慢病毒构建原理
慢病毒构建技术原理
慢病毒构建技术原理
慢病毒载体可以将外源基因或shRNA有效整合到宿主染色体上，从而达到持久表达目的序列的效果。
慢病毒除了对肿瘤细胞、肝细胞、内皮细胞等具有很高的感染效率外，对于一些较难转染的细胞如神经元、干细胞等，也具有良好的感染效率，此外，使用慢病毒载体能大大增加目的基因或shRNA整合到宿主细胞基因组的几率，从而实现目的基因或shRNA在宿主细胞中持续、稳定的表达。
因此，在体外实验及体内实验的研究中，慢病毒己经成为表达外源基因或shRNA最常用的载体形式之一，正得到越来越广泛的应用，在诸如CAR-T细胞治疗领域已经进入到了临床的应用。
采用最新的慢病毒包装体系和生产工艺，确保病毒高滴度、高纯度和低毒性，同时，提供多种基因操作类型和筛选标记方案，满足各种细胞和动物实验需求。
慢病毒载体的构建
重组慢病毒的产生：瞬时转染法，即将包装结构和载体结构瞬时共转染法如
293T 高表达细胞系而产生重组慢病毒。此法非常成功，大多实验室采用此法。包膜 质粒、包装质粒与载体质粒共转(多用磷酸钙共沉淀法)染293T细胞直接产生生产细胞。 最后重组慢病毒分泌到培养基中进行培养而得到大量载体慢病毒。 例如用以下三质粒来包装产生重组慢病毒：
The Development of LV Vectors The 3rd Generation
Self-inactivating (SIN) vectors Further improvement in biosafety Tat was deleted Rev was put into a separate plasmid U3 of the 5’ LTR was replaced by the CMV IE promoter/enhancer The possibility of generating RCL is further reduced
Mitrophanous K, Gene Ther 5(11):1481–1487(1999)
Lentiviral Vector Systems Under Development
• Primate – Human immunodeficiency virus (HIV) – Simian immunodeficiency virus (SIV)
七 The Development of LV Vectors The 1st Generation
CMV (cytomegalovirus) immediate-early enhancer/promoter VSV-G (Vesicular stomatitis virus glycoprotein envelope) A cellular polyA was used to replace the 3’ LTR vpu from HIV was deleted
慢病毒载体构建原理
慢病毒载体构建原理
慢病毒（lentivirus）是一类病毒，属于反转录病毒的一种。
慢病毒可以作为基因转移的工具，被广泛应用于基因治疗、基因编辑、干细胞研究等领域。
慢病毒载体构建是利用慢病毒作为基因传递的载体，将外源基因导入慢病毒基因组中，并通过慢病毒的复制和转录机制，将外源基因稳定地表达在宿主细胞中的过程。
慢病毒载体构建的原理主要包括以下几个步骤：
1. 选择适当的慢病毒载体，慢病毒载体通常由慢病毒的基因组和外源基因组成。
在构建慢病毒载体时，需要选择适当的慢病毒载体，通常选择已经经过改造的慢病毒载体作为基础，然后将需要表达的外源基因插入到载体中。
2. 插入外源基因，将需要表达的外源基因插入到慢病毒载体的适当位置。
通常采用限制性内切酶切割和连接酶连接的方法，将外源基因与慢病毒载体连接起来，形成重组的慢病毒载体。
3. 构建重组慢病毒载体，将插入了外源基因的慢病毒载体导入到适当的宿主细胞中，利用宿主细胞的复制和转录机制，使重组慢
病毒载体在宿主细胞中稳定复制和表达外源基因。
4. 验证慢病毒载体的稳定性和表达效果，对构建的重组慢病毒
