质粒提取有关问题及注意点
分子生物学实验中常见的问题与对策-9
分⼦⽣物学实验中常见的问题与对策-9⼀、质粒提取常见问题分析与策略1.⽤试剂盒未提出质粒或质粒得率低有哪些原因？1）细菌⽼化请凃布平板培养后，重新挑选新菌落进⾏液体培养。
2）细菌培养物⽣长过度或不新鲜不要于37℃培养超过16⼩时，分离质粒前长时间存放培养物是不利的。
3）质粒拷贝数低由于使⽤低拷贝数载体引起的质粒DNA提取量低，可更换具有相同功能的⾼拷贝数载体。
4）菌体中⽆质粒有些菌体本⾝不能在某些菌种中稳定存在，经多次转接后有可能造成质粒丢失。
例如柯斯质粒在⼤肠杆菌中长期保存不稳定，因此不要频繁转接，每次接种时应该接种单菌落。
另外检查筛选⽤抗⽣素使⽤浓度是否正确。
5）菌体过量，碱裂解不充分取样时菌液过多，导致菌体裂解不充分，可减少菌体⽤量或增加溶液悬浮液、裂解液、中和液的⽤量。
对低拷贝数质粒，提取时可加⼤菌体⽤量并加倍增加溶液悬浮液、裂解液、中和液的⽤量（应保持1：1：1.4⽐例）。
6）溶液使⽤不当溶液裂解液、中和液在温度较低时容易出现盐析，如出现，应将其放⼊37℃⽔浴⾄完全溶解、澄清，⽅可使⽤。
7）质粒未全部溶解（尤其质粒较⼤时）洗脱溶解质粒时，可适当加温或延长溶解时间。
8）⼄醇残留洗涤液Ⅱ洗涤后应离⼼并静置数分钟尽量去除残留⼄醇后，再加⼊洗脱液洗脱回收。
9）洗脱液加⼊位置不正确洗脱液应加⼊吸附柱中膜的中央以确保洗脱液完全覆盖吸附膜的表⾯达到最⼤洗脱效率。
10）洗脱效率：洗脱效率与洗脱液PH值、洗脱液⽤量、洗脱次数、加⼊洗脱液后的静置时间和是否预热等因素有关。
PH7.0－8.5之间，洗脱液⽤量不得⼩于50µl，重复洗脱2-3次，增加室温静置时间及65℃⽔浴预热可以有效提⾼得率30%。
2.试剂盒提取质粒纯度不⾼，如何解决？1）有蛋⽩质污染应在加⼊去蛋⽩液后，以⾜够⾼的转速离⼼，使沉淀紧密，并⼩⼼地吸取上清液，避免吸⼊沉淀。
另外，不要使⽤过多菌体。
经悬浮液、裂解液、中和液处理，离⼼后溶液应为澄清的，如果还混有微⼩蛋⽩悬浮物可再次离⼼去除后再进⾏下⼀步骤。
质粒DNA提取实验常见问题解答
质粒DNA提取实验常见问题解答1.加入solution.III，经10分钟离心后细菌沉淀怎么不结实，有的漂浮在液面，有的贴在离心管壁上，一摇晃即破碎脱落下来？细菌的用量太少，导致产生的沉淀主要是盐分的沉淀，因为缺少变性的细菌蛋白和细菌基因组DNA 的缠绕，沉淀就显得不结实。
解决方法：将细菌的用量增加。
2.加入soln.III，经10分钟离心后细菌沉淀怎么不结实，呈大块的水泡状，上清较少？（1）使用了过多的细菌，导致菌体未被有效裂解。
解决方法：将细菌用量减半。
（2）细菌悬浮不充分,存留小菌块,导致菌体未被有效裂解。
解决方法：注意将细菌悬浮充分。
（3）加Solution III后中和不充分。
解决方法：如果细菌用量较多，请注意多翻转几次直至中和后的沉淀呈松散的豆腐花状(也可以稍用力混合直至沉淀呈松散的豆腐花状)。
（4）Solution II出现沉淀。
解决方法：如果实验室内温度低于15℃，使用试剂盒前请注意观察Solution II中是否出现沉淀。
如果出现沉淀，请于37℃水浴溶解沉淀后再使用。
（5）Solution II 长时间暴露于空气中被CO2中和，导致菌体未能被有效裂解。
解决方法：可用经典碱裂解法抽提质粒DNA方法中的II液替代Solution II使用。
3.出现严重的RNA污染？（1）未在Solution I中事先加入RNase A1。
解决方法：补加RNase A1。
（2）加入RNase A1的Solution I长期保存于室温，导致RNase A1活性下降。
（3）细菌过量,RNase A1不能有效降解RNA。
解决方法：将细菌用量减半或增加RNase A1在Solution I中的浓度。
4.抽提的质粒DNA电泳时怎么出现切口.断裂或降解现象？（1）使用的是收集后冷冻保藏的细菌。
解决方法：使用新鲜培养的细菌。
（2）宿主菌富含核酸内切酶。
解决方法：增加一步Rinse A洗涤步骤以彻底去除残留的核酸内切酶。
质粒提取实验注意事项
质粒提取实验注意事项质粒提取是分子生物学中常用的实验技术之一，它能够从细菌中提取目标质粒，用于后续的转染、定量PCR、序列测定等实验。
质粒提取实验虽然操作简单，但是仍然需要遵循一定的注意事项，才能确保实验的顺利进行和结果的准确性。
下面将介绍质粒提取实验的注意事项。
1. 实验前的准备工作：在进行质粒提取实验之前，首先要做好实验室的准备工作。
要确保实验室中的工作台、仪器和试剂瓶都是干净整洁的，避免污染影响实验结果。
另外，要准备好所需的耗材和试剂，如离心管、离心管架、洗涤缓冲液、溶解缓冲液等。
并根据实验计划，提前准备好质粒所在的宿主菌培养液，提取缓冲液等相关材料。
2. 操作过程中的注意事项：在进行质粒提取实验的操作过程中，需要严格遵守操作规程，确保实验操作的准确性和稳定性。
在进行菌培养和离心等步骤时，要避免振荡或剧烈振动，以免对菌体和质粒的完整性产生影响。
另外，在使用洗涤缓冲液、溶解缓冲液和纯化缓冲液时，要注意溶液的pH值和温度是否符合要求，以及是否在有效期内。
同时要注意防止留下DNA和蛋白质残留，避免污染影响后续实验。
3. 质粒提取后的保存和处理：在完成质粒提取实验后，提取得到的质粒需进行适当的保存和处理。
一般情况下，提取得到的质粒可以用无菌的ddH2O或TE缓冲液溶解后，分装成适量的小份，然后在-20或更低的温度下保存。
另外要注意标记好每份提取得到的质粒，以免混淆。
在进行保存和后续实验过程中，要避免频繁的冻融，以免对质粒的完整性产生影响。
4. 实验后的清洁和记录工作：在完成质粒提取实验后，要及时清理实验台和操作工具，保持实验室的整洁。
同时要详细记录实验过程中的操作步骤、使用的试剂和仪器，以及实验结果等相关信息。
这些记录对于实验结果的分析和后续实验的开展都是十分重要的。
总之，质粒提取实验是一项重要的实验技术，在进行实验时需要严格遵循操作规程，注意操作细节，确保实验结果的准确性和可靠性。
