枯草芽孢杆菌发酵过程控制及最优碳源筛选
饲用枯草芽孢杆菌发酵工艺的优化及菌剂制备
饲用枯草芽孢杆菌发酵工艺的优化及菌剂制备吴东;刘惠琴;徐力;田永强【摘要】[目的]为饲用枯草芽孢杆菌的大规模生产奠定基础.[方法]通过单因素试验和正交试验,对发酵培养基配方及其发酵条件进行优化.[结果]饲用枯草芽孢杆菌的最佳培养基为:葡萄糖3％、酵母浸膏1.5％、磷酸氢二钠0.2％、磷酸二氢钠0.1％、硫酸镁0.1％、酵母浸粉0.5％.饲用枯草芽孢杆菌的的最适发酵条件为:温度38℃,初始pH7.0 ～7.2,摇床转速180 r/min,接种量7％.选择木屑质量与发酵液体积(m/V)的混合比为3∶5,继续高温发酵16 h,芽饱产量可达到5.18×1010CFU/g.[结论]该研究可为饲用枯草芽孢杆菌的工业化生产提供了数据支持.【期刊名称】《安徽农业科学》【年(卷),期】2015(000)019【总页数】4页(P134-137)【关键词】枯草芽孢杆菌;发酵工艺;优化;菌剂;制备【作者】吴东;刘惠琴;徐力;田永强【作者单位】兰州交通大学化学与生物工程学院,甘肃兰州730070;兰州交通大学化学与生物工程学院,甘肃兰州730070;兰州交通大学化学与生物工程学院,甘肃兰州730070;兰州交通大学化学与生物工程学院,甘肃兰州730070【正文语种】中文【中图分类】S816.6饲用抗生素的使用在我国过去的很多年内对养殖业的发展作出了突出的贡献。
但是，随着社会和科技的发展，人们对食品安全越来越重视，抗生素产生一系列负面问题(如耐药性)，引起饲料用药及治疗用药量越来越高，并且过量使用抗生素容易导致动物生产能力降低［1］。
枯草芽孢杆菌是芽孢杆菌属的一种，由于其在自然界广泛分布，枯草芽孢杆菌产生孢子时能分泌许多种酶类物质和生长因子，稳定性极好，具有耐氧化、抗挤压、耐高温、耐酸等特征［2］。
此外，枯草芽孢杆菌抗逆性很强，能够储藏的时间较长，它在颗粒或粉料中都有较强的稳定性，也能够很通顺地进入动物的大小肠道生存并且能够大范围繁殖，是在微生物饲料添加剂中应用最为广泛的益生菌。
饲用枯草芽孢杆菌发酵条件的优化
０ １ 大豆 粕 １ 淀 粉 ０３ ３０ ％浓 度 的硫 酸锰 ． ％、 ０ ％、 ．％、．８
７５ ７８ ８ ，在接 种 量 ５ ，温 度 ３ ℃ ，转 速 ２ ０ ．、 ．、 ． ０ ％ ０ ２
１ 材 料 与 方 法
１１ 材 ． 料
供 试 菌种 为枯 草 芽孢 杆菌 ， 由湖南
ｒ ｎ条 件下 培养 ２ ， 定其 Ｄ 鲫 值 。 ３转 速对 ／ ｍｉ ４ｈ 测 Ｄ （）
生长 量 的影 响 ： 取 １０ ２ ０ ２ ０ ２ ０ ３ ０ｒ ｉ 选 ５ 、０ 、２ 、５ 、０ ｍ ｎ５ ／
的优化培养基为 ： 葡萄糖 Ｏ５ 淀粉 ０３ 豆粕 ３ 磷酸氢二钾 ０３ 磷酸二氢钾 ０１％、 ．％、 ．％、 ％、 ．％、 ．５ 硫酸镁 ００ ％、 ． ５ 酵母膏 ００ ％、 ．２ 氯化铁 ０ １ 碳酸钙 Ｏ０ ％、．８ ． ％、 ０ ．１ ３０ ％硫酸锰 ０２ｍ 。最适 发酵条件为： ． Ｌ 发酵 温度 ３ ℃， Ｏ 初始 ｐ ．～ ．， Ｈ ７０ ７２ 摇床转速 ２ ０ｒ ｉ ， ２ ｍ ｎ 接种量 １ ％。 ／ ０ 发酵罐放大培养最佳放罐时间 ２ — ２ｈ 获得的菌体数量 约为 １８亿／ 。 ０ ２ ， ５ ｍＬ
７２基 础 发酵 培养 基 ： ．； 淀粉 ０１％、 ．５ 葡萄 糖 ０５ 尿 ． ％、 素 ０１ 磷 酸 氢二 钾 ０３ 磷 酸 二 氢钾 ０１％、 ． ％、 ．％、 ． ５ 硫
酸 镁 ００ ％ 、 母 膏 ００ ％、 化 铁 ００ ％、 酸 钙 ． ５ 酵 ．２ 氯 ．１ 碳
养 ２ ， ４ｈ测定其 Ｏ 鲫值。（ ） Ｄ ４ 接种量对生长量 的影 响 ：选 取 接 种 量 １ 、 ％ 、％ 、％ 、０ 、５ ， ％ ３ ５ ７ １ ％ １ ％ 在 ３ ℃ ， 始 ｐ ．， 速 ２０ｒａｎ条 件 培 养 ２ ， Ｏ 初 Ｈ ７２ 转 ２ ／ ｉ ｒ ４ｈ
枯草芽孢杆菌的发酵过程优化及产物提取技术探究
枯草芽孢杆菌的发酵过程优化及产物提取技术探究枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）是一种广泛存在于自然界中的细菌，具有良好的生物学特性和产物应用潜力。
本文将探讨枯草芽孢杆菌的发酵过程优化以及产物提取技术的相关研究。
首先，枯草芽孢杆菌的发酵过程优化是实现高产产物的关键。
发酵过程中的温度、pH值、培养基组分以及氧气供应等因素对产物生成具有重要影响。
在温度方面，研究表明最适合枯草芽孢杆菌生长和产物生成的温度是37°C。
此外，维持适宜的pH值（通常在6-8之间）有助于促进产物的生成。
培养基组分方面，通常采用含有碳源、氮源、矿物盐和生长因子等成分的培养基。
合理设计培养基组分的配比及优化培养条件，可以提高产物的产量和质量。
此外，提供充足的氧气供应也是枯草芽孢杆菌发酵过程的关键环节，通过调节搅拌速度和增加氧气传递效率，可以最大限度地提高产物产量。
其次，产物提取技术是从发酵液中纯化并得到目标产物的重要步骤。
产物提取的目标是高效、高纯度地获得目标产物，并保证较低的成本和良好的产物质量。
常用的产物提取技术包括有机溶剂提取、沉淀法、离子交换法、超滤法等。
有机溶剂提取是最常用的方法之一，通过将发酵产物与合适的溶剂相混合，在适当的温度和压力下进行搅拌和分离，从而得到相对纯度较高的目标产物。
沉淀法是利用添加特定的盐类或聚合物使产物发生沉淀，利用离心或过滤等方式将沉淀物分离出来。
离子交换法则通过将产物溶液通过具有相应固定相的离子交换树脂柱，利用产物与树脂之间的吸附和解吸作用来完成分离和纯化。
超滤法则是利用不同分子量的孔膜实现对产物的分离和提纯。
根据产物的特性和需求，选择合适的提取方法来实现产物的高效提纯是非常重要的。
此外，为了进一步提高产物的产量和质量，还可以通过辅助策略来优化枯草芽孢杆菌的发酵过程以及产物的提取技术。
常用的辅助策略包括基因工程技术、发酵反应动力学研究、传质芯片技术等。
基因工程技术可以通过改造枯草芽孢杆菌的菌株，使其具有更高的产物生产能力。
枯草芽孢杆菌固体发酵条件优化
