第十一章 蛋白质的相互作用(Protein-Protein Interactions)
蛋白质相互作用
蛋白质相互作用与代谢性疾病
蛋白质相互作用在心血管疾病中发挥重要作用，如动脉粥样硬化的发生和发展。
心血管疾病
蛋白质相互作用也与自身免疫性疾病的发病有关，如类风湿性关节炎和系统性红斑狼疮中的免疫细胞信号转导。
自身免疫性疾病
蛋白质相互作用与其他疾病
蛋白质相互作用的干预策略
06
基于小分子的干预策略
总结词：通过小分子调节蛋白质相互作用，改变蛋白质复合物的组成或活性，从而调控细胞功能。
蛋白质相互作用与神经退行性疾病
肥胖症
蛋白质相互作用也与肥胖症的发生有关，如脂肪细胞分化、脂肪代谢等过程中的蛋白质相互作用。
非酒精性脂肪肝
蛋白质相互作用还涉及非酒精性脂肪肝的发病机制，如脂肪酸氧化和甘油三酯的积累。
糖尿病
蛋白质相互作用在糖尿病的发生发展中起到重要作用，如胰岛素与其受体之间的相互作用和信号转导。
蛋白质磷酸化修饰对相互作用的调控
去乙酰化酶抑制剂可以抑制去乙酰化酶的活性，从而增强乙酰化修饰的作用，促进蛋白质相互作用。这些抑制剂在癌症治疗和其他疾病治疗中具有潜在的应用价值。
乙酰化是一种通过将乙酰基团添加到蛋白质的特定氨基酸残基上，如赖氨酸和精氨酸，来调节蛋白质活性和功能的过程。这种修饰通常由乙酰化酶和去乙酰化酶催化。
结构生物学方法
VS
通过计算机模拟蛋白质的动态行为，预测蛋白质相互作用的模式和稳定性。
序列比对和进化分析
通过比较不同物种间同源蛋白质的序列差异，推断相互作用的可能性和进化关系。
分子动力学模拟
计算生物学方法
蛋白质相互作用网络
03Biblioteka 通过将两个蛋白质分别与两个转录激活因子融合，在酵母细胞中检测它们之间的相互作用。
蛋白相互作用
蛋白相互作用
蛋白相互作用是指两个或多个蛋白质之间的相互作用，这种相互作用可以是稳定的或短暂的。
蛋白质之间的相互作用可以通过多种方式实现，例如氢键、离子键、范德华力、疏水作用等。
蛋白相互作用在生物学中非常重要，它们可以控制细胞内的信号传递、基因调控、蛋白质的结构和功能等。
因此，对蛋白相互作用的研究对于理解生物学过程、疾病的发生机制以及药物研发具有重要意义。
目前，研究蛋白相互作用的方法包括结构生物学、生物物理学、化学生物学和计算机模拟等。
- 1 -。
蛋白质相互作用
蛋白质-蛋白质相互作用是功能复合物形成的基础。 （如线粒体内膜呼吸链）
Physiological functions of protein interactions Localization and Trafficking
Techniques：
免疫沉淀（非变性）
• 免疫沉淀的灵敏度取决于Protein A (or G) 与 IgG的Kd、IgG与 抗原的Kd值。所以增加抗原或抗体的浓度、使用与抗体直接共 价偶联的珠子进行免疫沉淀可以提高灵敏度；
* Kd Protein A Bead
IgG Kd
Antigen
*
IgG
Z XY
Protein A Kd
IgG Kd
Protein X*
Kd Protein Y
Kd Protein Z
Techniques：
免疫共沉淀（非变性）
细胞裂解液的几点考虑： 1. 复合物的稳定，提高灵敏度，但会降低特异性； 2. 针对特定的复合物，细胞裂解液中可能加入磷酸酯酶
抑制剂或者ATP及一些金属离子以维持复合物的稳定；
Elucidation of Protein-Protein
In vivo Imaging FRET BRET
Interactions
Protein Interaction Networks
Techniques：Principle, Process, Advantage and Disadvantage
细胞裂解与蛋白质 X的免疫沉淀
X YZ
蛋白质蛋白质相互作用
• Zheng et al. 2002
– 更多的基因组能够获得更多的功能相关蛋白结果 – 对于系统发育方法预测蛋白功能的准确性可能有基因组数量上限。
Discussion
• 参考基因组的数量确实能够影响预测能力
– 数量较少的基因组:18 or 35 – 多一些的基因组 :86 – 更多的基因组 :162
种的基因组。
这些选定的参考基因组用于其后的计算
系统发育谱的局限
➢ 仅能预测拥有全基因组序列的物种. ➢ 对于一些关键蛋白和共有蛋白中，由于在
多数物种中没有系统发育树差别，而无法 判断蛋白之间的相关性。
电子预测蛋白质相互作用方法 的评估
评估PPI 数据的重要性
• 假阴性和假阳性
– 蛋白质相互作用的动力学本质. 蛋白表达和相互作用模式在不同生 物学条件下是不同的,而目前所有的实验方法或计算方法都不能做 到动态检测或预测, 因此只能对真实存在的蛋白质相互作用, 得到 一个粗略的描述
– 把一个配体通过化学交联的方法结合在固相载 体上，让蛋白混合液流过固相载体，能够与配 体结合的分子具有较高的亲和力，通过适当的 洗脱条件将亲和力弱的分子洗脱掉，这样与配 体亲和力较高的分子就被纯化了出来。
– 纯化出的分子随后用凝胶电泳的方法分离，用 质谱的方法鉴定是什么蛋白。
Eur. J. Biochem. 270, 570-578 (2003)
Mirror Trees Method
该方法的假设前提是：相互作用的蛋白可能是共进化的。方法是：计算包含 不同物种的蛋白质家族间的进化距离，构建各自相应的进化树，在进化树之间相 似性距离的基础上，构建镜像树，然后由镜像树之间的相似性距离和蛋白质在镜 像树上的位置确定蛋白质之间的两两相互作用。
蛋白质相互作用
2、功能型蛋白芯片
它的识别分子主要是通过高通量的蛋白纯化、人工合成多 肽或化学分子制备而成，然后将其点在合适的固相基质表面。 这类芯片主要适用于蛋白质的生化功能以及相互作用研究， 如蛋白质的结合特性、酶的催化活性、蛋白质转录后修饰的 研究、小分子药物和药物靶标的筛选和鉴定等，即蛋白质与 蛋白质及其他分子相互作用谱图的研究网
ELISA的类型 的类型
1、双抗体夹心法