希本通过本文介绍的注意事项，能够帮助实验人员顺利进行质粒提取实验，并获得高质量的实验数据。
碱裂解法提取质粒原理和注意事项
碱裂解法提取质粒原理和注意事项碱裂解法是一种用于提取质粒的常用方法，通过在碱性条件下使细菌细胞裂解，进而释放出质粒。
碱裂解法的原理是利用质粒与细菌细胞核酸的不同碱溶解性，使质粒保留在溶液中，而细菌细胞核酸被沉淀下来。
本文将详细介绍碱裂解法的原理和注意事项。
碱裂解法的原理：1.细菌细胞的预处理：首先，将含有质粒的细菌菌落接种到LB(琼脂)培养基中，经过适当时长的培养，使细菌菌落扩大到较大体积。
2.收获细菌细胞：将培养基中的细菌细胞收获下来，一般通过离心方法将菌液沉淀。
3.细菌细胞裂解：将细菌细胞沉淀后，将其重悬到高浓度的碱溶液中，使细菌细胞在碱性条件下裂解。
4.分离核酸：碱条件下，质粒DNA和线粒体DNA往往会溶于溶液中，而细菌细胞的染色体DNA不溶于溶液中，并随着碱度增加逐渐沉淀。
通过快速离心，将细菌细胞染色体DNA沉淀，而质粒DNA留在上清液中。
5.提取质粒：将上清液取出，通过乙醇沉淀方法使质粒DNA沉淀下来，通过离心收获质粒，即可得到纯化后的质粒DNA。
注意事项：1.使用无菌操作：为保证实验的准确性和重复性，实验过程中必须严格遵守无菌操作的要求。
例如，使用无菌器皿和无菌操作工具，避免细菌污染。
2.注意细菌菌落的培养条件和时长：细菌菌落的培养条件和时长会对实验结果产生影响。
培养条件应符合细菌所需的培养基成分和培养温度，时长应确保细菌菌落予以充足的生长和扩大。
3.使用高浓度的碱溶液：为充分裂解细菌细胞，需要使用高浓度的碱溶液，通常为pH12的溶液。
4.快速离心：由于细菌细胞裂解后的溶液中可能含有许多细菌细胞碎片和核酸碎片，为避免这些碎片沉淀到上清液中，需要进行快速离心，在最短时间内将质粒DNA沉淀下来。
5.质粒的纯化：通过乙醇沉淀方法提取质粒时，需要仔细控制乙醇的用量和沉淀时间，以避免损失待提取的质粒DNA。
总结：碱裂解法是提取质粒DNA的常用方法之一，其原理是利用质粒DNA与细菌细胞染色体DNA在碱性条件下的不同溶解性，通过沉淀法分离出质粒DNA。
质粒提取常见问题
细菌太老，活力不够 质粒为严谨型 在 DNA 结合溶液中已经 形成沉淀
画线培养细菌使之活化。 使用 5-10ml 菌液但是不要超过 10ml 菌液。
将 DNA 结合溶液加热到 37℃混匀冷却到 30℃备用。
DNA 结合柱太干 用错试剂
步骤 7 之后立即用 DP 洗脱液洗脱。 请仔细核对试剂名称。
用自动 荧光 测序没 有结果
悬器或剧烈震荡
紫外测定 DNA 浓度 低于琼 脂糖 凝胶测 定浓度
微量的 污染物 同时 被洗脱 出来， 会影响 紫外 分光光 度计读数
用酚/仿抽提， 酒精沉淀，70%酒 精清洗后干燥， 水溶，重 新紫外定量。
质粒酶切效果不好
要优化
使用 TE 缓冲液 使用 EndA+菌株导致 DNA 在酶切时降解
总体积的 1/10，酶切时间不要超过 2 小时。 尽量使用 DP 洗脱液洗脱。 在步骤 5 之后用 1ml 40%异丙醇/4.2M 盐酸胍溶液清洗 DNA 胞 裂解溶 液后 使用涡 加细胞裂解溶液后不要剧烈震荡
测序反应体系中 DNA 的 量加得不够
使用 TE 洗脱
杂质多 内切酶 浓度和 酶切 时间需
提取的质粒要经过琼脂糖凝胶电泳定量。要使用新鲜的 LB 培养基和新活化的菌株摇菌。
最好使用 DP 洗脱液洗脱（TE 中的 EDTA 能降低测序反应 中 M g2+的有效浓度）。 重复步骤 6。 尽量使用内切酶 的最佳酶切 缓冲液；内 切酶浓度不 要超过
DNA 结合柱中酒精没有除 增加步骤 7 的离心时间，如果 DNA 已经洗脱出来，可以用
干净。
酒精沉淀 DNA 并风干，然后水溶。
摇细菌 时间太 长， 造成空 菌生长过量。
确认是否所有的 培养基都加 了抗生素， 不要培养细 菌超过 24 小时（固体/液体培养基），一般 12-16 小时已经足够。
质粒小提的原理和提取过程中的注意事项
质粒小提的原理和提取过程中的注意事项质粒小提是一种常用的实验方法，用于从细菌中提取质粒DNA。
其原理和提取过程中有一些注意事项，下面是详细介绍。
质粒小提的原理：质粒小提的原理是利用离心法将大量细菌聚集在一起，然后使用碱解液溶解细菌细胞壁和膜，将质粒DNA释放到溶液中。
接下来，通过加入特定的盐和有机溶剂，将质粒DNA与其他细胞成分分离开来。
最后，通过离心将质粒DNA沉淀下来，即完成了质粒小提。
质粒小提的提取过程中的注意事项：1.使用无菌操作：在整个提取过程中，确保使用无菌操作，以防止外源性DNA的污染。
使用无菌平台和器具，并且在实验室操作台上清洁表面。
2.选择适当的细菌培养基：选择适当的培养基和条件来培养细菌，以获得最佳的质粒DNA产量。
选择含有适当选择抗生素的培养基，以确保只有含有目标质粒的细菌生长。
3.对细菌进行预处理：在提取过程之前，对细菌进行适当的预处理是很重要的。
通常，细菌应该处于对质粒DNA产生最佳条件的生长阶段。
此外，使用良好的细菌培养方法，以确保质粒DNA在细菌中的稳定和延长拷贝数。
4.合理选择裂解液：选择适当的裂解液可以有效地裂解细菌细胞壁和膜，释放质粒DNA。
常用的裂解液包括碱、酶和界面活性剂。
根据不同的细菌类型和质粒特性，选择合适的裂解液方法。
5.应用适当的离心条件：离心是质粒小提过程中一个非常重要的步骤，可以将质粒DNA与其他组分分离开来。
确定适当的离心速度和离心时间，以确保质粒DNA能够沉淀下来，并且去除其他细胞残留物。
6.保存提取的质粒DNA：提取到的质粒DNA需要正确保存，以避免降解和污染。
使用无菌的保存管和适当的缓冲液，如TE缓冲液，在低温（通常-20°C）下保存质粒DNA。
以上是质粒小提的原理和提取过程中的注意事项的详细介绍。
在操作过程中要严格控制操作条件，以获得高质量的质粒DNA。
质粒提取中常见的问题
质粒DNA提取常见问题分析1.加入solution.III，经10分钟离心后细菌沉淀怎么不结实，有的漂浮在液面，有的贴在离心管壁上，一摇晃即破碎脱落下来？细菌的用量太少，导致产生的沉淀主要是盐分的沉淀，因为缺少变性的细菌蛋白和细菌基因组DNA 的缠绕，沉淀就显得不结实。