枯草芽孢杆菌固体发酵条件优化杨婷;廖美德;贺玉广;刘偲嘉【摘要】为研究初始pH、蛋白胨浓度和不同发酵底物对枯草芽孢杆菌生长的影响,对不同发酵底物进行液态和固态发酵试验,结果发现,pH为6.5～7.0时,细菌生长最快,pH为7.5～8.0时,蛋白酶的活性最强;蛋白胨1.6 g·L-1的LB培养基,枯草芽孢杆菌的生长状况最好,蛋白酶的活力也最强;豆粕是优质氮源,能显著促进枯草芽孢杆菌的生长和蛋白酶活性,豆粕20％、豆渣10％、麸皮60％和玉米粉30％作为固态发酵底物,枯草芽孢杆菌的生长速度最快,豆粕10％、豆渣10％、麸皮50％和玉米粉10％为固态发酵底物,枯草芽孢杆菌分泌的蛋白酶活力最强.【期刊名称】《饲料博览》【年(卷),期】2015(000)003【总页数】4页(P5-8)【关键词】枯草芽孢杆菌;发酵;正交实验【作者】杨婷;廖美德;贺玉广;刘偲嘉【作者单位】华南农业大学天然农药与化学生物学教育部重点实验室,广州510642;华南农业大学天然农药与化学生物学教育部重点实验室,广州 510642;华南农业大学天然农药与化学生物学教育部重点实验室,广州 510642;华南农业大学天然农药与化学生物学教育部重点实验室,广州 510642【正文语种】中文【中图分类】S816.6枯草芽孢杆菌是一类广泛分布于各种不同生活环境中的革兰氏阳性好氧型细菌，常作为益生菌添加在幼小动物日粮中，能够起到改善动物肠道菌群结构、提高消化酶活性、改善机体免疫功能以及提高生产性能的作用，对人畜无毒害作用，不污染环境[1-2]。
枯草芽孢杆菌可产生蛋白酶、α-淀粉酶、纤维素酶、β-葡聚糖酶、植酸酶、果胶酶和木聚糖酶等，对提高动物的饲料转化率、促进营养的消化吸收和预防疾病起到重要作用[3-5]。
目前，在工业化生产中，仍然存在发酵周期长、芽孢形成率低、成本高等问题。
本文在前人的研究基础上，以玉米粉、麸皮、豆粕、豆渣为原料，旨在寻找出一种高效经济的发酵底物，获得较高的枯草芽孢杆菌产量和酸性蛋白酶活力。
枯草芽孢杆菌B47菌株高产抗菌物质的培养基及发酵条件优化
微生物学通报SEP 20, 2011, 38(9): 1339−1346 Microbiology China© 2011 by Institute of Microbiology, CAS tongbao@*通讯作者：Tel: 86-771-3235674; : qqli5806@ 收稿日期：2011-01-10; 接受日期：2011-04-25研究报告枯草芽孢杆菌B47菌株高产抗菌物质的培养基及发酵条件优化叶云峰1,2黎起秦1*袁高庆1付岗3缪剑华2林纬1(1. 广西大学农学院广西南宁 530005)(2. 广西壮族自治区药用植物园广西南宁 530023)(3. 广西农业科学院微生物研究所广西南宁 530007)摘要: 枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis B47菌株为番茄内生细菌, 也是玉米小斑病拮抗菌, 能产生对玉米小斑病菌有强烈抑制作用的抗菌物质。
以B47菌株发酵液的无菌滤液对玉米小斑病菌的抗菌活性为检测指标, 测定B47菌株产抗菌物质培养所需的最佳碳、氮源和无机盐, 并通过正交试验法对该菌株产抗菌物质的培养基配方和摇瓶发酵条件进行优化。
研究结果表明, B47菌株产抗菌物质最佳碳、氮源和无机盐分别为蔗糖、酵母浸膏和MgSO4⋅7H2O, 最优培养基是YSB (Yeast extract-sucrose-beef extract)培养基, 其配方为: 蔗糖2%, 酵母浸膏2%, 牛肉浸膏1.5%, MgSO4⋅7H2O0.06%, FeSO4⋅7H2O 0.000 9%, 最优发酵条件组合为: 30 °C, pH 7.0, 170 r/min摇床培养6 d, 接种量为1%, 装液量为40 mL/200 mL。
关键词:枯草芽孢杆菌, 抗菌物质, 正交试验, 发酵条件优化Optimization of culture medium and fermentation conditions for high production of antimicrobial substance byBacillus subtilis strain B47YE Yun-Feng1,2LI Qi-Qin1* YUAN Gao-Qing1 FU Gang3 MIAO Jian-Hua2LIN Wei1(1. College of Agriculture, Guangxi University, Nanning, Guangxi 530005, China)(2. Guangxi Botanical Garden of Medicinal Plant, Nanning, Guangxi 530023, China)(3. Microbiology Research Institute, Guangxi Academy of Agricultural Sciences, Nanning, Guangxi 530007, China)Abstract: Bacillus subtilis strain B47 is an endophytic bacterium of tomato and can produce substance to inhibit the growth of Bipolaris maydis which can cause southern corn leaf blight. The optimal nitro-1340微生物学通报2011, Vol.38, No.9/wswxtbcngen source, carbon source and salt for the production of antimicrobial substance by strain B47 were tested. The medium composition and fermentation conditions were optimized by orthogonal experi-ments. The results showed that the optimal nitrogen source, carbon source and salt were yeast extract, sucrose and MgSO 4⋅7H 2O, respectively. The best medium was YSB (Yeast extract-sucrose-beef extract). The composition of the medium was 2% (W/V ) sucrose, 2% (W/V ) yeast extract, 1.5% (W/V ) beef ex-tract, 0.06% (W/V ) MgSO 4⋅7H 2O and 0.000 9% (W/V ) FeSO 4⋅7H 2O. The optimal fermentation condi-tions were the combination of temperature 30 °C, initial pH 7.0, incubation time 6 d, 1% inoculum volume percentage and medium volume 40 mL/200 mL.Keywords: Bacillus subtilis , Antimicrobial substance, Orthogonal experiment, Optimization of fermentation condition由玉米小斑离蠕孢菌Bipolaris maydis 引起的玉米小斑病曾于1968年在我国和1970年在美国大流行, 造成严重的经济损失[1−2]。