载体进行验证，包括验证慢病毒载体在宿主细胞中的稳定性和外源
基因的表达效果。
通常采用PCR、Western blot等方法对慢病毒载
体进行验证。
总之，慢病毒载体构建是利用慢病毒作为基因传递的载体，将
外源基因导入慢病毒基因组中，并通过慢病毒的复制和转录机制，
使外源基因稳定地表达在宿主细胞中的过程。
这一技术在基因治疗、基因编辑、干细胞研究等领域具有重要的应用前景，对于疾病治疗
和生命科学研究具有重要意义。
慢病毒载体构建原理
慢病毒载体构建原理
慢病毒载体是一种常用于基因转染和基因治疗研究的工具，其构建原理主要包括载体选择、基因插入、包装和转染等几个关键步骤。
下面将分别对这些步骤进行详细介绍。
首先，载体选择是慢病毒构建的第一步。
常用的慢病毒载体包括pLenti、pSico、pRetro等，这些载体通常具有较高的转染效率和稳定性。
在选择载体时，需要考虑载体的大小、复制能力、转染效率以及转染细胞类型等因素，以确保最终构建的慢病毒载体能够满足实验需求。
其次，基因插入是慢病毒构建的关键步骤之一。
一般来说，可以利用限制性内切酶切割载体，然后将待插入的基因片段与载体连接，形成重组载体。
在进行基因插入时，需要注意选择合适的限制性内切酶，控制酶切的时间和温度，以确保基因能够正确插入到载体中。
接下来是包装步骤。
包装是指将重组载体导入到包装细胞中，通过包装细胞的辅助，使其产生慢病毒颗粒。
常用的包装细胞包括293T细胞、HEK293细胞等。
在包装过程中，需要利用辅助载体，如
pMD2.G和psPAX2等，通过三质体共转染的方式，使包装细胞产生
慢病毒颗粒。
最后是转染步骤。
转染是将包装好的慢病毒颗粒导入到目标细
胞中，实现基因的转染。
在进行转染时，需要根据目标细胞的特性
选择合适的转染方法，如离体转染、体内转染等，以确保慢病毒能
够有效地转染目标细胞，并表达目标基因。
总的来说，慢病毒载体构建的原理涉及到载体选择、基因插入、包装和转染等关键步骤。
通过合理的实验设计和操作，可以构建出
稳定、高效的慢病毒载体，为基因转染和基因治疗研究提供有力的
工具支持。
慢病毒的基本原理和应用
慢病毒的基本原理和应用慢病毒（Slow Virus）是指一种具有长期潜伏期或长期进展的病毒，在宿主体内繁殖较慢，而病程较长的感染性疾病。
慢病毒以肝炎病毒、感能病毒、人免疫缺陷病毒（HIV）等为代表。
慢病毒是一种特殊的病毒，其感染机制、致病机理和治疗方法都与其他病毒不同。
一、慢病毒的基本原理慢病毒的基本原理可以简单地分为以下几个方面。
1. 慢病毒的潜伏期长。
以艾滋病毒为例，患者感染后，可潜伏多年，甚至10年以上，其间没有任何症状表现。
这就给治疗患病的时机带来了难度，也使得艾滋病具有了很强的传染性。
2. 慢病毒可以长期影响人体的免疫系统。
慢病毒比其他病毒更加复杂，可以在人体内长期生存。
慢病毒通过影响人体的免疫系统，消耗人体的免疫力，使得患者陷入易感染、易发病、病程较长的状态。
3. 慢病毒的感染难以被查明。
由于慢病毒繁殖较慢，对人体产生的毒性较小，因此在感染初期难以快速检测出来。
这也是慢病毒传染性强的原因之一。
二、慢病毒的应用虽然慢病毒对人体的危害不小，但科学家也发现慢病毒也具有较大的疗效。
下面我们来看看慢病毒的应用领域。
1. 肿瘤治疗。
慢病毒呈现的长期作用和稳定的表达是其治疗肿瘤的重要特点之一。
利用载了有效目标基因的慢病毒病毒载体，经过基因修饰而改变其发病机制，可以将慢病毒载体作为介导治疗的载体，将其放置在肿瘤细胞中，从而减少肿瘤细胞的生长。
2. 神经退行性疾病的治疗。
神经退行性疾病是指一类慢性神经系统疾病，常常由于神经元死亡导致，如阿尔茨海默症、帕金森病等。
慢病毒通过基因修饰可帮助人体产生某种神经元离子通道，通过将离子通道放在感觉神经元和中枢神经元上，减少神经元死亡，保护人体神经系统的健康。
3. 病毒基因敲除治疗。
利用了慢病毒的基因敲除能力，将慢病毒转化成人体行为控制器，将慢病毒病毒载体作为载体，递送到患者体内，进行病毒治疗。