解决方法：将细菌的用量增加。
2.加入soln.III，经10分钟离心后细菌沉淀怎么不结实，呈大块的水泡状，上清较少？（1）使用了过多的细菌，导致菌体未被有效裂解。
解决方法：将细菌用量减半。
（2）细菌悬浮不充分,存留小菌块, 导致菌体未被有效裂解。
解决方法：注意将细菌悬浮充分。
（3）加Solution III后中和不充分。
解决方法：如果细菌用量较多，请注意多翻转几次直至中和后的沉淀呈松散的豆腐花状(也可以稍用力混合直至沉淀呈松散的豆腐花状)。
（4）Solution II出现沉淀。
解决方法：如果实验室内温度低于15℃，使用试剂盒前请注意观察Solution II中是否出现沉淀。
如果出现沉淀，请于37℃水浴溶解沉淀后再使用。
（5）Solution II 长时间暴露于空气中被CO2中和，导致菌体未能被有效裂解。
解决方法：可用经典碱裂解法抽提质粒DNA方法中的II液替代Solution II使用。
3.出现严重的RNA污染？（1）未在Solution I中事先加入RNase A1。
解决方法：补加RNase A1。
（2）加入RNase A1的Solution I长期保存于室温，导致RNase A1活性下降。
（3）细菌过量,RNase A1不能有效降解RNA。
解决方法：将细菌用量减半或增加RNase A1在Solution I中的浓度。
4.抽提的质粒DNA电泳时怎么出现切口.断裂或降解现象？（1）使用的是收集后冷冻保藏的细菌。
解决方法：使用新鲜培养的细菌。
（2）宿主菌富含核酸内切酶。
解决方法：增加一步Rinse A洗涤步骤以彻底去除残留的核酸内切酶。
质粒提取常见问题解析
其pH值在此范围内，如果pH过低可能导致洗脱量低。洗脱时将灭菌蒸馏水或洗脱
缓冲液加热至60℃后使用有利于提高洗脱效率。
△ 洗脱体积太小
洗脱体积对回收率有一定影响。随着洗脱体积的增大回收率增高，但产品浓度降
溶液，才能使用。
△ 吸附柱过载
不同产品中吸附柱吸附能力不同，如果需要提取的质粒量很大，请分多次提取。若
用富集培养基，例如TB 或2×YT，菌液体积必须减少；若质粒或宿主菌是非常高
的拷贝数或生长率，则需调整LB培养液体积。
△ 质粒未全部溶解（尤其质粒较大时）
洗脱ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ解质粒时，可适当加温或延长溶解时间。
△ 混有RNA
RNase A处理不彻底，请减少菌体用量或加入溶液P3之后室温放置一段时间。如
果溶液P1已保存6个月以上，请在溶液P1中添加RNase A。
△ 混有基因组DNA
加入溶液P2和P3后应温和混匀，如果剧烈振荡，可能把基因组DNA剪切成碎片从
而混杂在质粒中。如果加入溶液P2后过于粘稠，无法温和混匀，请减少菌体用
应接种单菌落。另外，检查筛选用抗生素使用浓度是否正确。
△ 碱裂解不充分
使用过多菌体培养液，会导致菌体裂解不充分，可减少菌体用量或增加溶液P1、
P2和P3的用量。对低拷贝数质粒，提取时，可加倍使用溶液P1、P2和P3，可能
有助于增加质粒提取量和质粒质量。
△ 溶液使用不当
溶液P2、P3在温度较低时可能出现浑浊，应置于37℃保温片刻直至溶解为清亮的
△ 大肠杆菌老化
请涂布平板培养后，重新挑选新菌落进行液体培养。
质粒提取常见问题与解决方法参考
质粒提取常见问题与解决方法参考质粒提取常见问题与解决方法参考来源：易生物实验浏览次数：632 网友评论 0 条关键词：质粒质粒提取1. 细菌离心后，加入溶液I蜗旋振荡时，发现菌体呈絮状不易混匀，或成细砂样。
——很可能是细菌发生溶菌，可减少培养时间、降低培养温度试试看，通常降低培养温度会使细菌生长更加稳定；同时也可以试试平板培养，培养后，用PBS将菌落洗下，再进行质粒的提取，固体培养基上细菌生长的要好一些。
2. 加入溶液II，菌液浑浊度没有发生明显变化。
——裂解不完全，主要问题是发生在溶液II上。
确保10％SDS是澄清的，确认NaOH是有效的，如使用的是试剂盒，确认溶液II是澄清没有沉淀的。
如确认原因不是发生在溶液II上，而是细菌浓度比较高，可相应增加溶液I/II/III的体积。
此外，啤酒肚16059978战友还提出，有可能是“杂菌”污染。
3. 加入酚仿抽提，离心后在水相和有机相间没有变性蛋白层，但随后的乙醇沉淀发现大量的半透明沉淀，溶解后蛋白浓度高。
——乙醇沉淀时，较纯的质粒沉淀应该是白色（PEG纯化的沉淀是透明的，肉眼不易发现），如沉淀是半透明的凝胶状，则是蛋白含量高。
出现此类问题时确认两点：1. 平衡酚是否被氧化、pH是否是8.0。
2. 溶液I/II/III反应后，离心的上清pH是否在8.0左右。
有时，由于溶液III配置的问题，导致溶液I/II/III反应后离心的上清pH与8.0偏差较大，导致平衡酚抽提时没有有效的将蛋白抽提出来，有时，离谱的pH会导致水相和平衡酚互溶。
4.使用酚仿抽提方法，质粒A260/A280的纯度也很好，但酶切不能完全切开。
——1.确认酶的有效性；2. 平衡酚是否被氧化而呈现棕色，而非正常的黄色；3. 是否不小心吸入了痕量的酚；4.乙醇沉淀后，70%乙醇漂洗的是否充分，残留的盐类会影响酶切；5.乙醇漂洗后是否完全干燥，残留的乙醇会影响酶切；5. 提取质粒中RNA没有去除。
质粒提取常见问题解析
质粒提取常见问题解析质粒, 解析本帖引用网址：/thread-29246-1-1.html涂布棒在酒精蘸一下，然后烧一下，能不能保证把所用的菌烧死？参考见解：涂布棒可以在酒精中保藏，但是酒精不能即时杀菌。
蘸了酒精后再烧一小会，烧的是酒精而不是涂布棒。
建议涂布棒还是干烧较长时间后，冷却了再涂。
同时作多个转化时，应用几个涂布棒免得交叉污染。
原先测序鉴定没有问题的细菌，37℃摇菌后发现质粒大小或序列出现异常?参考见解：这种情况出现的几率较小，常出现在较大质粒或比较特殊的序列中。
解决办法：1、降低培养温度，在20～25℃下培养，或室温培养可明显减少发生概率。