枯草芽孢杆菌菌株发酵生产工艺优化
３ 结论 风干燥箱 ，上海产，型号 Ｉ Ｏ １ Ａ 一 ３ ；电热恒温培养箱 ，上海产 ，型号 对于培养基的选择应该遵循原料取材方便 ， 来源广泛 ， 价格低廉的 Ｄ Ｈ Ｐ 一 ９ １ ６ ２ ； 垂直流超净工作 台， 上海产 ， 型号 ２ Ｈ Ｊ Ｈ 一 １ １ １ ２ ； 显微镜 ， 日 原则， 酵母膏、 酵母粉这类药品成本较高， 不适用于工业化生产。 本研究 本产 ， 型号 Ｎ ｉ ｋ ｏ ｎ — Ｙ Ｓ １ ０ ０ ； 手提式高压灭菌锅 ， 哈尔滨市医疗器械厂制 在通用培养基中添加了不同比例的的工农业副产品——豆饼粉和麸子 造； 可控温式摇床， 哈尔滨市东联科学仪器厂制造。 即适量的碳源和氮源 ， 根据发酵过程中枯草芽孢杆菌菌体数量的变 １ ． ４方法 。１ Ａ ． １ 菌种活化。 将保存的枯草芽孢杆菌移接到斜面试管 粉 ， 化 ， 得到最佳培养基配方， 即通用培养基 ＋ １ ． ５ ％豆饼粉 ＋ １ ｍ 麸皮 ， 利用 培养基 中， 在恒温培养箱 ３ ７ ±１ 。 ｃ 培养 ２ ４ ｈ 。１ ． ４ ． ２种子液的制备。 取一 这一配方， 生产 出了成本低廉 、 菌活数达 １ ８ 亿 ／ ｍｌ 以上的枯草芽孢杆菌 环 已活化完成斜 面菌种接人到三角瓶种子培养基 中， ５ ０ ０ ｍＬ三角瓶 达到了促进枯草芽孢杆菌菌株生长的目的， 增加了发酵液中菌体 中，装量为 １ ０ ０ ｍ Ｌ种子培养基 ， ３ ７± １ ｏ Ｃ ， １ ８ ０ ｒ ／ ｍｉ ｎ， 摇床 中震荡培养 菌剂 ， 数 量 和代谢 产物 ， 为 工业 化发 酵生 产 和大 面积 推广应 用 提供 充足 的 、 廉 ２ ４ ｈ 。１ ． ４ ． ３ 菌株发酵培养。取 ｌ ｍ Ｌ培养好的种子液， 以２ ％的接菌量ｆ 即 价 的微 生物 菌体及 发酵 菌液 。 在每 ｌ Ｏ Ｏ ｍｌ 的液体培养基 中接入 ２ ｍ ｌ 浓度为 ｌ ｘ ｌ Ｏ ｇ ｅ ｆ ｕ ／ ｍ ｌ 的发酵液汾 参 考文 献 别接入到 ｌ ５ 个（ 每种培养基 ３ 个） 装有 １ ０ ０ ｍ Ｌ发酵培养基的 ５ ０ ０ ｍＬ １ 阿 红， 蔡 学清， 洪永聪等． 辣椒内生细菌的分 离及拮抗菌的筛选ｌ Ｊ １ ． 中国 三角瓶 中， ３ ７ ±１ ℃， １ ８ ０ ｒ ／ ｍｉ ｎ ， 摇床中振荡培养 。 １ Ａ ． ４ 测定方法。 将各摇 ［
一株枯草芽孢杆菌的分离鉴定及其发酵条件优化
一株枯草芽孢杆菌的分离鉴定及其发酵条件优化一、引言枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）是一种常见的芽孢形成细菌，广泛存在于土壤、水体、植物表面等环境中。
枯草芽孢杆菌具有良好的免疫调节、抗菌、促生长等生物学特性，被广泛应用于农业、食品、医药等领域。
针对不同用途的需求，分离鉴定枯草芽孢杆菌并优化其发酵条件，能够提高其生物活性和产量，为其在实际应用中发挥更好的效果。
二、枯草芽孢杆菌的分离鉴定1.样品采集与处理首先，从自然环境、农田土壤或其他植物表面等样品中采集含有枯草芽孢杆菌的样品。
将样品带回实验室后，进行分离和处理，避免混杂其他细菌或真菌。
2.菌株分离将处理后的样品进行稀释，接种于富含培养基中，利用传统分离方法（如平板分离法、稀释平板法等）进行分离。
通过观察不同菌落形态和颜色，筛选出枯草芽孢杆菌单菌株。
3.生理生化鉴定对分离到的枯草芽孢杆菌进行生理生化鉴定，包括形态学观察、生长特性、氧化还原反应、产酶活性等。
利用生化试剂盒进行相关检测，确定菌株的生物学特性。
4.分子鉴定通过16SrRNA序列分析或蛋白质质谱鉴定等分子生物学方法，确认所分离到的枯草芽孢杆菌的属种分类，并与数据库中的已知菌株进行比对验证。
5.枯草芽孢杆菌存取将鉴定完成的枯草芽孢杆菌单菌株保存在甘油保存流质中，存放在-80°C低温冰箱中备用。
1.发酵基质的选择选择适宜的发酵基质对枯草芽孢杆菌的生长和代谢具有重要影响。
常用的基质包括葡萄糖、大豆粉、玉米粉等，可以根据具体需求进行配比调整。
2.发酵菌种培养条件通过扩种培养，将枯草芽孢杆菌预培养至指数生长期，然后接种至发酵罐中，保持较高的菌液浓度，有利于产酶和生长。
3.发酵条件的控制在发酵过程中，通过控制温度、pH值、通气速率、发酵时间等因素，调节菌体生长、产酶效率和产物生成速率。
通常，较适宜的发酵条件为温度37°C-42°C，pH值6.0-8.0，通气速率1.0-2.0L/min。
枯草芽孢杆菌发酵培养基及发酵条件优化
枯草芽孢杆菌发酵培养基及发酵条件优化焉兆萍，宋士良，陆克文(上海邦成生物工程有限公司，上海 201506)中图分类号：TQ920.6 文献标志码：A文章编号：1001-0769(2019)01-0051-05枯草芽孢杆菌是嗜温、好氧、产芽孢的革兰氏阳性杆状细菌，在自然界中广泛存在，对人畜无毒无害，且不污染环境；能产生多种抗菌物质和酶，具有广谱抗菌活性。
该菌已被我国农业农村部列入饲料添加剂目录名单，越来越多地被研制成微生物制剂，其制剂作为“绿色”饲料添加剂，在畜牧养殖业、饲料加工业中得到广泛应用，成为现代养殖业的一种常规添加剂，具有广阔的发展前景[1]。
枯草芽 孢杆菌在动物肠道内具有较强的生物夺氧能力，这对动物的营养物质利用、生长、防病起到重要作用[2]；其还可以通过产生抗体和提高嗜菌作用等，刺激免疫，激发体液免疫与细胞免疫，从而提高动物的生产性能和饲料利用率[3]。
由于枯草芽孢杆菌生长速度快、营养需求简单、易于存活、无致病性，具有良好的发酵基础，国内外已有众多学者对此菌进行了大量研究[4]。