将已知抗体吸附于固相载 体，酶标记一抗。 检测液相中的可溶性抗原。
ELISA的类型 的类型
2、间接法 将已知抗原吸附 于固相载体，酶 标记二抗。 检测液相中未知 抗体。
ELISA的类型 的类型
3、直接法
将已知抗体或抗原吸 附于固相载体，酶标 记抗原或抗体 检测液相中的可溶性 抗体或抗原。
ITC
ITC 获取的结果示意图
上图：峰底与峰尖之间的峰面积为每次注射时释放或吸收的总热量。 下图：以产生或吸收的总热量为纵坐标，以加入杯中的两反应物之 摩尔比为横坐标作图，可得整个反应过程的结合等温曲线。
ITC具有的特点
1、它不干扰蛋白质和核酸的生理功能，具有非特异性的独 特优势，即对被研究蛋白质和核酸体系的溶剂性质、光谱性 质和电学性质等没有任何限制条件。 2、样品用量小,方法灵敏度高，测量时不需要制成透明清澈 的溶液。 3、实验完毕的样品未遭破坏，还可以进行后续生化分析。
蛋白质相互作用 蛋白质相互作用
2012-5-22
FRET ELISA 蛋白质芯片 SPR ITC
FRET现象
当供体荧光分子的发射光谱与受 体荧光分子的吸收光谱重叠，并 且两个分子接近到一定距离（110nm）时，就会发生一种非放射 性的能量转移，激发供体而产生 的荧光能量正好被附近的受体吸 收，使得供体发射的荧光强度衰 减，受体荧光分子的荧光强度增 强。
蛋白质相互作用
荧光共振能量转移 (FRET)
原理：FRET在蛋白质相互作用研究的 基本原理是分别将bait蛋白、prey蛋 白与相应的供体荧光基团(如ECFP)和 受体荧光基团(如 EYFP)融合
优点：能检测到瞬时、较弱的蛋白质 相互作用；能同时检测到两蛋白的细 胞分布和作用位点。 缺点：光谱可能存在重叠，影响实验 结果
Interaction Domain-Structral basis for protein interaction
相互作用区域是蛋白质相互作用的结构基础
1. PDZ结构域
2. LIM结构域
Interaction Domain-Structral basis for protein interaction
免疫共沉淀(Co-immunoprecipitation, Co-IP)
原理：利用抗体和抗原之间 特异性的识别和结合，通过亲 和纯化，分离出抗原蛋白和单 克隆抗体。 优点：保留蛋白质的修饰 和结合状态，同时所需的样本 量较少。 缺点：Co-IP特异性较低
双分子荧光互补 ( BiFC)
原理 ：将荧光蛋白分成两个无独 立功能的片段，分别与 bait 蛋白和 prey 蛋白融合表达。 优点：能简单方便地通过观察荧 光鉴定蛋白质相互作用 缺点：不能实时反应蛋白质的结 合和分离情况。
临界值内。如果两个结构域中至少有五个原子的距离在 5 Å 之内，那么这两个结构域之间存在相互作用。
Full Atom Contact (FAC) PSIMAP 方法 Sampled Atom Contact (SAC) PSIMAP
最精确
节约时间和搜索空间
Bounding Box Contact (BBC) PSIMAP
9
Protein-protein interaction 蛋白间的相互作用
Protein-Protein InteractionsProtein Structure•The fundamental unit ofprotein structure is adomain.•This region of a polypeptidechain folds into a distinctstructure and mediates theprotein’s biologicalfunctionality.Abstract View of ProteinStructure•Proteins are representedas shaded areas and thedomains as geometricalfigures.•We assume that proteindomain (or domaincombination) interactionsare responsible forprotein interactions.Gen ome: 30.000 genesTranscript ome: 40-100.000 mRNAsProt eome:100-400.000 proteins >1.000.000 interactionsDimensions of InformationComplexityGenomics vs. Post-GenomicsHuman Genome Human Proteome TranscriptsProtein Interaction105106A proteomics circuit showing theinteraction of RNA splicing proteinsSource: Campbell/Heyer. Discovering genomics, proteomics, and bioinformaticsTerminologyProtein Complexes are groups of proteins that interact with each other at the same time and place, forming a single multi-molecular machine.E.g., anaphase-promoting complex, RNA-splicing andprotein export and transport complexes, etc. Functional modules consist of proteins that participate in a particular cellular process while binding each other at a different time and place (different conditions or phases of the cell cycle, in different cellular compartments, etc).E.g., yeast pheromone response pathway, MAPsignaling cascades, etc.How can we identify Protein-Protein Interactions ?1. In vitro interactions.2. In vivo interactions.3. How does this fit together?Identification of Protein-ProteinInteractions byCo-ImmunoprecipitationCo-Immunoprecipitation - PrincipleA variation ofCo-Immunoprecipitation:Reverse Co-Immunopreciptiation combined with cross-linking Spatial organisation of P-P-interactionsCross-linkerse.g. bifunctional sulfhydril-reactive crosslinkers:e.g. Maleimide-esterHomobifunctionalPeriodatecleavable!Identification of Protein-Protein Interactions by Pull-Down methodsprepare proteinThe GST fusion protein might have different origin: Bacterial and yeast expression systemsHigher eukaryotic expression systems (insect cells/ baculovirus)Various Affinity tags commonly used:GSTPoly-Histidine (IMAC)Calmoduline binding protein (CBP)………Multi-Tags e.g. TAP-tag:T andem Affinity Purification (TAP)Identification of Protein-Protein Interactions byProtein chipsCapture)Identification of Protein-Protein Interactions by Surface Plasmon Resonance(SRP)BackgroundTypical SRP dataGroups on Molecules Available for Immobilisation •Primary Amines •Carboxylic acids•Thiols•Sugars (aldehydes)•Lipids •Tags ԪBiotin ԪGST ԪFc ԪPoly-HIS2. In vivo interaction studiesIdentifying protein interactions in vivoProteomicsA more comprehensive yeast protein interaction networkDeletion phenotype:Red = lethalGreen = non-lethalOrange = slow growth Yellow = unknownSource: Jeong H et al (2004) Nature 411:41-42•An example of a scale-free network–Most nodes have fewconnections– A small number ofnodes (network hubs)are connected to alarge number of othernotesIdentification of Protein-Protein Interactions by Yeast 2-Hybrid SystemYeast two-hybrid system:a genetic assay for detecting protein-protein interactionsX YSuppose we have two proteins...One way of answering this question is to use the yeast two hybrid method.To understand the method we must firstconsider how gene expression is regulated in yeast......and the question,do these two protein bind each other?a genetic assay for detecting protein-protein interactionsRegulation of gene expression in yeastgeneUAS(upstream activation sequence)transcription activatorDNA binding domainactivation domaintranscription machinery and now back to the question...a genetic assay for detecting protein-protein interactionsXYDo these two protein bind?Regulation of gene expression in