通过这种治疗方式，可以更加有效地处理患病问题，避免上述疾病的出现，并显著提高生命质量。
shRNA干扰慢病毒载体构建技术原理
shRNA⼲扰慢病毒载体构建技术原理shRNA⼲扰慢病毒载体由慢病毒基因组序列和细菌质粒序列构成。
细菌质粒序列含有⼀个Ampicillin抗性基因和和⼀个⾼拷贝复制⼦pUCori。
慢病毒基因组序列是从元件5'LTR开始，到元件3'LTR结束。
慢病毒基因组序列可容纳两个外源基因表达盒⼦：⼀个是shRNA表达盒⼦，另外⼀个是marker 基因表达盒⼦。
Marker基因表达盒⼦已经克隆在载体上，⽆需重新构建。
我们提供了荧光marker、抗药性marker或者荧光／抗药性双markerft您选择。
shRNA表达盒⼦则包括三部分序列：U6启动⼦、shRNA和终⽌⼦。
U6启动⼦已经克隆在载体上，每次构建载体，只需通过annealing-ligation技术将感兴趣的shRNA和终⽌⼦克隆到载体上即可。
慢病毒包装原理介绍
慢病毒包装系统简介及应用一、慢病毒包装简介及其用途慢病毒 Lentivirus 载体是以 HIV-1 人类免疫缺陷 I 型病毒为基础发展起来的基因治疗载体;区别一般的逆转录病毒载体,它对分裂细胞和非分裂细胞均具有感染能力;慢病毒载体的研究发展得很快,研究的也非常深入;该载体可以将外源基因有效地整合到宿主染色体上,从而达到持久性表达;在感染能力方面可有效地感染神经元细胞、肝细胞、心肌细胞、肿瘤细胞、内皮细胞、干细胞等多种类型的细胞,从而达到良好的的基因治疗效果,在美国已经开展了临床研究,效果非常理想,因此具有广阔的应用前景;目前慢病毒也被广泛地应用于表达 RNAi 的研究中;由于有些类型细胞脂质体转染效果差,转移到细胞内的 siRNA 半衰期短,体外合成 siRNA 对基因表达的抑制作用通常是短暂的,因而使其应用受到较大的限制;采用事先在体外构建能够表达 siRNA 的载体,然后转移到细胞内转录 siRNA 的策略,不但使脂质体有效转染的细胞种类增加,而且对基因表达抑制效果也不逊色于体外合成 siRNA ,在长期稳定表达载体的细胞中,甚至可以发挥长期阻断基因表达的作用;在所构建的 siRNA 表达载体中,是由 RNA 聚合酶Ⅲ启动子来指导 RNA 合成的,这是因为 RNA 聚合酶Ⅲ有明确的起始和终止序列,而且合成的 RNA 不会带 poly A 尾;当 RNA 聚合酶Ⅲ遇到连续 4 个或 5 个 T 时,它指导的转录就会停止,在转录产物 3' 端形成 1~4 个U ; U6 和 H1 RNA 启动子是两种 RNA 聚合酶Ⅲ依赖的启动子,其特点是启动子自身元素均位于转录区的上游,适合于表达～ 21ntRNA 和～ 50ntRNA 茎环结构 stem loop ;在 siRNA 表达载体中,构成 siRNA 的正义与反义链,可由各自的启动子分别转录,然后两条链互补结合形成 siRNA ；也可由载体直接表达小发卡状 RNAsmall hairpin RNA, shRNA,载体包含位于RNA 聚合酶Ⅲ启动子和 4 ～ 5 T转录终止位点之间的茎环结构序列,转录后即可折叠成具有 1~4 个U 3 ' 突出端的茎环结构,在细胞内进一步加工成 siRNA ;构建载体前通常要通过合成 siRNA 的方法,寻找高效的 siRNA ,然后从中挑选符合载体要求的序列,将其引入 siRNA 表达载体;慢病毒载体 Lentiviral vector 较逆转录病毒载体有更广的宿主范围,慢病毒能够有效感染非周期性和有丝分裂后的细胞;慢病毒载体能够产生表达 shRNA 的高滴度的慢病毒,在周期性和非周期性细胞、干细胞、受精卵以及分化的后代细胞中表达 shRNA ,实现在多种类型的细胞和转基因小鼠中特异而稳定的基因表达的功能性沉默,为在原代的人和动物细胞组织中快速而高效地研究基因功能,以及产生特定基因表达降低的动物提供了可能性;慢病毒表达载体包含了包装、转染、稳定整合所需要的遗传信息;慢病毒包装质粒可提供所有的转录并包装 RNA 到重组的假病毒载体所需要的所有辅助蛋白;为产生高滴度的病毒颗粒,需要利用表达载体和包装质粒同时共转染细胞,在细胞中进行病毒的包装,包装好的假病毒颗粒分泌到细胞外的培养基中,离心取得上清液后,可以直接用于宿主细胞的感染,目的基因进入到宿主细胞之后,经过反转录,整合到基因组,从而高水平的表达效应分子;二、这一系统的目的,主要是为了解决以下问题：1. 