本文通过单因素试验与正交试验，对枯草芽孢杆菌的发酵培养基和发酵条件进行了研究，确定其最佳发酵培养基和最适发酵条件，以最大限度地提高枯草芽孢杆菌的发酵菌数，降低生产成本，满足工业化发酵生产的要求。
1 材料与方法1.1 供试菌种枯草芽孢杆菌，由上海邦成生物工程有限公司菌种保藏室提供。
1.2 培养基LB固体培养基：蛋白胨10 g、酵母提取物5 g、葡萄糖5 g、氯化钠10 g、琼脂粉20 g、水1 000 mL，pH 7.2。
LB液体种子培养基：蛋白胨10 g、酵母提取物5 g、葡萄糖5 g、氯化钠10 g、水 1 000 mL，pH 7.2。
1.3 种子液的制备将菌种接种于LB固体培养基中，37 ℃恒温培养箱活化18 h后，挑取单菌落接入装有100 mL LB液体种子培养基的250 mL三角瓶中，37 ℃条件下180 r/min振荡培养24 h。
枯草芽孢杆菌培养基优化
05
数据分析与结果展示
数据处理方法介绍
数据清洗
对实验数据进行预处理，包括去 除异常值、缺失值和重复值，确
保数据准确性和可靠性。
数据转换
将实验数据转换为适合分析的形式 ，如将定性数据转换为定量数据， 或将多变量数据转换为一维数据。
枯草芽孢杆菌为好氧菌，需要充足的氧气供应才能正常生长。
溶氧量的调节方法
通过增加通气量、搅拌速度或使用生物反应器等方式提高培养基中的溶氧量。
溶氧量变化的优化
在培养过程中，通过监测和调整溶氧量，以获得最佳的菌体生长和产量。
光照强度控制与优化
光照强度对枯草芽孢杆菌生长的影响
01
光照强度对枯草芽孢杆菌的生长和代谢活动有一定影
碳源来源
尽量选择天然、易获取的 碳源，减少对环境的污染 。
氮源选择与优化
氮源种类
选择有机氮源或无机氮源，如蛋白胨、酵母膏、硫酸 铵等。
氮源浓度
优化氮源浓度，以获得最佳生长效果。
氮源来源
尽量选择天然、易获取的氮源，减少对环境的污染。
磷源选择与优化
1 2
磷源种类
选择磷酸盐、焦磷酸盐等作为磷源。
磷源浓度
拓展枯草芽孢杆菌的应用 领域
将优化后的培养基应用于其他微生物的培养 和生产过程中，提高微生物培养的效率和品 质，推动微生物产业的发展。
THANKS
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结果分析方法介绍
描述性统计
对实验数据进行描述性统计， 如求平均值、标准差、方差等 ，了解数据分布情况和变化规
律。
枯草芽孢杆菌发酵方法
枯草芽孢杆菌是一种广泛存在于自然环境中的益生菌，具有很强的生物防治能力，能够有效地对抗多种有害微生物，促进植物生长和提高产量。
而枯草芽孢杆菌的发酵方法对于生产和应用起着至关重要的作用。
枯草芽孢杆菌的发酵方法的核心步骤包括种子培养、发酵过程和发酵液收获。
下面我将按照从简到繁的顺序，逐步探讨这些步骤。
1. 种子培养种子培养是整个枯草芽孢杆菌发酵过程的起点。
选择一株活力强、菌液浓度高的枯草芽孢杆菌菌株。
将该菌株接种到适宜的培养基上进行预培养，以增加菌株数量。
预培养的时间和温度要根据具体情况而定，但通常在30-37摄氏度下静置培养24-48小时。
培养基的选择也很重要，常见的有蔗糖蛋白胨培养基和复合液体培养基。
2. 发酵过程发酵过程是枯草芽孢杆菌大规模生产的关键步骤。
将预培养好的种子菌液接种到大型发酵罐中，酒精发酵罐是一种常见的选择。
接种量的大小要根据发酵罐的容积和发酵需求进行合理调整，通常在5-10%左右。
接种后，利用适宜的培养基和培养条件（如温度、pH值、氧气供应等），进行连续或分批发酵。
在发酵过程中，菌株会迅速繁殖和产生代谢产物，如抗生素、激素、酶等。
这些代谢产物对枯草芽孢杆菌自身和植物都具有促进作用。
在发酵过程中，需要注意对发酵液的搅拌、通气和温度的控制，以保证菌株的良好生长和代谢产物的高效产生。
3. 发酵液收获在发酵过程结束后，需要对发酵液进行收获和提取。
停止菌液的搅拌和加热，然后通过过滤或离心等方法将菌体和固体物分离。
接下来，可以通过浓缩、纯化和干燥等工艺对发酵液进行加工处理，以获得高纯度和高活性的枯草芽孢杆菌制品。
除了基本的发酵方法外，还有一些优化的发酵技术值得关注。
可以通过添加生物碳源来促进枯草芽孢杆菌的生长和代谢产物的产生。
适当的控制发酵液中的pH值，可以提高菌株的生长速度和产量，同时减少杂质的形成。
还可以利用发酵代谢过程中产生的热能，实现能源的再利用，提高发酵过程的能效。
枯草芽孢杆菌的发酵方法是一个复杂的过程，需要精细的操作和严格的控制。
枯草芽孢杆菌的分离及筛选
枯草芽孢杆菌的分离及筛选枯草芽孢杆菌是一种常见的土壤细菌，广泛存在于自然环境中，可发酵多种有机物，在生物降解、环境清洁等方面有广泛应用。
本文将介绍枯草芽孢杆菌的分离及筛选方法。
一、土样采集与处理选择土壤样品时应注意，最好是新鲜土壤，不含过多杂质和残留农药、化学物质等。
首先，将土壤样品放入干净无菌试管中，并加入生理盐水，与搅拌器进行搅拌，使土壤悬浮于生理盐水中。
然后将其过滤，再将过滤液离心，离心后上清液即处理好的样品。
取样品1ml加入小培养皿中，加入适量的20%固体土壤样品，混匀后将其平均涂布于营养琼脂平板上，再进行孵育。
通常，孵育温度为30-37℃，培养基的选择可根据实验需要进行不同的调配。
通过枯草芽孢杆菌的鉴定，可判断其种类和特性。
可采用革兰染色法、形态学观察法、生理生化测定法等多种方法进行鉴定。
1. 革兰染色法：将菌落划入微滴水中，然后将其固定，加入革兰染色液，约定时间后用水冲净，用镜片沥干，用显微镜观察。
2. 形态学观察法：通过对菌落的形态、色素、形状、运动方式等特征进行观察，再与已知菌株进行对照，确定其种类和特性。
3. 生理生化测定法：可通过测定该菌株的生理生化特性，如酸碱反应、氧需求等，进一步确定其种类和特性。
1. 抗生素筛选：将分离得到的枯草芽孢杆菌接种于含有不同抗生素的墨汁琼脂平板上进行筛选，观察不同菌落的生长情况并记录，最终确定其抗性水平。
2. 发酵产物筛选：通过枯草芽孢杆菌的发酵产物、酶活性等特性，进行筛选。
将菌株接种于适当的发酵培养基中，培养一定时间后采集发酵产物进行分析。
3. 生化代谢产物筛选：通过分离并鉴定菌株代谢产物，确定其产物种类和达到的水平，寻找有价值的代谢产物。
综上所述，枯草芽孢杆菌的分离和筛选具有重要的应用价值，为生物降解、环境治理等领域开拓了新的途径。
希望本文对有关人员能够提供一些参考和帮助。
饲用枯草芽孢杆菌液体培养基的筛选与优化
100
1 号培养基
90
2 号培养基
3 号培养基
80
4 号培养基
70
60
50
40
30
20
10
0
10
14
18
22