yeastgene UAS(upstream activation sequence)transcription activatorDNA binding domainactivation domaintranscription machinery reporter geneWe start with yeast possessing a reporter gene (a gene making a product that is easy to detect).And now we introduce genes coding for two hybrid proteins.....Use of the yeast two-hybrid systemYeast Two-Hybrid:Detecting protein-protein interactions in yeast---Interactions can be screened for strength。
蛋白质相互作用(protein interaction)的研究方法
蛋白质相互作用的研究方法万维松 2016-7-23为什么要进行蛋白质研究？（1）蛋白质是细胞的功能分子（2）蛋白质表达水平受到诸多因素的调控（3）DNA/RNA水平与蛋白质水平没有正相关性（4）DNA/RNA层面无法获知蛋白质翻译后修饰（5）蛋白质是药物治疗的重要靶位（6）蛋白质研究是后基因组时代的终极目标为什么要研究蛋白质的相互作用？蛋白质控制了细胞中的所有生物系统，但是，通常它们不是“单打独斗”，绝大多数蛋白质会与其他蛋白质相互作用，一起参与生命过程。
蛋白相互作用有哪些类型？◆稳定相互作用（ Stable interactions ）指那些通常以多亚基复合物（ multi-subunit complexes ）纯化得到的相互作用蛋白，这些亚基可以是相同的，也可以是不同的。
Eg:血红蛋白（αβ）；核心RNA聚合酶（α2ββ’ ）◆瞬态相互作用（ Transient interactions ）被认为控制了主要的细胞过程，它们的相互作用是暂时的，并需要一定的条件来促进相互作用，如甲基化、磷酸化、构象改变等。
瞬态相互作用可强可弱，可快可慢。
蛋白相互作用的研究方法◆In Vivo 体内方法◆In Vitro 体外方法◆In Silico 生物信息学方法常用研究技术Method Interactions type Property Adhibition Co-IP Stable or strong 内源筛选互作蛋白Pull-Down Assay Stable or strong 外源筛选互作蛋白TAP Stable or strong 标签筛选互作蛋白SILAC-PAP Stable or strong 标签筛选互作蛋白BioID Transient 、weak orinsoluble 内源筛选互作蛋白Far-Western BlotAnalysisModerately stable 外源验证互作蛋白IP Stable or strong 内源验证互作蛋白BiFc Transient or weak 内源验证互作蛋白IP/Co-IP(内源)IP/Co-IP (内源)Endogenously expressed FBXW7 and HSF1 interact.(a ) Native FBXW7 was immunoprecipitated (IP) from cell extracts with anti-FBXW7 antibody , followed by immunoblotting as indicated.Rabbit IgG was used as control. Arrow indicates FBXW7 in input.BaitInteracting proteinGST Poly HisIP、Co-IP and Pull-Down比较AP(标签)◆AP：Affinity Purification◆TAP：Tandem Affinity Purification ◆PAP：Parallel Affinity PurificationTAP (Flag-SBP/HA)◆TAP是Co-IP的“近亲”，两者在寻找诱饵蛋白的互作蛋白以及纯化互作蛋白的原理类似。
细胞信号通路中的蛋白质相互作用及其功能
细胞信号通路中的蛋白质相互作用及其功能细胞内蛋白质的相互作用是细胞信号通路的基本机制之一。
在细胞内，不同的蛋白质之间通过相互作用来完成细胞信号传导、转录调控、细胞分裂等生命活动。
这些相互作用形成了复杂的信号通路网络，调节着细胞的生理和病理过程。
一、蛋白质相互作用的种类蛋白质相互作用的种类非常多。
其中，最为常见的是蛋白质-蛋白质相互作用、蛋白质-核酸相互作用和蛋白质-膜蛋白相互作用。
蛋白质-蛋白质相互作用是指两个或多个蛋白质之间形成的相互作用。
这种相互作用形成了信号通路的基本模块，例如信号转导中的酶催化，转录因子在启动子上的结合等等。
蛋白质-核酸相互作用是指蛋白质与核酸之间的相互作用。
这种相互作用在转录和翻译等过程中起着重要的作用，例如转录因子结合DNA启动子、mRNA与核糖体结合等。
蛋白质-膜蛋白相互作用是指蛋白质与膜蛋白之间的相互作用。
这种相互作用在细胞信号传递中起着至关重要的作用，例如受体与其配体的结合、细胞骨架上的膜蛋白结合等。
二、蛋白质相互作用的探究方法了解蛋白质相互作用对于研究细胞信号通路至关重要。
目前，针对蛋白质相互作用的探究方法主要包括蛋白质亲和层析、GST pull down、LUMIER、双杂交等多种方法。
蛋白质亲和层析是指通过蛋白质与其靶分子的亲和力来分离靶分子的方法。
这种方法的优点是能够直接分离出与目标蛋白质相互作用的蛋白质，但缺点是它只能在已知的蛋白质相互作用中使用。
GST pull down是利用纯化的GST-tagged蛋白质来诱导其结合目标蛋白的方法。
该方法较为简单易行，但其缺点在于GST标签可能影响蛋白质的功能和折叠。