对于一些较难转染的细胞,如原代细胞、干细胞、不分化的细胞等,能大大提高目的基因转导效率,而且目的基因整合到宿主细胞基因组的几率大大增加,这就为 RNAi,cDNA 克隆以及报告基因的研究提供了一个有利的途径;2. 进行稳转细胞株的筛选；3. 为活体动物模型实验提供高质量的包含目的基因的病毒液；在细胞相关的实验操作中,对于一些按常规方法难以转染甚至无法转染的细胞,通过病毒介导的实验能够大大提高基因的转导效率,以达到目的基因的高效瞬时表达;三、慢病毒载体介绍慢病毒载体 Lentiviral vector, LVs 是在 HIV-1 病毒基础上改造而成的病毒载体系统,它能高效的将目的基因或 RNAi 导入动物和人的原代细胞或细胞系;慢病毒载体基因组是正链 RNA ,其基因组进入细胞后,在细胞浆中被其自身携带的反转录酶反转为 DNA ,形成 DNA 整合前复合体,进入细胞核后, DNA 整合到细胞基因组中;整合后的 DNA 转录 mRNA ,回到细胞浆中,表达目的蛋白；或产生 RNAi 干扰;慢病毒载体介导的基因表达或 RNAi 干扰作用持续且稳定,原因是目的基因整合到宿主细胞基因组中,并随细胞基因组的分裂而分裂;另外,慢病毒载体能有效感染并整合到非分裂细胞中;以上特性使慢病毒载体与其它病毒载体相比,比如不整合的腺病毒载体、整合率低的腺相关病毒载体、只整合分裂细胞的传统逆转录病毒载体,有鲜明的特色;大量文献研究表明,慢病毒载体介导的目的基因长期表达的组织或细胞包括脑、肝脏、肌肉、视网膜、造血干细胞、骨髓间充质干细胞、巨噬细胞等;慢病毒载体不表达任何 HIV-1 蛋白,免疫原性低,在注射部位无细胞免疫反应,体液免疫反应也较低,不影响病毒载体的第 2 次注射;四、慢病毒载体的构建1. 构建原理慢病毒属于逆转录病毒科,但其基因组结构复杂,除 gag、pol 和 env 这 3 个和单纯逆转录病毒相似的结构基因外,还包括 4 个辅助基因,vif、vpr、nef、vpu 和 2 个调节基因 tat 和 rev ; HIV 21 是慢病毒中最具特征性的病毒,第一个慢病毒载体系统即以此病毒为基础进行构建的;慢病毒载体的构建原理就是将 HIV 21 基因组中的顺式作用元件如包装信号、长末端重复序列和编码反式作用蛋白的序列进行分离;载体系统包括包装成分和载体成分：包装成分由 HIV 21 基因组去除了包装、逆转录和整合所需的顺式作用序列而构建,能反式提供产生病毒颗粒所需的蛋白；载体成分与包装成分互补,含有包装、逆转录和整合所需的 HIV 21顺式作用序列;同时具有异源启动子控制下的多克隆位点及在此位点插入的目的基因;为降低两种成分同源重组产生有复制能力的病毒 RCV 的可能性,将包装成分的 5 ′ LTR 换成巨细胞病毒 CMV 立即早期启动子,3 ′ LTR 换成 SV 40 polyA 位点等;将包装成分分别构建在两个质粒上,即一个表达 gag 和 pol、另一个表达 env ;根据这个原理,Naldini 和 Kafri 等构建了三质粒表达系统;2. 三质粒表达系统三质粒表达系统包括包装质粒、包膜蛋白质粒和转移质粒;其中包装质粒在 CMV 启动子的控制下,表达 HIV 21 复制所需的全部反式激活蛋白,但不产生病毒包膜蛋白及辅助蛋白 vpu；包膜蛋白质粒编码水泡性口炎病毒 G 蛋白 V SV 2G,应用 VSV 2G 包膜的假构型慢病毒载体扩大了载体的靶细胞嗜性范围,而且增加了载体的稳定性,允许通过高速离心对载体进行浓缩,提高了滴度；转移质粒中除含有包装、逆转录及整合所需的顺式序列,还保留 350 bp 的 gag 和 RRE,并在其中插入目的基因或标志基因绿色荧光蛋白 GFP ;将载体系统分成三个质粒最大的益处是使序列重叠的机会大大减少,减少载体重组过程中产生 RCV 的可能性;通过三质粒共转染 293T 细胞,超速离心后病毒滴度可达 109IU /m l ;3. 