26
30
34
38
测定时间 /h
图 1 KFL070505 菌株在不同培养基中的活菌数变化
2.2 KFL070505 对不同碳源的利用情况比较 从图 2 可见 ：该菌株对葡萄糖和牛肉膏利用效
果最好，蔗糖和麦芽糖次之，对乳糖的利用效果最 差，考虑到成本及生产实际情况，确定葡萄糖为其
2 号培养基（牛肉膏蛋白胨）：牛肉膏 0.5 %、 蛋白胨 1 %、K2HPO3 0.3 %、30.8 mg/L MnSO4 0.1 %、 CaCO3 0.7 %、MgSO4·7H2O 0.05 %、pH 7~7.2。
3 号培养基（土豆＋葡萄糖培养基）：土豆 20 %、 葡萄糖 2 %、K2HPO3 0.3 %、30.8 mg/L MnSO4 0.1 %、 CaCO3 0.7 %、MgSO4·7H2O 0.05 %、pH 7~7.2。
2（0.2）
2（0.7） 87.7 ＞ 85
3 1（1.0） 3（2.5）
3（0.3）
3（0.9） 70.3 ＞ 85
4 2（1.5） 1（1.5）
2（0.2）
3（0.9） 97.0 ＞ 85
5 2（1.5） 2（2.0）
1（0.1）
1（0.5） 83.7 ＞ 75
6 2（1.5） 3（2.5）
3（0.3）
3 讨论
枯草芽孢杆菌在饲料、肥料、医药及工业领域 都得到了广泛的应用。菌剂中的活菌数是衡量产品 质量好坏的关键指标。研究通过对液体培养基的 筛选与优化，得到了枯草芽孢杆菌 KFL070505 菌 株的最佳培养基，其成分为葡萄糖 1.5 %，蛋白胨 1.5 % ，K2HPO3 0.3 %，30.8 mg/L MnSO4 0.1 %， CaCO3 0.7 %，MgSO4·7H2O 0.05 %，FeCl3 0.01 %， pH 7~7.2，其活菌数超过 120 亿个 /mL，培养基成 分中对活菌数高低的影响顺序为蛋白胨＞ CaCO3 ＞ MnSO4 ＞葡萄糖。其中 CaCO3 对该菌株活菌数有较 大的影响，特别是对其芽孢率的影响较大，这与张 丽霞等的研究结果基本相似。
枯草芽孢杆菌发酵培养基优化培养实验
交实验 。摇床实验的结果见表 2 。
表 2 摇床实验的结果
培养基和检测项目
培养基 ①芽孢率( %) 活菌数( 亿/ 毫升)
培养基 ②芽孢率( %) 活菌数( 亿/ 毫升)
培养基 ③芽孢率( %) 活菌数( 亿/ 毫升)
培养基 ④芽孢率( %) 活菌数( 亿/ 毫升)
培养时间( 小时)
12
24
36
前 言
菌种处理 安培管菌种活化 :用无菌吸管吸取 013～015 毫
枯草芽孢杆菌( B acill us s ubtilis) 是我国农业部 允许作为饲料添加剂的两种芽孢杆菌之一 , 其已被
升无菌水滴入安培管 , 轻轻震荡使冻干菌体溶解成 悬浮状 ,取 011～012 毫升菌悬液涂于上肉汤培养基
④号培养基 :牛肉膏 013 %+ 蛋白胨 1 %+ 葡萄 糖 1 %+ 氯化钠 015 % + 淀粉 013 % + 3108 %浓度 的硫酸锰溶液 011 %;
以上所有各种培养基的 p H均调为 710～712 。 以上每种培基各做三瓶 , 装液量 100 毫升/ 500 毫升三角瓶 ,用四层纱布和牛皮纸包扎置立式压力 蒸汽消毒器中于 121 ℃灭菌 20 分钟 ,取出备用 。 摇瓶种子制备 :将在冰箱保存的种子在无菌室 内接入肉汤培养基中 , 在 37 ℃、每分钟 195 转的摇 床上振荡培养 12 小时 。 接种和培养 :培养好的种子液以 10 %接种量分 别接入四种不同培养基中 37 ℃振荡培养 , 每隔 12 小时检测一次 , 36 小时结束培养 。此过程重复 3 次。
·32 · 国外畜牧学 ———猪与禽 第 23 卷第 3 期 2003 年 5 月
硫酸镁 0105 %、酵母膏 0102 %、氯化铁 0103 正交实验的结果
枯草芽孢杆菌发酵过程控制及最优碳源筛选
枯草芽孢杆菌发酵过程控制及最优碳源筛选=========（+++++农业与生物技术学院 ++ 111111）摘要：本实验通过福林试剂法检测枯草芽孢杆菌中碱性蛋白酶的活性，旨在筛选出培养枯草芽孢杆菌时的最优碳源和掌握培养枯草芽孢杆菌基本的发酵过程控制，为今后进一步提高枯草芽孢杆菌产碱性蛋白酶提供可靠地参考数据。
关键词：酶活、最优碳源、碱性蛋白酶。
引言：碱性蛋白酶是指在pH值为碱性的条件下水解蛋白质肽键的酶类,其最适pH值一般为9～11,属内肽酶中的丝氨酸蛋白水解酶类,除可催化蛋白质水解为氨基酸外,在有机溶剂中还可催化多肽的合成[1]。
它在商业中的巨大应用前景及在基础研究中的重要作用,吸引着国际国内的许多公司及研究单位竞相对其进行多方面的研究[2]。
微生物蛋白酶均为胞外酶,与动、植物源蛋白酶相比具有下游技术处理相对简单、价格低廉、来源广、菌体易于培养、产量高、高产菌株选育简单、快速、具有动植物蛋白酶所具有的全部特性,同时易于实现工业化生产[3]。
而且碱性蛋白酶比中性蛋白酶具有更强的水解能力和耐碱能力,有较大耐热性且有一定的酯酶活力[4]。
枯草芽孢杆菌是生产碱性蛋白酶的传统菌株,具有产蛋白酶量大,耐高温、高碱等特点,因此对枯草芽孢杆菌碱性蛋白酶的研究成为蛋白酶研究的热点[5]。
我国研究和生产的碱性蛋白酶的活力水平虽然不断提高,但大多数采用进口的碱性蛋白酶制剂,并且大规模工业生产中用的碱性蛋白酶还是主要依赖进口[6]。
本实验通过碳源优化枯草芽孢杆菌发酵培养基和探究培养枯草芽孢杆菌基本的发酵过程控制,以期进一步提高枯草芽孢杆菌所产碱性蛋白酶粗酶的活力。
1. 材料与方法1.1 菌株：枯草芽孢杆菌1.2 材料与试剂酪氨酸、福林试剂、三氯乙酸、无水碳酸钠、干酪素、氯化钙、酵母浸粉、柠檬酸钠、磷酸氢二钾、蛋白胨1.3 仪器与设备恒温水浴锅、分光光度计、高速离心机、摇床、超净工作台、15L发酵罐、PHS-25型酸度计、振荡培养箱、压力灭菌锅。
枯草芽孢杆菌发酵培养基及发酵条件优化
枯草芽孢杆菌发酵培养基及发酵条件优化作者：焉兆萍宋士良陆克文来源：《国外畜牧学·猪与禽》2019年第01期摘; 要：本文对枯草芽孢杆菌的发酵培养基和发酵条件进行了筛选优化。
采用单因素试验和正交试验方法，确定该枯草芽孢杆菌的优化培养基为：豆粕40 g/L、玉米粉20 g/L、葡萄糖15 g/L、磷酸氢二钾3 g/L、磷酸二氢钾1.5 g/L、硫酸镁0.5 g/L、硫酸铵0.35 g/L、酵母浸粉0.2 g/L、硫酸锰0.2 g/L、硫酸亚; ;铁0.1 g/L、碳酸钙0.1 g/L。
最适发酵条件为：初始pH 7.2，接种量5%，发酵温度35 ℃，摇床转速250 r/min。