LUMIER是一种内在检测蛋白质相互作用的方法。
该方法利用流感病毒蛋白NS1和Luciferase来检测蛋白质-蛋白质相互作用。
LUMIER方法不需要添加任何标签和染料，因此不会对蛋白质的功能和结构造成影响。
双杂交是指通过酵母或细胞的双杂交系统来检测蛋白质相互作用的方法。
质谱分析蛋白质的相互作用
蛋白质间的相互作用存在于生物体每个细胞的生命活动过程中，互交叉形成网络，成细胞中一系列重要生理活动的基础。
其中，多数蛋白质是通过与配体分子结合或者是作为1个大的生物复合体的一部分，与细胞完整性维持、遗传物质复制、基因表达调控、信号转导、免疫应答等一系列生命过程。
研究蛋白质间相互作用的方式和程度，将有助于蛋白质功能的分析、疾病致病机理的阐明和治疗和新型药物的开发等众多难题的解决。
因此，确定蛋白质间相互作用关系、绘制相互作用图谱已成为蛋白质组学研究的热点。
近年来有许多方法被用于蛋白质相互作用的研究，酵母双杂交技术，免疫共沉淀技术，串联亲和纯化技术，化学交联技术，蛋白质芯片技术，荧光共振能量转移技术，噬菌体展示技术等。
酵母双杂交技术Fields和song等首先在研究真核基因转录调控中建立起来的，是在真核细胞中检测蛋白质与蛋白质之间的相互作用的方法。
该系统是通过两个分别称之为“诱饵蛋白”和“捕获蛋白”的融合蛋白形成一个完整的转录激活因子，从而激活报告基因的表达，通过在营养缺陷型培养基上生长或呈现显色反应来检测系统的功能。
酵母双杂交系统可在全基因组规模上进行蛋白质一蛋白质相互作用高通量的研究。
免疫共沉淀技术免疫共沉淀是利用抗原和抗体的特异性结合以及细菌的Protein A或G特异性地结合到免疫球蛋白的Fc片段的现象开发出来的方法。
其基本原理是，在细胞裂解液中加入抗兴趣蛋白的抗体，孵育后再加入与抗体特异结合的结合于Agarose珠上的Protein A或G，若细胞中有与兴趣蛋白结合的目的蛋白，就可以形成这样一种复合物：“目的蛋白—兴趣蛋白—抗兴趣蛋白抗体—Protein A或G”，经变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，复合物又被分开。
然后经免疫印迹或质谱检测目的蛋白。
这种方法得到的目的蛋白是在细胞内与兴趣蛋白天然结合的，符合体内实际情况，得到的结果可信度高。
这种方法常用于测定两种目标蛋白质是否在体内结合；也可用于确定一种特定蛋白质的新的作用搭档。
两个蛋白质相互作用
两个蛋白质相互作用
蛋白质之间的相互作用可以通过多种方式实现。
其中，蛋白质
之间的结合是最为常见的一种方式。
蛋白质可以通过它们的结构中
的特定区域与其他蛋白质结合，形成蛋白质复合物。
这种相互作用
可以是暂时性的，也可以是持久的。
另一种蛋白质相互作用的方式是酶与底物之间的相互作用。
酶
是一种特殊的蛋白质，它们可以催化化学反应，而这种催化作用往
往需要与特定的底物结合。
这种结合是高度特异性的，酶只能与特
定的底物结合并催化特定的化学反应。
除了上述方式之外，蛋白质之间还可以通过信号传导途径进行
相互作用。
在细胞内，蛋白质可以通过与细胞膜上的受体蛋白结合，从而传递特定的信号。
这种相互作用对于细胞内的信号传导和调控
起着至关重要的作用。
总的来说，蛋白质之间的相互作用是生物体内各种生命活动的
基础。
对这些相互作用的深入研究不仅有助于我们更好地理解生命
的本质，也为新药物的研发和疾病的治疗提供了重要的理论基础。
因此，对蛋白质相互作用的研究具有极其重要的意义。
蛋白质相互作用ppt课件
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• 从蛋白质相互作用到生物学功能。运用蛋白 质直接相互作用，发现相互作用蛋白质，再 分析这些作用的生物学意义。
容易犯的错误：研究一大堆的蛋白相互作用， 却不知道这些相互作用有什么生物学意义。
• 从物学功能到蛋白质相互作用。通过改变生 物学现象，分析蛋白质间的遗传相互作用， 进一步研究相关蛋白质的相互作用。
精选课件PPT
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Affinity interaction（亲和作用）
GST pull down：已知蛋白质和GST融合，与细胞或 组织的“蛋白质汤”混合，用谷胱甘肽亲和层析分离 和已知蛋白质结合的新蛋白质。GST tag。
Biotin－Avidin结合：Biotin标记已知蛋白质，通过 Avidin结合biotin标记的蛋白质，从而得到与biotin 标 记蛋白结合的新蛋白质。优点是biotin－avidin的结 合是最牢靠的；缺点是细胞内结合biotin的蛋白质很 多。
1
2
3
1. 抗体很差， 2. Western blot问题 3. Loading比例不对 4. 样品太多 5. 正确
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精选课件PPT
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蛋白质-蛋白质直接相互作用
•Co-immunoprecipitation and antigen-antibody interaction（免疫共沉淀和抗原抗体结合） •Affinity interaction（亲和作用） •Yeast two-hybrid and phage display（酵母双 杂交和噬菌体展示） •Surface Plasmon Resonance •FRET •Proteomic analysis（蛋白质组学技术）
寻找受体的配体 7肽：8x1016
蛋白质之间的相互作用
实用文档
优点为： （1）相互作用的蛋白质都是经翻译后修饰的，处于天然状态； （2）可以分离得到天然状态的相互作用蛋白复合物。
实用文档
蛋白质芯片