四质粒表达系统为了减少 HIV 21 包装结构的序列同源性,进一步减少重组成 RCV 的可能性,Dull 等人将辅助基因去除;但由于 gag2pol 的转运需要 rev,因此,在上述的三质粒系统的基础上,构建成四质粒表达系统,该系统加上含 rev 的质粒减少了产生 RCV 的可能性,而且对非分裂期细胞转导效率无影响;五、慢病毒载体应用1. 将目的基因 /RNAi 基因转入难以转染的细胞,比如神经元细胞、干细胞或其它原代细胞；2. 将目的基因 /RNAi 基因转入动物组织,以期获得长期表达；3. 构建稳定表达目的蛋白 /RNAi 的细胞系,再用exvivo的方法导入动物体内；4. 基因治疗；5. 转基因动物；6. 基因敲除；7. 药物研究：构建表达受体蛋白的细胞系,研究药物的作用；8. 快速建立生产目的蛋白的细胞系,非常有前途的真核细胞表达方法;。
慢病毒载体构建原理
慢病毒载体构建原理
慢病毒载体的包装系统一般由两部分组成，即包装成分和载体成分。
包装成分由HIV-1基因组去除了包装、逆转录和整合所需的顺式作用序列而构建，能够反式提供产生病毒颗粒所必需的蛋白；载体成分则与包装成分互补，即含有包装、逆转录和整合所需的顺式作用序列，同时具有异源启动子控制下的多克隆位点及在此位点插入的目的基因。
将包装成分与载体成分的多个质粒共转染包装细胞，即可在细胞上清中收获携带目的基因的复制缺陷型慢病毒载体颗粒。
慢病毒表达载体包含了包装、转染、稳定整合所需要的遗传信息。
慢病毒包装质粒可提供所有的转录并包装RNA 到重组的假病毒载体所需要的所有辅助蛋白。
为产生高滴度的病毒颗粒，需要利用表达载体和包装质粒同时共转染细胞，在细胞中进行病毒的包装，包装好的假病毒颗粒分泌到细胞外的培养基中，离心取得上清液后，可以直接用于宿主细胞的感染，目的基因进入到宿主细胞之后，经过反转录，整合到基因组，从而高水平的表达效应分子。
对于一些较难转染的细胞，如原代细胞、干细胞、不分化的细胞等,能大大提高目的基因转导效率，而且目的基因整合到宿主细胞基因组的几率大大增加，这就为RNAi，cDNA 克隆以及报告基因的研究提供了一个有利的途径。
有时病毒感染细胞效率较低，可使用病毒感染增强剂Envirus来提高病毒的感染效率。
慢病毒载体的构建讲解
pWXLd : psPAX2 : pMD2G =20:15:6
三 .滴度测定：稀释计数法 滴度单位：TU/ml，指每毫升中含有的具有生物活性的病毒颗粒 数。”TU”为”transducing units”的缩写，中文为“转导单位”，表
示可以感染并进入到靶细胞中的病毒基因组数。
第一天 细胞准备
将生长状态良好的293T细胞消化计数后稀释至1×105/ml，加入96孔 板，100µl/孔，为每个病毒准备10个孔。放入37℃，5%CO2培养箱
重组酶（Gateway® LR Clonase™ II） 293FT细胞（＜16代） 293FT细胞的培养基及其添加成分（Non-Essential Amino Acids，L-Glutamine，pyeuvate solution and G418） 制备感受态用的试剂
我们用的慢病毒载体的2个包装载体
第三天 追加培养液
在每个孔再加入100µl完全培养液，利于细胞的生长。 第五天 观察结果并计算滴度
在荧光显微镜下观察结果，并数出最后两个有荧光的荧光细胞克隆数。 假设为X和Y，则滴度（TU/ml）=（X+Y×10）×1000/2/X孔的病毒
Cytoskeletal anchoring of GLAST determines susceptibility to brain
damage: an identified role for GFAP.
(J Biol Chem,
2007, Oct.)