2、使用一些特殊菌株，如Sure菌株，它缺失了一些重组酶，如rec类等，使得质粒复制更加稳定。
3、质粒抽提有一个酶切不完全的原因就是溶液Ⅱ中的NaOH浓度过高造成的，请大家注意一下！【有两种方法可以在提质粒前判断菌生长是否正常：1、利用你的嗅觉。
只要平时做实验仔细点就能闻出大肠杆菌的气味，新鲜的大肠杆菌是略带一点刺鼻的气味，但不至于反感。
而在泥水状的菌液中你只要一凑过去就感觉到其臭无比或者没有气味，可以和正常菌液对照。
2、肉眼观察活化菌株。
对于生长不正常的菌液进行划板验证或者稀释到浓度足够低涂板，第二天观察单克隆生长情况，LB平板生长的DH5A正常形态在37℃16h后直径在1mm左右，颜色偏白，半透明状，湿润的圆形菌斑，如果观察到生长过快，颜色又是泛黄的话基本上不正常了。
】未提出质粒或质粒得率较低，如何解决？参考见解：1、大肠杆菌老化：涂布平板培养后，重新挑选新菌落进行液体培养。
2、质粒拷贝数低：由于使用低拷贝数载体引起的质粒DNA提取量低，可更换具有相同功能的高拷贝数载体。
3、菌体中无质粒：有些质粒本身不能在某些菌种中稳定存在，经多次转接后有可能造成质粒丢失。
例如，柯斯质粒在大肠杆菌中长期保存不稳定，因此不要频繁转接，每次接种时应接种单菌落。
另外，检查筛选用抗生素使用浓度是否正确。
碱裂解法提取质粒dna的注意事项
碱裂解法提取质粒DNA注意事项1. 安全注意事项：•使用个人防护装备，如实验室外套、手套和护目镜，以防止对碱性溶液的不慎接触。
•碱性溶液可能对皮肤和眼睛有刺激性，因此在操作过程中要小心谨慎。
2. 试剂准备：•确保所使用的试剂是新鲜的，并按照制造商的建议来保存和使用。
•使用经过蒸馏水或去离子水处理的试剂，以避免引入可能影响实验结果的杂质。
3. 菌落培养：•使用含有所需质粒的细菌菌株进行培养。
确保选择的细菌株含有你感兴趣的质粒。
•遵循适当的培养条件，包括温度、培养时间和培养介质。
4. 收获菌体：•选择适当的时间点进行菌体的收获，通常在菌液达到对数生长期时。
这可以确保有足够的质粒在菌体内。
5. 菌体收集：•使用合适的离心机和离心管来收集大量的菌体，以确保后续实验有足够的起始材料。
6. 碱裂解过程：•严格按照碱裂解的步骤进行操作，避免操作时间过长或者过短。
•控制碱性溶液的浓度和温度，以确保有效地裂解菌体膜。
7. 中和步骤：•在裂解之后，使用酸性缓冲液迅速中和碱性溶液，以避免对DNA的影响。
8. 离心步骤：•在离心过程中，确保对细胞碎片和残留物进行彻底的去除，以获得清晰的上清液。
9. 质粒DNA保存：•将提取得到的质粒DNA保存在适当的条件下，通常是在-20°C或更低的温度下，以防止DNA降解。
10. 检测纯度和浓度：•在实验结束后，使用比色法、凝胶电泳或其他方法检测提取的质粒DNA的纯度和浓度。
11. 设定菌体培养条件：确保细菌在培养过程中处于对质粒复制有利的状态。
合理的培养条件，包括温度、培养介质和时间，能够影响细菌的生长和质粒的复制。
12. RNA酶的适当使用：在碱裂解步骤中，RNase A通常用于去除RNA。
确保RNase A的浓度足够，同时避免过高的浓度，以免对DNA产生不利影响。
可以在提取缓冲液中加入合适浓度的RNase A。
13. 质粒大小的考虑：对于大质粒的提取，可能需要更加彻底的碱裂解步骤，或者使用更高浓度的碱性溶液。
质粒提取问题与心得
质粒提取问题与心得质粒提取是分子生物学实验中常见的操作，用于从细菌中提取质粒DNA。
质粒是细菌细胞内的环状DNA分子，通常用于在细菌中传递外源基因。
质粒提取的过程涉及细胞破裂、DNA纯化和浓缩等步骤，下面我将从几个方面来谈谈质粒提取的问题与心得。
首先，质粒提取的关键步骤包括细胞破裂、DNA纯化和浓缩。
在细胞破裂过程中，使用适当的细胞破裂缓冲液和方法对细菌进行破裂，释放质粒DNA。
在DNA纯化过程中，通过离心、溶液添加和酚/氯仿提取等方法，将质粒DNA与蛋白质、RNA等杂质分离。
最后，通过乙醇沉淀等方法对DNA进行浓缩，得到纯净的质粒DNA。
其次，质粒提取过程中可能遇到的问题包括DNA污染、纯化不彻底、DNA浓度不足等。
为了解决这些问题，可以在细胞破裂缓冲液中添加蛋白酶等物质，提高DNA的纯化效果；在DNA纯化过程中，可以多次进行酚/氯仿提取和乙醇沉淀，提高纯化的彻底性；在最后的浓缩过程中，可以根据实际情况调整乙醇的浓度，以获得所需浓度的质粒DNA。
此外，质粒提取的心得体会包括操作技巧、实验条件和耐心。
在进行质粒提取实验时，需要熟练掌握各个步骤的操作技巧，尤其是在细胞破裂和DNA纯化过程中需要细心操作；实验条件也很重要，包括细菌培养的状态、破裂缓冲液的配制和储存等；此外，需要有耐心，因为质粒提取是一个细致而耗时的过程，需要耐心等待和细心操作。
综上所述，质粒提取是分子生物学实验中常见的操作，需要注意细节、耐心等。
在实际操作中，我们需要不断总结经验，积累心得，以期获得更好的实验结果。
希望以上内容能够对你有所帮助。
质粒提取简介及问题分析
质粒提取简介及问题分析一、导论(一) 质粒提取得原理:为了方便理解，这里罗列一下碱法质粒抽提用到三种溶液:溶液I,５0mM葡萄糖,25mＭＴris-ＨCl,10 mＭEＤTＡ,ｐＨ8、０;溶液II,0、2N NａOＨ，1%SＤＳ;溶液III，３M 醋酸钾,２M 醋酸。
让我们先来瞧瞧溶液I得作用。
任何生物化学反应,首先要控制好溶液得ｐH，因此用适当浓度得与适当pH值得Ｔris-HCl溶液,就就是再自然不过得了。
那么50 mM葡萄糖就就是干什么得呢?加了葡萄糖后最大得好处只就就是悬浮后得大肠杆菌不会快速沉积到管子得底部。
因此,如果溶液I中缺了葡萄糖其实对质粒得抽提本身而言几乎没有任何影响,所以说溶液I中葡萄糖就就是可缺得。
EDTＡ就就是Ca2＋与Ｍg2+等二价金属离子得螯合剂,配在分子生物学试剂中得主要作用就就是:抑制DNaｓe得活性,与抑制微生物生长。
在溶液I中加入高达10mM 得ＥＤTA，就就就是要把大肠杆菌细胞中得所有二价金属离子都螯合掉。
如果不加EDTＡ,其实也没什么大不了得,只要就就是在不太长得时间里完成质粒抽提，就不用怕ＤＮA会迅速被降解,因为最终溶解质粒得TE缓冲液中有EDTA。