原理是对固相载体进行特殊的化学处理，再将已知的蛋白分子产物固定 其上，根据这些生物分子的特性，捕获能与之特异性结合的待测蛋白经 洗涤、纯化，再进行确认和生化分析
它具有以下优点： 1. 直接用粗生物样品（血清、尿、体液）进行分析 2. 同时快速发现多个生物标记物 3. 具有高通量的验证能力 4.可以发现低丰度蛋白质 5. 在同一系统中集发现和检测为一体 特异性高 利用单克隆抗体芯片，可鉴 定未知蛋白质，以减少测定蛋白质序列的工作量。
实用文档
局限性
1.双杂交系统分析蛋白间的相互作用定位于细胞核内， 而许多蛋白间的相互作 用依赖于翻译后加工， 而这些反应在核内无法进行。另外有些蛋白的正确折叠 和功能有赖于其他非酵母蛋白的辅助， 这限制了某些细胞外蛋白和细胞膜受体 蛋白等的研究。 2.酵母双杂交系统的一个重要的问题是“假阳性”。由于某些蛋白本身具有激活 转录功能或在酵母中表达时发挥转录激活作用， 使DNA结合结构域杂交蛋白在 无特异激活结构域的情况下可激活转录，即自激活。 3.另外，某些蛋白表面含有对多种蛋白质的低亲和力区域， 能与其他蛋白形成 稳定的复合物， 从而引起报告基因的表达， 产生"假阳性"结果。 4.外源蛋白对酵母菌的毒性作用
缺点为： （1）可能检测不到低亲和力的蛋白质－蛋白质相互作用； （2）两种蛋白质的结合可能不是直接结合，而可能有其它蛋白在中间起桥 梁作用；
蛋白相互作用
蛋白相互作用蛋白相互作用是指蛋白质之间相互结合并发挥特定的生物学功能的现象，是生物分子之间交互作用的重要形式。
蛋白质分子在生物体内承担着各种重要的生物学功能，包括生物体结构的维持、代谢过程的调控、细胞信号传递等等，这些生物学功能通常是通过蛋白质之间的相互作用来实现的。
1.蛋白基质的特性蛋白质是由氨基酸组成的生物大分子，具有非常复杂的分子结构和特性。
蛋白质的分子量较大，通常在1万到100万Dalton之间。
蛋白质的分子结构复杂，通常包括四级结构，即原形结构、二级结构、三级结构和四级结构，不同结构之间的相互关系非常紧密，对蛋白质的生物学功能具有重要影响。
蛋白质之间的相互作用主要包括两种类型，即非共价相互作用和共价相互作用。
非共价相互作用包括氢键、范德华力、离子键和疏水相互作用等，这些相互作用通常不会改变蛋白质结构的共价键，因此是可逆的。
共价相互作用通常涉及共价键的形成和切断，通常不是可逆的。
蛋白相互作用对生物学过程具有非常重要的影响。
例如，酶的活性往往需要与底物结合形成复合物，酶的催化作用通常通过酶与底物分子之间的相互作用实现。
另外，蛋白质之间的相互作用还可以发挥调节作用，例如，酶的调节机制往往涉及到酶与调节蛋白之间的相互作用。
另外，许多生物过程，如细胞分裂、DNA复制和基因转录等都涉及到蛋白质之间相互作用的调节。
蛋白之间的相互作用和分子识别密切相关，分子识别是指分子之间对特定的化合物或者化学结构的识别和选择性结合。
蛋白质通常具有一定的结构特异性，因此可以通过其特有的结构来识别某些特定的分子。
分子识别通常涉及到许多生物学过程，包括细胞信号传递、代谢调节和免疫系统的应答等等。
5.蛋白质相互作用的研究方法目前，研究蛋白质相互作用的方法较为多样，通常包括结构生物学、生物物理学、化学生物学、细胞生物学等等。
其中，结构生物学方法可以提供蛋白质结构和分子识别的详细信息，生物物理学方法可以研究蛋白质之间的相互作用力和结合能，化学生物学方法可以对蛋白质结构进行修饰以及研究不同化合物对蛋白质结构的影响，细胞生物学方法可以研究蛋白质之间在细胞内的相互作用。
蛋白质相互作用网络
另外，为研究模体中组成蛋白的功能 对其进化保守的影响，研究者将模体和生 物功能通过模体的组成蛋白质连接起来。 分析发现，大的模体具有很明显增加的功 能一致性。例如，95%的全连通的五节点 模体，其所有的组成蛋白至少共享一个生 物功能； 相反，10%的两节点模体是功能 一致的。
二、蛋白质组学
蛋白质组学（Proteomics）主要是大规模 地研究蛋白质的结构和功能。 定义：在一定时间内一个细胞或一类细胞 中存在的所有蛋白质被称为蛋白质组 （proteome），意指proteins expressed by a genome，即一个细胞或一个组织的 “基因组所表达的全部蛋白质”。
蛋白质还可以帮助伤口血液凝固并促 进其愈合。
2.调节生物体的生理机能 构成生物体差不多所有的生命活性物质，例 如： 催化体内各种生物化学反应的酶
调节机体生长、发育并行使正常生理 功能的激素
抵御外来细菌和病毒的抗体及免疫类 物质，当蛋白质充足时，一旦需要这 些抗体和免疫物质在数小时内就可以 增加数百倍。 参与细胞的信号转导，调控细胞的发 育和凋亡，乃至生物体的命运。 形成生物体的渗透压，引发生物体的 各种活动，例如肌肉的做功等。
MIPS:
http://www. helmholtzmuenchen.d e/en/mips/ BioGrid: http://www. thebiogrid.o rg/。
3.运输载体 蛋白质是生物体内很多重要的代谢物和营养 素的载体。 氧、脂类、维生素、矿物质与微量元素都需 要利用各种蛋白质运输到生物体需要的地方。 例如，血红蛋白质可以输送氧；脂蛋白可以 输送脂肪。 蛋白质还可以充当营养物质储备，例如植物 种子中的大量蛋白质，就是在萌发时用的储 备。
蛋白质-蛋白质相互作用
蛋白质与蛋白质之间相互作用构成了细胞生化反应网络的一个主要组成部分，蛋白-蛋白互作网络与转录调控网络对调控细胞及其信号有重要意义。
把原来spaces空间上的一篇蛋白质与蛋白质间相互作用研究方法转来，算是实验技巧分类目录的首篇。
(另补充2：检测两种蛋白质之间相互作用的实验方法比较)一、酵母双杂交系统酵母双杂交系统是当前广泛用于蛋白质相互作用组学研究的一种重要方法。
其原理是当靶蛋白和诱饵蛋白特异结合后，诱饵蛋白结合于报道基因的启动子，启动报道基因在酵母细胞内的表达，如果检测到报道基因的表达产物，则说明两者之间有相互作用，反之则两者之间没有相互作用。
将这种技术微量化、阵列化后则可用于大规模蛋白质之间相互作用的研究。