慢病毒载体介导人IL-12基因修饰树突状细胞体外抗肺癌作用的研究 （邸军，吉林大学博士学位论文，2009年5月）
shRNA : psPAX2 : pMD2G = 20:15:5
Duox1 is the main source of hydrogen peroxide in the rat thyroid cell line
慢病毒载体构建原理
慢病毒载体构建原理慢病毒是一类能够长期潜伏在宿主细胞内，并且在细胞分裂时能够传递给子细胞的病毒。
慢病毒的研究和应用在基因治疗、基因工程和细胞治疗等领域具有重要意义。
慢病毒载体构建是慢病毒研究的关键环节，下面将介绍慢病毒载体构建的原理。
首先，慢病毒载体构建的关键是选择合适的病毒骨架。
常用的慢病毒载体包括HIV-1、HIV-2和SIV等。
这些病毒骨架具有较高的转导效率和稳定性，能够有效地将外源基因导入宿主细胞中。
在选择病毒骨架时，需要考虑到载体的稳定性、毒性和转导效率等因素，以确保慢病毒载体能够在宿主细胞中稳定表达外源基因。
其次，慢病毒载体构建需要将外源基因整合到病毒基因组中。
一般来说，外源基因会被整合到病毒的长末端重复序列（LTR）之间，这样可以确保外源基因能够稳定地表达。
在整合外源基因时，需要使用逆转录酶将外源基因的RNA转录成DNA，并将其整合到病毒基因组中。
整合外源基因的位置和数量会影响慢病毒载体的稳定性和表达水平，因此需要对整合位点和整合数量进行精确控制。
另外，慢病毒载体构建还需要考虑到病毒的包装限制。
在病毒的生命周期中，病毒颗粒的组装和包装需要依赖于病毒的包装信号。
因此，在构建慢病毒载体时，需要确保外源基因的整合不会影响到病毒的包装信号，否则会影响病毒的组装和包装，从而降低病毒的转导效率和稳定性。
最后，慢病毒载体构建还需要考虑到病毒的安全性和稳定性。
在构建慢病毒载体时，需要对病毒的毒性进行改造，以降低其对宿主细胞的损害。
同时，还需要对病毒的复制和传播进行限制，以确保慢病毒载体在宿主细胞中稳定表达外源基因，同时不会对宿主细胞造成不良影响。
综上所述，慢病毒载体构建是慢病毒研究和应用的重要环节。
通过选择合适的病毒骨架、整合外源基因、考虑病毒的包装限制和确保病毒的安全性和稳定性，可以构建出稳定、高效的慢病毒载体，为基因治疗、基因工程和细胞治疗等领域的研究和应用提供重要支持。
如何构建慢病毒稳转株
如何构建慢病毒稳转株构建稳定细胞系的基本原理是将外源DNA克隆到具有某种抗性的载体上，载体被转染到宿主细胞并整合到宿主染色体中，用载体中所含抗性基因进行筛选。
最常用的真核表达载体抗性筛选标志物有新霉素（neomycin）、潮霉素（hygromycin）和嘌呤霉素(puromycin)。
常用G418来代替新霉素进行选择性筛选，筛选得到可稳定表达目的蛋白，或者稳定表达沉默特定基因的细胞株。
慢病毒感染方法筛选单克隆是目前主流的稳定细胞系筛选方法。
慢病毒几乎可以感染所有种类的细胞，并且在感染后可以整合到受感染细胞的基因组，进行长时间稳定表达。
因此，慢病毒常用于制备稳定表达、沉默特定基因的单克隆细胞株。
特点及优势1. 长期在细胞中研究基因的功能（>2周）；2. 使用诱导表达系统，这主要是由于：a)过表达基因或者干扰目的基因引起细胞毒性或者抑制细胞生长等不利因素；b)目的基因的过表达或者干扰需要时空特异性。
3. 动物实验，需将细胞注射到动物体内；流程及注意事项1. 慢病毒载体构建，过表达载体或者干扰载体构建慢病毒过表达载体有基因容量限制，对于大于5k的基因，包装出慢病毒的概率很低，不建议包装病毒。
同时大于3k的目的基因也可能有不出毒或者出毒量低，在做正式实验之前，可用先进行病毒的小量包装，成功后再进行病毒大量包装。
对于敲低，通常的策略是对一个基因同时选择3个干扰靶点，通过qPCR验证干扰效率之后，使用效率最好的靶点进行下一步实验。