如果手上正好缺了溶液I，可不可以抽质粒呢？只要用等体积得水或LB培养基来悬浮菌体就可以了。
有一点不能忘得就就是,菌体一定要悬浮均匀,不能有结块。
轮到溶液II了。
这就就是用新鲜得０、4 N得ＮaOH与2％得SDS等体积混合后使用得。
要新从浓ＮaOH稀释制备０、4N得NａOH,无非就就是为了保证NaOＨ没有吸收空气中得CO２而减弱了碱性。
很多人不知道其实破细胞得主要就就是碱，而不就就是SＤＳ,所以才叫碱法抽提。
事实上ＮaOH就就是最佳得溶解细胞得试剂，不管就就是大肠杆菌还就就是哺乳动物细胞,碰到了碱都会几乎在瞬间就溶解,这就就是由于细胞膜发生了从bｉlayer(双层膜）结构向ｍiceｌle（微囊)结构得相变化所导致。
质粒提取及酶切实验的注意事项
质粒提取及酶切实验的注意事项一、前言质粒提取和酶切实验是分子生物学中常用的实验技术。
在执行实验时，需要遵守一些注意事项，以确保实验能够成功并得出可靠的结果。
本文将重点介绍质粒提取和酶切实验中应注意的事项。
二、质粒提取实验的注意事项1.使用高质量的DNA提取试剂：DNA提取试剂的质量对提取的DNA质量和纯度有很大的影响，因此选择高质量的试剂非常重要。
2.应用适当的细胞培养技术：细胞培养技术对于细胞表达和提取相应DNA质量至关重要，因此选择合适的培养条件非常重要。
3.注意DNA的浓度：在质粒提取过程中，需要注意DNA的浓度，因为浓度过低或过高都会影响后续的实验结果。
4.遵守标准协议：在进行质粒提取实验时，必须严格遵守标准协议，包括使用正确的试剂、设备和方法。
5.注意杂质的干扰：在提取质粒的过程中，可能会出现杂质，如蛋白质或RNA。
这些杂质可能会干扰后续实验的结果，因此必须尽可能去除。
三、酶切实验的注意事项1.使用高质量的酶：选择适当的酶是酶切实验成功的关键。
不同的酶适用于不同的DNA序列，因此必须选择合适的酶。
2.注意酶的浓度和反应时间：酶切实验中，酶的浓度和反应时间都对结果有很大的影响，因此必须严格控制这些参数。
3.遵循标准协议：遵循酶切实验的标准协议非常重要，包括所需的材料、浓度、反应时间严格按照说明书进行。
4.注意反应体系的条件：酶切反应过程需要在适当的缓冲液中进行。
必须确保缓冲液的pH、离子浓度、反应温度等条件是合适的。
5.注意合适的质控实验：在酶切反应中，应该与相应的对照样品一起进行，以确保实验的准确性和精确性。
四、总结在分子生物学中进行质粒提取和酶切实验是很常见的实验技术，这些实验的成功非常重要，因为它们是分子生物学实验的基础。
在进行实验前，必须了解每个步骤的重要性和所需的操作技能。
在实验的过程中必须严格按照规定的方法和协议进行。
通过遵守上述注意事项和规程，可以获得高质量的实验结果。
质粒提取常见问题及解决办法
质粒提取常见问题及解决办法涂布棒在酒精蘸一下，然后烧一下，能不能保证把所用的菌烧死?参考见解：涂布棒可以在酒精中保藏，但是酒精不能即时杀菌。
蘸了酒精后再烧一小会，烧的是酒精而不是涂布棒。
建议涂布棒还是干烧较长时间后，冷却了再涂。
同时作多个转化时，应用几个涂布棒免得交叉污染。
原先测序鉴定没有问题的细菌，37℃摇菌后发现质粒大小或序列出现异常?参考见解：这种情况出现的几率较小，常出现在较大质粒或比较特殊的序列中。
解决办法：1、降低培养温度，在20～25℃下培养，或室温培养可明显减少发生概率。
2、使用一些特殊菌株，如Sure菌株，它缺失了一些重组酶，如rec类等，使得质粒复制更加稳定。
3、质粒抽提有一个酶切不完全的原因就是溶液Ⅱ中的NaOH浓度过高造成的，请大家注意一下!【有两种方法可以在提质粒前判断菌生长是否正常：1、利用你的嗅觉。
只要平时做实验仔细点就能闻出大肠杆菌的气味，新鲜的大肠杆菌是略带一点刺鼻的气味，但不至于反感。
而在泥水状的菌液中你只要一凑过去就感觉到其臭无比或者没有气味，可以和正常菌液对照。
2、肉眼观察活化菌株。
对于生长不正常的菌液进行划板验证或者稀释到浓度足够低涂板，第二天观察单克隆生长情况，LB平板生长的DH5A正常形态在37℃16h后直径在1mm左右，颜色偏白，半透明状，湿润的圆形菌斑，如果观察到生长过快，颜色又是泛黄的话基本上不正常了。
】未提出质粒或质粒得率较低，如何解决?参考见解：1、大肠杆菌老化：涂布平板培养后，重新挑选新菌落进行液体培养。
2、质粒拷贝数低：由于使用低拷贝数载体引起的质粒DNA提取量低，可更换具有相同功能的高拷贝数载体。
3、菌体中无质粒：有些质粒本身不能在某些菌种中稳定存在，经多次转接后有可能造成质粒丢失。
例如，柯斯质粒在大肠杆菌中长期保存不稳定，因此不要频繁转接，每次接种时应接种单菌落。
另外，检查筛选用抗生素使用浓度是否正确。
4、碱裂解不充分：使用过多菌体培养液，会导致菌体裂解不充分，可减少菌体用量或增加溶液的用量。
质粒提取注意事项
质粒提取注意事项1. 质粒制备的基本原理是什么？答：做过分子生物学实验的,大多数做抽提过质粒，但不是所有人都知道质粒制备的基本原理。
所以有必要做一个说明，能帮助您了解和解决实验过程中遇到的一些问题。
制备质粒最常用的方式是碱裂解法。
质粒被转化到细菌中，单菌落接种到含有特定抗生素的培养基中，一般培养到细菌生长的平台期离心收集细胞；细菌用悬浮液（Solution I, 内含RNase A）悬浮细胞，用SDS-NaOH (Solution II)裂解。
SDS是很强的去污剂，抽提出细胞膜蛋白质和磷脂，释放出细胞内物质，NaOH为强碱，使蛋白质，染色体DNA和质粒DNA变性；细胞裂解彻底后，加入酸性醋酸钾（Solution III）, 中和裂解液，同时SDS-K,变性蛋白质，变性基因组DNA和细胞碎片形成沉淀，通过离心，但是质粒DNA正确复性，仍留在上清溶液中。
如何从上清液中回收DNA的方法有很多，有用苯酚/氯仿抽提的，有用乙醇沉淀的，有用核酸吸附吸附的，目的都是试图采用有效，快速的方式纯化质粒DNA。
我们提供的试剂盒就是选用特异的核酸吸附材料，优化结合与洗脱条件得到高纯度质粒DNA，纯化的质粒DNA纯度和得率可以满足分子生物学实验的要求。