在实际工作中，人们根据需要发展了单杂交系统、三杂交系统和反向杂交系统等。
Angermayr等设计了一个SOS蛋白介导的双杂交系统。
可以研究膜蛋白的功能，丰富了酵母双杂交系统的功能。
此外，酵母双杂交系统的作用也已扩展至对蛋白质的鉴定。
二、噬茵体展示技术在编码噬菌体外壳蛋白基因上连接一单克隆抗体的DNA序列，当噬菌体生长时，表面就表达出相应的单抗，再将噬菌体过柱，柱上若含目的蛋白，就会与相应抗体特异性结合，这被称为噬菌体展示技术。
此技术也主要用于研究蛋白质之间的相互作用，不仅有高通量及简便的特点，还具有直接得到基因、高选择性的筛选复杂混合物、在筛选过程中通过适当改变条件可以直接评价相互结合的特异性等优点。
目前，用优化的噬菌体展示技术，已经展示了人和鼠的两种特殊细胞系的cDNA文库，并分离出了人上皮生长因子信号传导途径中的信号分子。
三、等离子共振技术表面等离子共振技术(Surface Plasmon Resonance，SPR)已成为蛋白质相互作用研究中的新手段。
它的原理是利用一种纳米级的薄膜吸附上“诱饵蛋白”，当待测蛋白与诱饵蛋白结合后，薄膜的共振性质会发生改变，通过检测便可知这两种蛋白的结合情况。
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第十一章蛋白质的相互作用(Protein-Protein Interactions)1. 概况随着人类基因组测序工作的完成，生命科学进入到后基因组和蛋白组的时代。
因此，蛋白质的相互作用研究就显得越来越重要。
生命活动过程与蛋白质的相互作用是密不可分的，如DNA合成、基因转录激活、蛋白质翻译、细胞周期调控、信号转导等重要的生命过程均涉及到蛋白质复合体的作用。
下面以Wnt 信号通路为例对此加以说明。
Wnt信号通路是一条保守性很强的信号通路，该通路调节控制许多的生命过程，如细胞形态与功能的分化及维持、免疫、应激、细胞癌变与凋亡等等。
Wnt信号通路的作用分子包括：Wnt蛋白家族成员、卷曲(frizzled) 蛋白、Dishevelled蛋白、β-联蛋白(β-catenin)、轴蛋白(axin)、结肠癌抑制因子(APC)、糖原合酶激酶(GSK3β)、β-TrCP蛋白、淋巴增强因子(LEF)/T细胞因子(TCF) 等。
当没有Wnt信号时，GSK3β、APC、axin组成破坏复合体，使β-联蛋白被磷酸化，最终泛肽化而降解。
细胞核内，转录抑制因子Groucho家族成员与转录因子TCF形成复合物，通过HMG框结合在靶基因上，抑制靶基因的转录。
当有Wnt信号传入时，通路中的下游分子Dsh抑制了破坏复合体的作用，β-联蛋白在胞质中积累进入核内，TCF与入核的β-联蛋白结合，导致其与Groucho的结合下降，从而去除抑制作用，激活了靶基因的转录。
从上面可以看出，蛋白质的相互作用包括三个方面：⑴多亚基蛋白质的形成：即分离纯化后可形成两个或多个不同蛋白质，如血红素、色氨酸合成酶、大肠杆菌DNA合成复合酶等。
⑵多成分的蛋白质相互作用，如核孔复合体、剪接体、纺锤体等。
⑶瞬时的蛋白质相互作用，控制着一些重要的生命活动。
所有的蛋白质修饰过程都需要这类相互作用。
这类相互作用几乎参与调节细胞内基本生命活动的所有形式，如细胞生长、细胞周期、代谢途径、信号转导等。
除了蛋白质修饰以外，其他过程如转录复合体与特定启动子的结合、蛋白质的跨膜运输、新生肽链的折叠、也包含了瞬时的蛋白质相互作用。
2. 蛋白质相互作用的研究策略与方法2.1生化方法2.1.1蛋白质亲和层析⑴方法在一定的条件下，某种蛋白质可以共价连接在基质如琼脂糖(Sepharose) 上，用以结合抽提物中能与该种蛋白质结合的配体蛋白质，抽提物过柱后，用低盐溶液洗脱下未结合的物质，然后用高盐溶液或SDS 洗脱下结合在柱上的蛋白质。
有时污染物的存在会影响相互作用的结果，因此蛋白质纯化是蛋白质亲和层析成功的前提。
⑵蛋白质的纯化方法获得纯化蛋白质的一个简单方法就是利用融合蛋白，目前常用的融合蛋白为谷胱甘肽S转移酶(glutathione S-transferase, GST)，可以在谷胱甘肽-琼脂糖柱上纯化。
其他的还有staphylococcus蛋白A可在含IgG的柱上纯化；含少数组氨酸的肽段在镍柱上纯化；麦芽糖结合蛋白可以在含直链淀粉的柱子上纯化。
蛋白质亲和层析⑶检测方式在亲和柱上，可以利用纯化的融合蛋白以两种方式检测相互作用。
一是将融合蛋白共价链接在树脂上，让抽提物过柱；二是把融合蛋白共价结合在珠子上，使抽提物和珠子混在一起。
⑷优点利用蛋白质亲和层析来检测蛋白质的相互作用有以下四个方面的优点：①灵敏度高：在高浓度固定蛋白质的条件下，可以检测微弱的相互作用（结合常数为10-5mol/L), 而生理上相关的最微弱的相互作用在10-3mol/L范围内。
②可以同时检测抽提物中所有的蛋白质，即所有蛋白质与固定蛋白质的结合机会均等。
③通过构建突变体，可以检测与特异性相互作用有关的蛋白质结构域或关键的氨基酸残基。
④可以检测多亚基蛋白质之间的相互作用。
⑸出现假阳性结果的原因及部分消除办法虽然蛋白质亲和层析技术能有效地检测蛋白质相互作用，但是也存在一些假阳性的结果，原因有以下几点：①电荷间的相互作用是带电性质相反的两种蛋白质相结合；可以用带相同离子电荷的对照柱来消除。
②通过B蛋白，A蛋白与亲和柱上检测蛋白质间接结合。
③两种蛋白质的细胞定位不同，但是人为因素提供结合机会，有的甚至能高特异性结合。
一个最著名的例子就是肌动蛋白与DNaseⅠ之间的高亲和力。
2.1.2 亲和印迹蛋白质用聚丙烯酰胺凝胶电泳分离后，转移到NC膜上，然后用特异性的蛋白质、肽段或配体来检测膜上的蛋白质。
该技术与Western blotting有些类似，只不过Western blotting是利用抗体的探针。
复杂的蛋白质混合物，如全细胞裂解液，通过该技术可以直接分析，而不需要纯化，因此，该方法特别适合于分析膜蛋白，如细胞表面受体。
在凝胶电泳之前，可以先分离细胞裂解物以提高该方法的灵敏度，使低丰度蛋白质的相互作用也可以被检测到。