慢病毒载体带有不同的标签，如果研究细胞定位，可以选择带荧光标签的慢病毒载体，比如带GFP/RFP等；如果准备筛选稳转细胞株，可以选择带筛选标签的慢病毒载体，比如puro/neo等载体；如果目的基因大小适中，也可以选择同时带荧光标签和筛选标签的载体。
2. 293T细胞培养及慢病毒包装细胞的状态对于病毒包装有很大的影响，如果细胞状态不好可能不出毒或者出毒量很低。
取状态良好，处于对数生长期的293T细胞进行慢病毒包装。
慢病毒载体构建原理
慢病毒载体构建原理慢病毒是一类能够引起慢性感染的病毒，其特点是在宿主细胞内复制速度较慢，病程较长。
慢病毒载体是一种用于基因转移和基因治疗的工具，其构建原理是通过将外源基因插入慢病毒基因组中，利用慢病毒的复制和转录机制将外源基因稳定地表达在宿主细胞中。
本文将介绍慢病毒载体构建的原理及相关技术要点。
首先，慢病毒载体构建的基本原理是利用慢病毒的基因组和复制机制来稳定表达外源基因。
慢病毒基因组包括基因组RNA和反转录酶，而慢病毒的复制过程主要依赖于反转录酶的活性。
因此，构建慢病毒载体的关键是将外源基因插入到慢病毒基因组中，并确保其在宿主细胞中的稳定表达。
其次，慢病毒载体构建的技术要点包括选择合适的慢病毒载体和外源基因插入位点。
常用的慢病毒载体包括逆转录病毒和伞状病毒，它们具有较高的基因载荷能力和稳定的表达特性。
而外源基因的插入位点则需要选择在慢病毒基因组中不影响病毒复制和转录的区域，通常选择在非编码区域或非必需基因上进行插入。
另外，慢病毒载体构建还需要考虑到病毒的安全性和稳定性。
为了确保慢病毒载体在宿主细胞中的稳定表达，需要对其进行适当的改造和优化，例如加入启动子和终止子来调控外源基因的表达水平，或者利用基因编辑技术来增强慢病毒的复制和转录能力。
此外，为了降低慢病毒载体的致病性和提高其安全性，还可以通过删除病毒基因组中的致病基因或关键复制基因来实现。
总之，慢病毒载体构建是一项复杂而关键的技术工作，其成功与否直接影响到基因转移和基因治疗的效果。
通过深入理解慢病毒的复制机制和基因组结构，合理选择慢病毒载体和外源基因插入位点，以及优化病毒的表达和安全性，才能够成功构建出稳定、高效、安全的慢病毒载体，为基因治疗和基因转移研究提供有力的工具支持。
慢病毒载体的构建
慢病毒载体的构建一．构建原理：慢病毒属于逆转录病毒科, 但其基因组结构复杂, 除gag 、po l 和env 这3 个和单纯逆转录病毒相似的结构基因外, 还包括4 个辅助基因, vif 、vp r 、 nef 、vpu 和2 个调节基因tat 和rev 。
H IV 21 是慢病毒中最具特征性的病毒, 第一个慢病毒载体系统即以此病毒为基础进行构建的。
慢病毒载体的构建原理就是将H IV 21 基因组中的顺式作用元件(如包装信号、长末端重复序列) 和编码反式作用蛋白的序列进行分离。
载体系统包括包装成分和载体成分: 包装成分由H IV 21 基因组去除了包装、逆转录和整合所需的顺式作用序列而构建, 能反式提供产生病毒颗粒所需的蛋白; 载体成分与包装成分互补, 含有包装、逆转录和整合所需的H IV 21 顺式作用序列。
同时具有异源启动子控制下的多克隆位点及在此位点插入的目的基因。
为降低两种成分同源重组产生有复制能力的病毒(RCV ) 的可能性, 将包装成分的5′ L TR 换成巨细胞病毒(CMV ) 立即早期启动子, 3′ L TR 换成SV 40 po lyA 位点等。
将包装成分分别构建在两个质粒上, 即一个表达gag 和po l 、另一个表达env 。