关键词：枯草芽孢杆菌;发酵培养基;发酵条件中图分类号：TQ920.6 文献标志码：A 文章编号：1001-0769（2019）01-0051-05枯草芽孢杆菌是嗜温、好氧、产芽孢的革兰氏阳性杆状细菌，在自然界中广泛存在，对人畜无毒无害，且不污染环境;能产生多种抗菌物质和酶，具有广谱抗菌活性。
该菌已被我国农业农村部列入饲料添加剂目录名单，越来越多地被研制成微生物制剂，其制剂作为“绿色”饲料添加剂，在畜牧养殖业、饲料加工业中得到广泛应用，成为现代养殖业的一种常规添加剂，具有广阔的发展前景[1]。
枯草芽; 孢桿菌在动物肠道内具有较强的生物夺氧能力，这对动物的营养物质利用、生长、防病起到重要作用[2];其还可以通过产生抗体和提高嗜菌作用等，刺激免疫，激发体液免疫与细胞免疫，从而提高动物的生产性能和饲料利用率[3]。
由于枯草芽孢杆菌生长速度快、营养需求简单、易于存活、无致病性，具有良好的发酵基础，国内外已有众多学者对此菌进行了大量研究[4]。
本文通过单因素试验与正交试验，对枯草芽孢杆菌的发酵培养基和发酵条件进行了研究，确定其最佳发酵培养基和最适发酵条件，以最大限度地提高枯草芽孢杆菌的发酵菌数，降低生产成本，满足工业化发酵生产的要求。
枯草芽孢杆菌的发酵
枯草芽孢杆菌的发酵学院：化工学院专业：生物工程班级：生物10-2 ：霞摘要枯草芽孢杆菌是我国农业部允许作为饲料添加剂的15 种菌种之一, 其已被越来越多地制成饲用微生态制剂。
因其制剂是无毒、无残留、无污染的“绿色” 添加剂，故具有广阔的发展前景，并已在畜牧业、饲料业广泛应用，显示巨大的社会效益和生态效益。
通过摇床培养筛选出较适宜于枯草芽孢杆菌发酵的培养基配方，发酵培养基配方确定后，在摇床条件下，通过对温度、初始ｐＨ值、初始接种量、装液量、摇床转速等发酵条件的摸索，确定最佳发酵条件。
在摇瓶条件下优化发酵培养基和发酵工艺后，采用发酵罐进行发酵培养，对枯草芽孢杆菌在液体发酵过程中的菌体数量、ｐＨ值、总糖含量和总氮含量四个因素随时间的变化进行了观察。
枯草芽孢杆菌，是芽孢杆菌属的一种。
单个细胞0.7 ～0.8×2～3 微米，着色均匀。
无荚膜，周生鞭毛，能运动。
革兰氏阳性菌，芽孢0.6 ～0.9 ×1.0 ～1.5 微米，椭圆到柱状，位于菌体中央或稍偏，芽孢形成后菌体不膨大。
菌落表面粗糙不透明，污白色或微黄色。
枯草芽孢杆菌菌体生长过程中产生的枯草菌素、多粘菌素、制霉菌素、短杆菌肽等活性物质，这些物质对致病菌或源性感染的条件致病菌有明显的抑制作用。
枯草芽孢杆菌迅速消耗环境中的游离氧，造成肠道低氧，促进有益厌氧菌生长，并产生乳酸等有机酸类，降低肠道pH 值，间接抑制其它致病菌生长。
枯草芽孢杆菌菌体自身合成α- 淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶、纤维素酶等酶类，在消化道中与动物体的消化酶类一同发挥作用，能合成维生素B1、B2、B6、烟酸等多种B 族维生素，提高动物体干扰素和巨噬细胞的活性，在饲料中应用广泛。
它还可以用来改善水质，应用在污水处理和环境保护中。
和其它微生物混合使用，还可以用于生物肥料和土地改良等关键词：枯草芽孢杆菌生长发酵活菌数第一章材料与方法1.1材料1.1.1菌种枯草芽孢杆菌1.1.2培养基（1）LB培养基：蛋白胨10g，酵母膏5g，NaCl10g，蒸馏水1000ml，pH 为7，（可溶性淀粉20g）琼脂20g。
枯草芽孢杆菌生物饲料发酵参数的优化
产植酸酶枯草芽孢杆菌生物饲料发酵参数的优化摘要研究旨在优化产植酸酶枯草芽孢杆菌生物饲料的发酵参数，试验采用 4 因子 5 水平正交设计和二因子有重复观察值的设计方法进行，通过测定发酵底物中的植酸酶活性，确定生物饲料发酵条件参数和发酵底料组成及接种比例。
研究结果表明，产植酸酶枯草芽孢杆菌生物饲料优化发酵条件参数为温度 37 ℃，时间周期 72 h，底物初水分 30 %，初始 pH 7. 0; 底料组成和接种量的优化结果: 底料组成为棉粕 90 %和玉米 10 %; 接种量为 7. 0 mL/100 g。
关键词枯草芽孢杆菌发酵饲料发酵参数棉粕中图分类号: S 816. 7 文献标志码: A 文章编号: 1002 －2813 ( 2013) 01 －0027 －05棉籽饼粕饲料中含有植酸抗营养因子，植酸的存在会对棉籽饼粕作为饲料的生物学效价产生一定的影响力。
植酸会对动物在自身所必需的矿物质吸收利用上产生一系列的阻碍作用，如: 引发动物厌食、消瘦和生长缓慢等病症; 其次棉籽中的植酸减少了有效磷的利用率; 再次植酸还会影响动物对蛋白质的消化利用。
饲料中添加植酸酶对提高畜禽业生产效益及降低植酸磷对环境的污染有重要意义。
研究以产植酸酶枯草芽孢杆菌为菌种，以棉粕、玉米和麸皮为发酵底料，通过正交试验设计法，对枯草芽孢杆菌发酵饲料的发酵温度、时间、底物初始水分和初始 pH 等 4 个参数进行优化; 以棉粕和玉米为发酵底物，通过二因子有重复观察值的设计方法，对发酵底料组成和接种量进行优化，最终确定枯草芽孢杆菌发酵饲料发酵工艺参数，为生产优质生物发酵饲料奠定基础。
1 材料与方法1.1 试验样品及处理棉粕、玉米粉和麸皮: 均由新疆石河子天康饲料有限公司提供，粉碎，过 60 目筛。
产植酸酶枯草芽孢杆菌生物饲料添加底物 100 g，底物中棉粕∶玉米粉∶麸皮为 7∶2∶1。
菌株: 产植酸酶枯草芽孢杆菌 Z3，由新疆石河子大学动物营养实验室选育。
工业上枯草芽孢杆菌筛选思路及流程
工业上枯草芽孢杆菌筛选思路及流程下载温馨提示:该文档是我店铺精心编制而成，希望大家下载以后，能够帮助大家解决实际的问题。
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枯草芽孢杆菌发酵培养基的优化