2. 质粒DNA 制备的关键是什么？答：碱裂解法的关键是如何把握SDS-NaOH处理的时间。
质粒制备过程中，如果质粒长时间暴露于NaOH, 质粒有可能不可逆变性，使得抽提质粒中有部分是变性质粒。
这些变性质粒，不能酶切。
所有一般情况下，SDS-KOH处理时间不能超过5分钟，最好在冰里处理，观察到液体变得清就可以加入中和液。
3. 质粒中基因组污染是怎么产生的？答：基因组的产生一般是因变性和中和步骤处理不当所致。
如果为了提高混合效果，混匀的动作过于剧烈，基因组DNA可能被剪切成小片段，这些小片段在后来中和过程中被复性，保留在溶液中，与质粒一起回收出来了。
要降低基因组的污染，记注两点：混合动作要温和，细胞用量要合适。
大提质粒注意事项
大提质粒注意事项
提取质粒时需要注意以下几点：
1. 注意操作规范，避免污染：提取质粒的过程需要严格控制，避免交叉污染和外界杂菌的侵入。
在操作过程中要保证在无菌环境下进行，并按照操作规范进行每一步操作。
2. 注意使用试剂的纯度：提取质粒所使用的试剂要求纯度较高，避免使用过期或劣质的试剂，以免影响提取效果。
3. 注意控制温度和时间：在提取质粒的过程中，需要控制好温度和时间，保证DNA的完整性和纯度。
同时，对于不同的质粒需要采用不同的方法和条件进行提取。
4. 注意观察和记录实验结果：在实验过程中需要随时观察实验结果，如有问题及时调整操作步骤或更换试剂。
同时，实验结束后需要记录实验结果，以便后续的分析和处理。
5. 注意安全：提取质粒过程中使用的试剂和器具具有一定的危险性，需要注意安全防护措施，避免对人体造成危害。
6. 做好质粒的保存工作：提取出的质粒需要妥善保存，避免污染和降解。
在保存过程中要选择适当的保存条件和方法，以保证质粒的质量和稳定性。
7. 实验人员要求：进行此实验前需具备一定的分子生物学实验基础，且应熟悉质粒提取的相关知识。
以上是提取质粒时需要注意的几点事项，仅供参考。
质粒提取注意事项及DNA纯化浓缩
质粒DNA需要注意的问题(采用碱法提取)
○1离心收集菌体时的上清液一定要去除干净，不得混入到裂解液中。
离心完毕倒出上清液后，离心管口应一直向下，倒扣在吸水纸上，放置一段时间，让管壁上的液体都流干。
因上清液中含有一些细胞培养过程中产生的代谢物及细胞壁脱落成分，这些物质严重影响限制酶的切割作用
○2掌握好变形的时间及温度。
加入溶液II后，要迅速但又十分温和地混匀，以颠倒离心管5次为宜，千万不能剧烈震荡。
混匀后立即放入冰浴中，低温条件下可以减少质粒的变性程度。
○3用平衡酚抽提时不能剧烈震荡，以颠倒离心管3-5次为好。
实验表明，用Tris-HCl饱和的酚抽提细菌质粒DNA时，剧烈震荡20次和轻轻地上下颠倒离心管3次，被提取的内含物成分区别很大，前者包括染色体DNA，蛋白质和RNA，这些杂质全部被抽提，颠倒离心管3次，抽提物中只有质粒DNA及一些小分子的杂质
DNA/质粒纯化浓缩
1.加入等体积的酚/氯仿/异戊醇（25:24:1）和氯仿/异戊醇（24:1）分别抽提
2.加入1/10体积3M NaAc/乙酸铵ph5.2和2倍体积冰冻无水乙醇，-20℃沉淀
2h
3. 4℃，12000rpm 离心10min，70％乙醇（＜200ul）洗涤沉淀，吹干
4. 加入20-50ul DD H2O回溶沉淀（亦可用TE回溶，适合长期保存，但不知是否影响下一步Southern酶切效果）
注：第一步视情况而定，可以省略不做。
质粒提取常见问题解答
质粒提取常见问题解答在一代测序或者去内毒素大提质粒时经常会发生一些质粒提取得率很低影响测序或大提质粒得率的情况。
可从以下几种情况作出改善。
第一种情况.没有提出质粒或者质粒收获量很低，可能原因如下：A菌种老化建议：对于甘油保存的菌种，需要先进行活化，涂布或者划线菌种，重新挑选单菌落进行液体培养，并对菌种进行初摇活化，按照1:500的比例进行菌种培养。
二次培养时间最好不要超出16小时（或者OD600不超过3.0）。
B低拷贝质粒建议：如果是由于低拷贝质粒引起的质粒收获量低，可以采用两倍的菌体量，并相应增加各种BUffer的用量。
C质粒丢失建议：某些质粒在次继代培养的过程中会出现丢失的想象，另外检查筛选抗生素的浓度是否正确。
D裂解不充分建议：如果采用超过推荐量的菌体进行质粒制备，会导致菌体裂解不充分。
可适当减少菌体的用量或者相应增大各种Buffer的用量。
并确保细菌混悬均匀。
EBUffer中有沉淀未溶解建议：BUfferBI和BUfferN1,BUfferC1在温度较低时会出现沉淀，使用前请检查是否有沉淀生成，如果有沉淀生成，请置于37°C温育片刻，待溶液澄清后使用。
FDNAWashBuffer中未加入要求量的乙醇建议：按照说明书要求加入要求量的无水乙醇，使用后旋紧瓶盖，防止乙醇挥发。
另外对于质粒中提，大提等，要求用70%乙醇洗涤，请确保乙醇的体积不小于70%。
G离心柱中乙醇残留建议：漂洗后，可适当延长离心时间，尽量去除残留的乙醇。
另外对于质粒大提，建议离心后，将柱子或大漏斗用吹风机冷风吹片亥∣J(或置于65℃烘箱)，以彻底去除残留的乙醇,便于洗脱和后续实验操作。
H洗脱液加入位置不正确建议：洗脱液应加在膜中央，已取得最好的洗脱效果。
I洗脱液PH值不正确建议：将DNA从柱子上洗脱下来的最适PH值在7.0∙8.5之间，如果洗脱液的PH超出此范围将会显著影响洗脱效果，请使用试剂盒配套的日UtionBUffer(PH8.5,1OmMTriS-HC1)进行洗脱，如果用ddH20进行洗脱，请确保PH在7.0-8.5之间。
质粒提取有关问题及注意点
质粒提取常见问题解析涂布棒在酒精蘸一下，然后烧一下，能不能保证把所用的菌烧死？参考见解：涂布棒可以在酒精中保藏，但是酒精不能即时杀菌。
蘸了酒精后再烧一小会，烧的是酒精而不是涂布棒。
建议涂布棒还是干烧较长时间后，冷却了再涂。
同时作多个转化时，应用几个涂布棒免得交叉污染。
原先测序鉴定没有问题的细菌，37℃摇菌后发现质粒大小或序列出现异常?参考见解：这种情况出现的几率较小，常出现在较大质粒或比较特殊的序列中。
