菌，控制变温恒溶氧条件进行发酵。

1.5.

2.4 发酵过程控制前基本参数记录，发酵过程直接参数记录，发酵离线参数记录。

1.5.

2.5根据记录数据进行发酵全过程分析，得出结论。

2.结果与分析

2.1 图1为碱性蛋白酶活力测定标准曲线，由R2=0.9996可知该标准曲线置信度高，能用它的方程y=0.0092x-0.0015求吸光常数K。图中的y即为吸光度，当y=1时，由酶活计算公式X= A680×K×4×N/10