该方法涉及几个关键：膜上蛋白质的生物活性蛋白质配体的制备检测方法通常混合物在有SDS存在的情况下分离，而在印迹时需要去除变性剂，使变性蛋白质的全部或部分变性。
如果蛋白质在变性后无法复性，那就需要一个非变性的胶分离系统。
蛋白质探针的制备有多种方法，探针可以用放射性标记，也可以用生物素标记，或是使用亲和标签等方法。
2.1.3 免疫共沉淀⑴概念：免疫共沉淀是一种经典的检测蛋白质相互作用的方法，其实验过程比较简单。
裂解细胞后，加入抗体，抗原被沉淀下来后洗涤，去除非特异性结合，再分析结合复合体。
抗体可以是单克隆抗体，也可以是多克隆抗体。
被分析的蛋白质可以加上一个抗原决定簇的标签，如12CA5、c-Myc，便于用特异性的抗体检测。
⑵免疫共沉淀实验的真实性需要用以下几条标准来验证①抗原的沉淀是由于本身抗体的结合引起的，而不是制备中被污染的抗体。
单克隆抗体不存在这个问题；在使用多克隆抗体时，需要对该抗体进行预处理，即将抗体与不包含抗原的抽提物混合在一起，去除与抗体结合的污染物。
②只有在抗原存在的情况下，加入抗体后，才能检测到沉淀蛋白质，即抗体本身不识别沉淀蛋白质。
③这种相互作用是否直接或是通过第三个蛋白质引起的。
④相互作用是真实的体内过程，而不是细胞裂解的结果。
⑶免疫共沉淀的优点①与蛋白质亲和层析一样，它检测的是细胞裂解原液中所有蛋白质与检测蛋白质的相互作用；②抗原和抗体的相互作用是在生理浓度的条件下被检测的，因此过量表达所带来的假阳性结果可以被排除；③可以检测到在体内形成的天然复合体，如果该复合体无法在体外条件下形成；④天然状态的蛋白质如果经过翻译后修饰，依赖于或不依赖于修饰的蛋白质，相互作用可以被检测到。
⑷免疫共沉淀的缺点虽然该方法应用广泛，但也存在一些明显的缺点。
①有时免疫共沉淀的蛋白质并非直接相互作用。
如EIA与p107可以相互作用，p107与cyclinA可以相互作用，EIA与cyclinA能同时被免疫沉淀。
②与其他方法相比（如蛋白质亲和层析），免疫共沉淀的灵敏度不高，这是由于抗原浓度低于亲和层析中的蛋白质浓度造成的。
2.1.4 化学交联法(Chemical Crosslinking Approach)⑴方法使用一种交联剂，并且在交联试剂的光激活部分带有标记，将该试剂耦联到一蛋白质上，耦联体与抽提物温育在一起。
如果抽提物中的A蛋白能与耦联蛋白质发生相互作用，光激活后交联剂的一部分就结合到A蛋白上。
加入还原剂、切割交联试剂，使A蛋白上带有交联剂上有标记的部分，然后通过凝胶电泳等方法分析该蛋白质。
图⑵优点利用交联技术检测蛋白质相互作用的优点有：①它能检测到微弱的相互作用；②它能检测到动态过程不同阶段与不同蛋白质的瞬时相互作用，如糖基化过程；③通过能穿膜的交联试剂，交联可在体内发生。
⑶缺点主要缺陷是没有选择性，交联试剂可与近范围内的蛋白质发生反应。
所以，有时所检测到的蛋白质相互作用可能是个假象，需要通过其他方法加以验证。
2.1.5 荧光共振能量转移法(fluorescence resonance energy transfer, FRET)⑴方法FRET是一个无辐射、量子级能量转移现象，它指的是当一个荧光分子（即供体）受到激发时，能量向邻近的另一荧光基团（即受体）转移的过程。
但仅当受体与供体间的距离小于10 nm且受体的吸收光谱和激发光谱有重叠时，FRET才能发生，并且随着光谱重叠的增加，FRET的效率将增高，同时FRET可能发生的距离也将增加。
使用FRET可用来检测蛋白质之间的相互作用，将两个蛋白质分别使用CFP/YFP（或BFP/GFP) 标记，当两者在同一细胞中表达时，只要检测到FRET发生，则证明两个蛋白质间的距离小于10nm，存在相互作用。
用此方法已经成功地验证了CFP-钙调蛋白与M13-YFP融合蛋白间、FHL3与FHL2、EGF受体与Grb2等蛋白质之间的相互作用。
⑵优、缺点GFP-FRET将活体高分辨率观测和细胞、亚细胞定位相结合，使得用显微镜观察纳米水平的距离变化成为可能，为人们在活体中观察生物大分子的相互作用提供了一个有效方法。
但是，在活体GFP-FRET的研究中，常常存在着信号太弱、细胞自发荧光等不利因素影响实验结果。
2.1.6 生物传感器技术即BIA (biomolecular interaction analysis)-core，生物传感器的工作原理是基于表面等离子共振(surface plasmon resonance, SPR)，即配体和分子结合时会引起作用平面（平面或近似平面）折射率的变化。
这种光信号可被光感受器接受并转换成电信号传递到计算机，再由计算机还原为模拟的生物信号。
BIA-core 以共振单位(resonance unit, RU) 来衡量，1,000 RU相当于每平方毫米1纳克的质量。
采用生物传感器检测芯片上的配体与待检分子的结合时，需要考虑很多因素的影响，如原料输送速率、配体种植密度、待检分子浓度、以及这种结合本身的亲和力大小等。
原料输送速率是指分子从输送流层投递到芯片表面的速率。
这些参数可直接或间接地被实时测量，由计算机推算出初始结合速率。
BIA-core除具有现代生物传感器的基本特点外，最大的特色在于其附带的分析软件。
它内置若干描述蛋白质相互作用的方程模型，在模型的基础上根据采集的数据给出结合速率对各参数的偏微分方程，计算出初始结合率。
采用人机对话框，可根据要求作图和给出数据。
同时生物传感器也可与质谱联用，直接监测芯片上配体所捕获的分析物分子的相对分子质量。
2.2 分子生物学方法2.2.1 酵母双杂交酵母双杂交系统于1989年由Fields和Song创立，是用来研究蛋白质与蛋白质之间相互作用的简便而有效的方法，又称为“相互作用陷阱”。
双杂交系统通常在酵母细胞中构建，首先需要构建两种杂合反式作用因子，将蛋白质X与报道基因转录因子的特异BD (DNA binding Domain, DNA结合结构域，如Gal4-BD, LexA-BD) 融合，成为“诱饵”蛋白。