解决办法：1、降低培养温度，在20～25℃下培养，或室温培养可明显减少发生概率。
2、使用一些特殊菌株，如Sure菌株，它缺失了一些重组酶，如rec类等，使得质粒复制更加稳定。
3、质粒抽提有一个酶切不完全的原因就是溶液Ⅱ中的NaOH浓度过高造成的，请大家注意一下！【有两种方法可以在提质粒前判断菌生长是否正常：1、利用你的嗅觉。
只要平时做实验仔细点就能闻出大肠杆菌的气味，新鲜的大肠杆菌是略带一点刺鼻的气味，但不至于反感。
而在泥水状的菌液中你只要一凑过去就感觉到其臭无比或者没有气味，可以和正常菌液对照。
2、肉眼观察活化菌株。
对于生长不正常的菌液进行划板验证或者稀释到浓度足够低涂板，第二天观察单克隆生长情况，LB平板生长的DH5A正常形态在37℃16h后直径在1mm左右，颜色偏白，半透明状，湿润的圆形菌斑，如果观察到生长过快，颜色又是泛黄的话基本上不正常了。
】未提出质粒或质粒得率较低，如何解决？参考见解：1、大肠杆菌老化：涂布平板培养后，重新挑选新菌落进行液体培养。
2、质粒拷贝数低：由于使用低拷贝数载体引起的质粒DNA提取量低，可更换具有相同功能的高拷贝数载体。
3、菌体中无质粒：有些质粒本身不能在某些菌种中稳定存在，经多次转接后有可能造成质粒丢失。
例如，柯斯质粒在大肠杆菌中长期保存不稳定，因此不要频繁转接，每次接种时应接种单菌落。
另外，检查筛选用抗生素使用浓度是否正确。
4、碱裂解不充分：使用过多菌体培养液，会导致菌体裂解不充分，可减少菌体用量或增加溶液的用量。
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质粒提取常见问题解析涂布棒在酒精蘸一下，然后烧一下，能不能保证把所用的菌烧死？参考见解：涂布棒可以在酒精中保藏，但是酒精不能即时杀菌。
蘸了酒精后再烧一小会，烧的是酒精而不是涂布棒。
建议涂布棒还是干烧较长时间后，冷却了再涂。
同时作多个转化时，应用几个涂布棒免得交叉污染。
原先测序鉴定没有问题的细菌，37℃摇菌后发现质粒大小或序列出现异常?参考见解：这种情况出现的几率较小，常出现在较大质粒或比较特殊的序列中。
解决办法：1、降低培养温度，在20～25℃下培养，或室温培养可明显减少发生概率。
2、使用一些特殊菌株，如Sure菌株，它缺失了一些重组酶，如rec类等，使得质粒复制更加稳定。
3、质粒抽提有一个酶切不完全的原因就是溶液Ⅱ中的NaOH浓度过高造成的，请大家注意一下！【有两种方法可以在提质粒前判断菌生长是否正常：1、利用你的嗅觉。
只要平时做实验仔细点就能闻出大肠杆菌的气味，新鲜的大肠杆菌是略带一点刺鼻的气味，但不至于反感。
而在泥水状的菌液中你只要一凑过去就感觉到其臭无比或者没有气味，可以和正常菌液对照。
2、肉眼观察活化菌株。
对于生长不正常的菌液进行划板验证或者稀释到浓度足够低涂板，第二天观察单克隆生长情况，LB平板生长的DH5A正常形态在37℃16h后直径在1mm左右，颜色偏白，半透明状，湿润的圆形菌斑，如果观察到生长过快，颜色又是泛黄的话基本上不正常了。
】未提出质粒或质粒得率较低，如何解决？参考见解：1、大肠杆菌老化：涂布平板培养后，重新挑选新菌落进行液体培养。
2、质粒拷贝数低：由于使用低拷贝数载体引起的质粒DNA提取量低，可更换具有相同功能的高拷贝数载体。
3、菌体中无质粒：有些质粒本身不能在某些菌种中稳定存在，经多次转接后有可能造成质粒丢失。
例如，柯斯质粒在大肠杆菌中长期保存不稳定，因此不要频繁转接，每次接种时应接种单菌落。
另外，检查筛选用抗生素使用浓度是否正确。
4、碱裂解不充分：使用过多菌体培养液，会导致菌体裂解不充分，可减少菌体用量或增加溶液的用量。
对低拷贝数质粒，提取时可加大菌体用量并加倍使用溶液，可以有助于增加质粒提取量和提高质粒质量。
5、溶液使用不当：溶液2和3在温度较低时可能出现浑浊，应置于37℃保温片刻直至溶解为清亮的溶液，才能使用。
6、吸附柱过载：不同产品中吸附柱吸附能力不同，如果需要提取的质粒量很大，请分多次提取。
若用富集培养基，例如TB或2×YT，菌液体积必须减少；若质粒是非常高的拷贝数或宿主菌具有很高的生长率，则需减少LB培养液体积。
7、质粒未全部溶解(尤其质粒较大时) ：洗脱溶解质粒时，可适当加温或延长溶解时间。
8、乙醇残留：漂洗液洗涤后应离心尽量去除残留液体，再加入洗脱缓冲液。
9、洗脱液加入位置不正确：洗脱液应加在硅胶膜中心部位以确保洗脱液会完全覆盖硅胶膜的表面达到最大洗脱效率。
10、洗脱液不合适：DNA只在低盐溶液中才能被洗脱，如洗脱缓冲液EB(10mM Tris-HCl, 1mM EDTA，pH8.5)或水。
洗脱效率还取决于pH值，最大洗脱效率在pH7.0-8.5间。
当用水洗脱时确保其pH值在此范围内，如果pH过低可能导致洗脱量低。
洗脱时将灭菌蒸馏水或洗脱缓冲液加热至60℃后使用，有利于提高洗脱效率。
11、洗脱体积太小：洗脱体积对回收率有一定影响。
随着洗脱体积的增大回收率增高，但产品浓度降低。
为了得到较高的回收率可以增大洗脱体积。
12、洗脱时间过短：洗脱时间对回收率也会有一定影响。
洗脱时放置1min可达到较好的效果。
细菌离心加入溶液I蜗旋振荡后，发现菌体呈絮状不均匀或呈细砂状？参考见解：1、很可能是细菌发生溶菌，可减少培养时间或者试试平板培养，质粒提取前用PBS将菌落洗下，相较来说固体培养基上细菌生长的要好一些。
2、质粒抽提过程很大程度上是受细菌生长情况决定的，刚活化的菌比负80℃保存菌种所培养出来的菌液状态好，保存久的菌株可能会造成质粒浓度低，质粒丢失等不明原因。
3、判断生长的菌液是否正常，可以用肉眼观察，在光线明亮处摇荡新鲜培养液，如果发现菌液呈漂絮状，情况很好。
如果发现呈泥水状，即看不到絮状，只是感觉很浑浊，则可能提不出好的质粒，或者没有质粒。
4、菌液不宜生长太浓，摇床速度不宜过高。
达到OD600 1.5就可以了，（尤其是对于试剂盒提取要注意）另外如果只是简单的酶切验证根本无需酚氯仿抽提（安全考虑，慎重），只要溶液I/ II /III比例恰当，转管过程仔细吸取不会有太多杂志。