枯草芽孢杆菌发酵培养基优化作者姓名专业指导教师姓名专业技术职务目录摘要 (1)ABSTRACT (2)第一章绪论 (3)1.1枯草芽孢杆菌简介 (3)1.2枯草芽孢杆菌的应用 (3)1.2.1枯草芽孢杆菌在工业酶生产中的应用 (3)1.2.2枯草芽孢杆菌在生物防治领域中的应用 (3)1.2.3枯草芽孢杆菌在微生物添加剂领域中的应用 (4)1.2.4 枯草芽孢杆菌在医药方面的应用 (4)1.2.5 枯草芽孢杆菌在水产中的应用 (4)1.2.6枯草芽孢杆菌是微生物学与分子生物学研究的良好试验材料 (5)1.2.7枯草芽孢杆菌在环境保护方面的应用 (5)1.3 国内外的研究现状与发展趋势 (6)1.4研究的思路、目的及意义 (7)第二章材料与方法 (7)2.1实验材料 (7)2.1.1 菌株鉴定 (7)2.1.2 培养基 (7)2.1.3 主要设备 (8)2.2 培养基的优化 (9)2.2.1 培养方法 (9)2.2.2实验流程 (9)2.2.3实验方法 (10)2.2.4正交试验 (11)第三章结果和分析 (11)3.1 鉴定结果如下 (11)3.2 枯草芽孢杆菌最优化培养基正交实验结果 (16)3.3 pH变化曲线（以G18为例） (19)3.4 实验总结 (25)致谢 (27)摘要枯草芽孢杆菌是主要的饲用益生菌菌株，本论文以两株枯草芽孢杆菌G18和G21培养的延滞期和倍增时间为评价指标，通过三角瓶摇床培养，进行了两因素三水平的正交试验，对发酵培养基主要组分进行了优化，豆粕处理的蛋白酶加量2u/g 豆粕、5u/g豆粕、10u/g豆粕和玉米浆添加量0.5%、1.0% 、1.5% 做两个因素三水平的正交实验，研究表明：G18最佳培养基是：葡萄糖0.5%，淀粉3%，豆粕3%，玉米浆1.0%，破壁酵母0.5%，磷酸氢二钠0.2%，硫酸镁0.1%，硫酸锰0.01%，普通a淀粉酶2u/g淀粉，蛋白酶添加量10u/g豆粕。
讨论给出发酵法生产枯草杆菌的实施方案
讨论给出发酵法生产枯草杆菌的实施方案讨论：发酵法生产枯草杆菌的实施方案引言：枯草杆菌（Bacillus subtilis）是一种广泛存在于自然界中的细菌，具有良好的生物学特性和应用潜力。
发酵法是生产枯草杆菌的主要方法之一，本文将讨论该方法的实施方案。
一、菌种的选择和培养：1. 选择优良的枯草杆菌菌株，如具有高活性和产量的菌株。
2. 在培养基中培养菌株，培养基的组成应包括碳源、氮源、无机盐和适当的辅助因子。
3. 优化培养条件，如温度、pH值、培养时间等，以提高菌株的生长和产量。
二、发酵罐的选择和准备：1. 选择适合的发酵罐，根据生产规模和要求选择合适的罐体容积。
2. 确保发酵罐具备良好的通气性和搅拌性能，以促进菌株的生长和代谢。
3. 对发酵罐进行清洗和消毒，以确保无菌环境。
三、发酵过程的控制：1. 菌种接种：将培养好的菌株接种到发酵罐中，接种量应根据菌株特性和发酵罐容积进行合理调整。
2. 发酵培养基的添加：根据发酵罐的容积和菌株特性，按照一定比例添加发酵培养基，以提供菌株生长所需的营养物质。
3. 控制发酵条件：包括温度、pH值、氧气供应、搅拌速度等。
根据菌株特性和生产要求，合理调节这些参数，以促进菌株的生长和代谢。
4. 监测发酵过程：定期采样，检测菌株的生长情况、代谢产物的积累等指标，及时调整发酵条件，以确保发酵过程的顺利进行。
四、产物的提取和纯化：1. 发酵结束后，将发酵液从发酵罐中取出。
2. 采用适当的方法对发酵液进行初步提取，如离心、过滤等，以去除杂质和细胞残渣。
3. 进一步对提取液进行纯化，可采用柱层析、凝胶过滤等技术，以获得纯度较高的枯草杆菌产品。
五、产品的质量控制：1. 对产品进行理化指标的测试，如活菌数、产物含量等。
2. 进行微生物安全性评估，确保产品的安全性和稳定性。
3. 进行稳定性和保存条件的研究，制定适当的保存和使用方法。
六、应用领域和前景：枯草杆菌具有广泛的应用领域，如农业、环境保护、食品工业等。
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枯草芽孢杆菌发酵过程控制及最优碳源筛选=========（+++++农业与生物技术学院++ 111111）摘要：本实验通过福林试剂法检测枯草芽孢杆菌中碱性蛋白酶的活性，旨在筛选出培养枯草芽孢杆菌时的最优碳源和掌握培养枯草芽孢杆菌基本的发酵过程控制，为今后进一步提高枯草芽孢杆菌产碱性蛋白酶提供可靠地参考数据。
关键词：酶活、最优碳源、碱性蛋白酶。
引言：碱性蛋白酶是指在pH值为碱性的条件下水解蛋白质肽键的酶类,其最适pH值一般为9～11,属内肽酶中的丝氨酸蛋白水解酶类,除可催化蛋白质水解为氨基酸外,在有机溶剂中还可催化多肽的合成[1]。
它在商业中的巨大应用前景及在基础研究中的重要作用,吸引着国际国内的许多公司及研究单位竞相对其进行多方面的研究[2]。
微生物蛋白酶均为胞外酶,与动、植物源蛋白酶相比具有下游技术处理相对简单、价格低廉、来源广、菌体易于培养、产量高、高产菌株选育简单、快速、具有动植物蛋白酶所具有的全部特性,同时易于实现工业化生产[3]。
而且碱性蛋白酶比中性蛋白酶具有更强的水解能力和耐碱能力,有较大耐热性且有一定的酯酶活力[4]。
枯草芽孢杆菌是生产碱性蛋白酶的传统菌株,具有产蛋白酶量大,耐高温、高碱等特点,因此对枯草芽孢杆菌碱性蛋白酶的研究成为蛋白酶研究的热点[5]。
我国研究和生产的碱性蛋白酶的活力水平虽然不断提高,但大多数采用进口的碱性蛋白酶制剂,并且大规模工业生产中用的碱性蛋白酶还是主要依赖进口[6]。
本实验通过碳源优化枯草芽孢杆菌发酵培养基和探究培养枯草芽孢杆菌基本的发酵过程控制,以期进一步提高枯草芽孢杆菌所产碱性蛋白酶粗酶的活力。
1.材料与方法1.1菌株：枯草芽孢杆菌1.2材料与试剂酪氨酸、福林试剂、三氯乙酸、无水碳酸钠、干酪素、氯化钙、酵母浸粉、柠檬酸钠、磷酸氢二钾、蛋白胨1.3仪器与设备恒温水浴锅、分光光度计、高速离心机、摇床、超净工作台、15L 发酵罐、PHS-25型酸度计、振荡培养箱、压力灭菌锅。
1.4 培养基种子培养基(g/L)：胰蛋白栋5g/L、葡萄糖10g/L、酵母浸粉5g/L、K2HPO4 18g/L ,pH 值自然，121℃蒸气灭菌20min；发酵培养基(g/L)：酵母浸粉10 g/L、糊精100 g/L、柠檬酸钠3 g/L、蔗糖20 g/L 、K2HPO4 18g/L 、CaCl2 3 g/L, pH 值自然，115℃与发酵罐一起进行实消，20min。
1.5方法1.5.1 不同碳源对枯草芽孢杆菌的影响1.5.1.1配制培养基（20mL/150mL）准确秤取0.2g酵母浸粉、0.06g柠檬酸钠、0.2g磷酸氢二钾、0.06g 氯化钙5份分别加入0.6g蔗糖、0.6g麦芽糖、0.6g葡萄糖、1.1g乳糖、1.1g糊精，最后取20mL自来水，PH自然，配制成20ML/150mL 的培养基，塞好棉塞，包扎后进行高压真气灭菌（121℃蒸气灭菌20min）1.5.1.2 接种用移液枪吸取0.62mL菌种至培养基上，置摇床35℃，200r/min 恒温培养48h。
将发酵液12000r/min离心10min，上清液即为粗酶液。
1.5.1.3 酶活力的测定1.5.1.3.1标准曲线的制作取12支试管，按表1加入试剂（每支重复一次），混匀，再加入1mL福林试剂摇匀，置40℃水浴20min，于分光光度计680nm处测定样品的A680值。