为什么加了溶液Ⅱ后，菌体没有逐渐由混浊变澄清？提出来的条带几乎没有，但是RNA很亮（没加RNA酶）？溶液Ⅱ主要就是NaOH，如果菌液没有由混浊变澄清，参考见解：1、可能是因为溶液储存不当，或屡次操作没有及时盖好溶液瓶盖，导致其吸收空气中的CO2失效。
RNA在菌体中量较多，相对少量的菌体裂解，可有较DNA明显的条带。
2、可能是菌量大，加溶液Ⅱ后，菌体并不能完全裂解，所以没有变清，这也会导致质粒产率低下．3、可能是质粒的拷贝数不高，质粒产率不高．如果是使用自己配的试剂，建议做中提或大提；或者买试剂盒提．用自己配的试剂，不加RNA酶，最后RNA是很亮的，要去除干净就要用比较好的ＲＮＡ酶。
4、如果不是试剂的原因，可能是质粒表达的过程中使膜蛋白变化（数量变多），很难使用碱裂解法，可以尝试用其他比较剧烈的方法(比如高温或者低温研磨等),然后使用一般的发放。
5、可能质粒随乙醇一起倒掉了。
加入溶液II后，菌液仍然呈浑浊状态，或者混浊度没有明显的改变？裂解不完全,参考见解：1、问题可能是发生在溶液II上。
首先看看10％SDS是否是澄清的？NaOH是否是有效的？如果使用的是试剂盒，也要首先确认溶液II是否澄清没有沉淀？2、可能是细菌浓度很高，适当调整增加溶液I/II/III的体积。
3、可能是“杂菌”污染，如果菌液生长异常快，就有可能被杂菌污染。
这种情况一般表现为和目的菌有相同的抗性，生长速度异常，能够提出质粒，跑胶的条带也异常的亮，但产物不是自己想要的质粒，要特别注意一下。
抽提DNA去除蛋白质时，为什么要是酚/氯仿混合使用？怎样使用酚与氯仿较好？参考见解：酚与氯仿都是非极性分子，水是极性分子，当蛋白水溶液与酚或氯仿混合时，蛋白质分子之间的水分子就被酚或氯仿挤去，使蛋白失去水合状态而变性。
经过离心，变性蛋白质的密度比水的密度大，因而与水相分离，沉淀在水相下面，从而与溶解在水相中的DNA 分开。
而酚与氯仿有机溶剂比重更大，保留在最下层。
作为表面变性的酚与氯仿，在去除蛋白质的作用中，各有利弊，酚的变性作用大，但酚与水相有一定程度的互溶，大约10％～15％的水溶解在酚相中，因而损失了这部分水相中的DNA，而氯仿的变性作用不如酚效果好，但氯仿与水不相混溶，不会带走DNA。
所以在抽提过程中，混合使用酚与氯仿效果最好。
经酚第一次抽提后的水相中有残留的酚，由于酚与氯仿是互溶的，可用氯仿第二次变性蛋白质，此时一起将酚带走。
也可以在第二次抽提时，将酚与氯仿混合（1:1）使用。
呈粉红色的酚可否使用？如何保存酚不被空气氧化？参考见解：保存在冰箱中的酚，容易被空气氧化而变成粉红色的，这样的酚容易降解DNA，一般不可以使用。
为了防止酚的氧化，可加入疏基乙醇和8-羟基喹琳至终浓度为0.1％。
8-羟基喹琳是带有淡黄色的固体粉末，不仅能抗氧化，并在一定程度上能抑制DNase的活性，它是金属离子的弱螯合剂。
用Tris pH8.0水溶液饱和后的酚，最好分装在棕色小试剂瓶里，上面盖一层Tris水溶液或TE缓冲液，隔绝空气，以装满盖紧盖子为宜，如有可能，可充氮气防止与空气接触而被氧化。
平时保存在4℃或－20℃冰箱中，使用时，打开盖子吸取后迅速加盖，这样可使酚不变质，可用数月。
为什么用酚与氯仿抽提DNA时，还要加少量的异戊醇？参考见解：在抽提DNA时，为了混合均匀，必须剧烈振荡容器数次，这时在混合液内易产生气泡，气泡会阻止相互间的充分作用。
加入异戊醇能降低分子表面张力，可以降低抽提过程中的泡沫产生。
一般采用氯仿与异戊酵为24：1之比。
也可采用酚、氯仿与异戊醇之比为25：24:1（不必先配制，可在临用前把一份酚加一份24：1的氯仿与异戊醇即成），同时异戊醇有助于分相，使离心后的上层水相，中层变性蛋白相以及下层有机溶剂相维持稳定。
加入酚/仿抽提，离心后在水相和有机相间没有出现变性蛋白相层，在随后的乙醇沉淀步骤中却出现大量的半透明沉淀，溶解后发现蛋白浓度很高？乙醇沉淀时，较纯的质粒沉淀是白色的（PEG纯化的沉淀是透明的肉眼不易发现），如沉淀是半透明的凝胶状，则应是蛋白含量高。
参考见解：首先看看平衡酚是否已被氧化？pH是否是8.0？其次检测溶液III反应完成后的离心上清pH是否在8.0左右？有时由于溶液III配置的问题，会出现溶液III反应后离心的上清pH与8.0偏差较大的现象，这会降低平衡酚抽提蛋白抽的有效性，pH偏差过大也会导致水相和平衡酚互溶。
使用酚仿抽提方法，质粒的纯度很好，但酶切不能完全切开?参考见解：1、确认酶的有效性。
2、平衡酚是否被氧化（正常是黄色，而氧化后是棕色的）。
3、是否不小心吸入了痕量的酚。
4、乙醇沉淀后，70%乙醇漂洗的是否充分（残留的盐类会影响酶切）。
5、乙醇漂洗后是否完全干燥（残留的乙醇会影响酶切）。
碱裂解法提取的质粒DNA进行琼脂糖电泳进行鉴定时，看到的三条带分别是什么？参考见解：碱法抽提得到质粒样品中不含线性DNA，得到的三条带是以电泳速度的快慢排序的，分别是超螺旋、开环和复制中间体（即没有复制完全的两个质粒连在了一起）。
如果你不小心在溶液II加入后过度振荡，会有第四条带，这条带泳动得较慢，远离这三条带，是20-100kb的大肠杆菌基因组DNA的片断。
提取质粒中RNA没有去除？可能是RNase失效或效率不高。
参考见解：1、更换RNase A，并保证其储存条件是正确的2、手工提取质粒的，可单独增加一步去除RNA的步骤，溶液III反应后，在离心的上清中加RNase，室温下去除RNA 10min～30min（需要保证RNase A是经过失活DNase的），同时较高温度（如50℃）会更加快速完全的去除RNA，经验所得经过高温处理的质粒质量不是很高。
提取的质粒电泳后，为连续的一片火箭状？参考见解：1、质粒如果盐离子多，会有走胶变形的现象，如果提到的质粒不够纯，会有电泳条带不平齐的现象。
2、当电压太大时，容易出现火箭状，而降解应该是弥散状。
3、可能是宿主菌影响的，质粒抽提好后，用酚-氯仿处理一下再酶切，若有改善，则为宿主菌影响。
转化到其它宿主菌再切。
4、NaOH的浓度过高，会出现火箭状的结果。
用碱裂解法提取质粒，裂解5分钟，没有用酚/ 氯仿抽提，最后用灭菌水溶解质粒DNA15min。