以不含酪氨酸的0号管作为空白。
表1 标准曲线制备试剂管号酪氨酸浓度酪氨酸使用水/mL0.4moL/L( µg/ML )溶液( µg/ML )NaCO30 0 0.0 1.0 51 10 0.1 0.9 52 20 0.2 0.8 53 30 0.3 0.7 54 40 0.4 0.6 55 50 0.5 0.5 51.5.1.3.2样品酶活测定方法取碱性蛋白酶的菌种发酵液10mL于离心管中，12000r/min离心15min后，分别吸取上清液1mL稀释至10、25、50倍。
取试管7支（一支为空白管，样品重复2次），各加入稀释好的样品1mL，40℃水浴预热3min,再加入同样预热过的1%酪蛋白液1mL,精确反应10min,加0.4moL/L三氯乙酸2mL终止反应混匀，水浴沉淀15min后过滤，吸滤液1ML,加入0.4moL/L Na2CO3 5mL混匀，再加入1mL福林试剂摇匀，置40℃水浴20min。
空白测定同上，但在加酪蛋白之前先加0.4moL/L三氯乙酸2mL。
以空白对照，用分光光度计680nm波长下测样品的A680，选出最优碳源。
1.5.2 对枯草芽孢杆菌发酵过程控制的探究1.5.2.1按实验材料中种子培养基的组分制备好种子培养基，控温到接菌温度时，进行接菌。
接菌后置于摇床上培养24h，备用。
1.5.2.2按实验材料中发酵培养基的组分制备好发酵培养基，进行电极（PH电极、溶氧电极）标定。
将制备好的发酵液由进料口加料，然后在115℃下实消20min。
1.5.2.3降温到接菌温度接菌，控制变温恒溶氧条件进行发酵。
1.5.2.4 发酵过程控制前基本参数记录，发酵过程直接参数记录，发酵离线参数记录。
1.5.2.5根据记录数据进行发酵全过程分析，得出结论。
2.结果与分析2.1 图1为碱性蛋白酶活力测定标准曲线，由R2=0.9996可知该标准曲线置信度高，能用它的方程y=0.0092x-0.0015求吸光常数K。
图中的y即为吸光度，当y=1时，由酶活计算公式X= A680×K×4×N/10得x=108.86µg/mL。
2.2 表1 为枯草芽孢杆菌生长在5种碳源下的A680值，由酶活计算公式X= A680×K×4×N/10得乳糖为最优碳源，蔗糖次之。
表1 5种碳源下的A680值碳源稀释50倍时的A680值稀释50倍时的A680值麦芽糖0.379 0.250糊精0.355 0.259乳糖0.466 0.268葡萄糖0.374 0.256蔗糖0.390 0.2622.3.1图2枯草芽孢杆菌发酵过程部分参数图（因为接种后12h，才开始对发酵数据进行记录并整理分析，所以该图只反映发酵过程的部分）。
2.3.2发酵罐从接种开始发酵，前14h无数据记录，为了作图方便将第14h，在图1横坐标标为00：01，特此说明。
2.3.3发酵过程控制的是最优碳源次之的蔗糖在变温恒溶氧条件下，进行的枯草芽孢杆菌发酵碱性蛋白酶的探究。
2.3.4图2中的OD600可以反映发酵过程菌体的生长情况，酶活可以反映菌体的生产情况。
本实验将溶氧和转速偶联在一起，所以转速的高低也就反映了菌体呼吸强度的大小。
实验中的所有参数分析如下：2.3.4.1 OD600反映菌浓。
当第一次（也即开始发酵第14h）记录数据时，OD600达到0.983。
第二次记录数据时OD600突然减小到0.273，缘于发酵开始第12h，加入消泡剂（植物油）过量，大多菌因为猛然的供氧不足造成大批菌体死亡。
随着基质中蔗糖的浓度降低经历了4h后部分菌开始利用消泡剂作为碳源，致使第三次OD600又显著上升至0.988。
之后，OD600又逐渐下降，但并非消泡剂被耗光。
若消泡剂耗光菌体发酵产生的酶蛋白必然使得发酵罐中泡沫上升，但在后续试验中并未观察到这一现象。
说明氮源或者其他营养成分短缺，成为了菌体生长的限制因子。
2.3.4.2酶活反映菌的生产能力。
酶属于初级代谢产物，主要产生于对数期。
由于受消泡剂影响，歪打正着，为我组实验创造了新的对数期（图1中的02：06~04：03），此时，随着OD600上升，酶活也在上升，再次验证了酶属于初级代谢产物，主产于对数期。
之后随着培养条件恶化，酶开始失活。
再后来，酶又开始上升的原因是部分菌发生变异，开始利用产物酶作为氮源（也即证实了大批量菌死亡的缘故是培养基中可利用氮源酵母浸粉的匮乏），菌体浓度OD600和酶活又开始缓慢上升。
2.3.4.3转速反映菌体代谢强度。
对数生长期是进行物质大量合成的时期，枯草芽孢杆菌为需氧型菌，需要氧化反应提供ATP的合成，发酵后期的呼吸强度应有所降低，但后期菌体量大，所以耗氧量也大。
2.3.4.4本实验DO%与转速偶联，再不必分析。
从记录数据时温度恒定，也不比分析。
2.3.4.5本实验中的PH由表2发酵过程各项参数可知，总体来看从5.56~7.39，说明碱性蛋白酶对培养基PH有较为显著的提高，今后做实验要慎重考虑。
表2 发酵过程各项参数时间温度℃转速r/min OD600×10-3 DO% PH 稀释倍数酶活U/ML 00:01 32 257 0.983 28.6 5.56 25 319.8502:06 31.9 603 0.273 27.6 6.25 25 499.2304:03 32 751 0.988 24.4 6.67 25 847.2506:00 31.8 583 0.853 28.3 7.03 25 377.2808:00 31.9 551 0.228 27.4 7.66 25 422.1910:01 31.9 509 0.087 28.8 7.54 25 396.1311:58 31.9 487 0.114 29 6.97 25 391.5613:48 31.9 451 0.247 30.5 6.98 25 444.0622:00 31.9 325 0.136 33.7 6.43 25 531.1223:59 31.9 366 0.212 34.1 7.39 25 651.883.结论3.1采用枯草芽孢杆菌为发酵菌株，用枯草芽孢杆菌生长在5种碳源下的A680值，由酶活计算公式X= A680×K×4×N/10得乳糖为最优碳源，蔗糖次之。
3.2 确定了最佳培养基配方和最适发酵条件，最后得到最佳培养基为酵母浸粉10 g/L、糊精100 g/L、柠檬酸钠3 g/L、蔗糖20 g/L 、K2HPO4 18g/L 、CaCl2 3 g/L, pH 值自然，最佳培养条件为变温恒溶氧发酵36h，碱性蛋白酶酶活力可达847.25U/mL。