二．实验操作举例：一）磷酸钙法转染HEK293T 细胞1. 试剂配制:无菌水ddw: 高温灭菌; 分装;2XHBS: 280mM NaCl10mM KCl1.5 mM Na2HPO412 mM glucose50 mM HEPESAdjust the pH , every 0.05pH from 7.00 to 7.45 using 10N NaOH, then add ddw. to the final volume. 过滤灭菌,分装;2M CaCl2: 过滤灭菌,分装.2. 实验过程:1. 铺细胞: 选择状态良好的293T 细胞传代, 2-3x105个细胞/35mm dish.2. 20-24h 后,待细胞长至铺满瓶底约50-70%的时候,进行转染.下面就35mm dish 为例,采用以下转染体系:ddw: 105ulplasmid: 2 ug (如0.5ug/ul, 即用4ul)2M CaCl2: 16.5ul2XHBS: 125ul按上述顺序,往eppendorf管中依次加入上述四种试剂.先将前三者混匀,最后加2XHBS.一种方法是,加2XHBS时要逐滴加入,吹打至微现乳白色,立即均匀滴入培养皿,轻轻摇匀后置于培养箱中,6-8h后换液.另一种方法是,加入2XHBS后立即吹打约40下(不过这个要根据每个人的力道和吹打的频率而定,建议做一个梯度实验,吹打不同的次数看哪次的转染效率高以后就按这个次数来吹打),之后步骤同上,立即均匀滴入培养皿,轻轻摇匀后置于培养箱中,6-8h后换液.二）转染方法2-Fugene转染病毒包装1．传293T细胞，将T75用明胶包被，每瓶T75加1.5-2mL明胶，置于37度培养箱10min。
慢病毒包装的原理
慢病毒包装的原理慢病毒（lentivirus）是一类能够将基因信息稳定地整合到宿主细胞基因组中的病毒，因其具有较高的转染效率和广泛的宿主细胞范围而被广泛应用于基因治疗、基因编辑和细胞治疗等领域。
慢病毒的包装是指将外源基因载体包装入慢病毒颗粒中，使其具有传递和整合到宿主细胞基因组的能力。
本文将介绍慢病毒包装的原理及其相关技术。
慢病毒包装的原理主要包括载体构建、包装细胞系和包装技术三个方面。
首先是载体构建，即将外源基因插入到慢病毒基因组中，构建成慢病毒表达载体。
慢病毒基因组包括基因组RNA和辅助质粒DNA两种形式，通过重组技术将外源基因插入到慢病毒基因组中，并在适当的位点上加入启动子、终止子和调控元件，构建成慢病毒表达载体。
其次是包装细胞系的建立。
包装细胞系是指能够表达慢病毒包装蛋白的细胞系，通常采用293T细胞或HEK293细胞。
通过转染慢病毒表达载体和包装蛋白表达质粒，使其在细胞内表达慢病毒包装蛋白，从而实现慢病毒颗粒的包装和产生。
最后是包装技术，主要包括质粒转染、病毒包装和病毒收集等步骤。
质粒转染是指将慢病毒表达载体和包装蛋白表达质粒转染至包装细胞系，使其在细胞内表达慢病毒包装蛋白。
病毒包装是指慢病毒包装蛋白识别慢病毒基因组RNA，并将其包装成慢病毒颗粒的过程。
病毒收集是指通过超速离心或滤膜浓缩等方法，从包装细胞系的培养上清中收集慢病毒颗粒。
总的来说，慢病毒包装的原理是通过构建慢病毒表达载体，利用包装细胞系表达慢病毒包装蛋白，将外源基因包装入慢病毒颗粒中，最终实现慢病毒的包装和产生。
这一技术为基因治疗和基因编辑研究提供了重要工具，也为细胞治疗等领域的发展提供了有力支持。
随着基因治疗和细胞治疗的不断发展，慢病毒包装技术的进一步优化和改进将为相关研究和临床应用带来更多的机遇和挑战。
慢病毒原理及注意事项
慢病毒原理及注意事项慢病毒介绍慢病毒（Lentivirus）载体是以 HIV-1 （人类免疫缺陷1型病毒）为基础，使用疱疹病毒VSVG 外壳蛋白发展起来的工具载体。
其毒性基因已经被剔除并被外源性目的基因所取代，属于假型病毒。
慢病毒具有感染谱广泛特点，并且可以有效感染分裂和非分裂细胞。
一经感染宿主细胞，慢病毒即利用反转录酶将其RNA转录成双链DNA，随后永久的整合到宿主细胞的染色体中，实现长时间稳定表达。
此外，慢病毒免疫原性低，不易造成免疫反应，所以现在慢病毒系统除了被广泛应用到各种细胞系的基因敲除/敲入、基因过表达、RNA干扰、microRNA研究，还大量应用于活体动物实验中。
慢病毒注意事项1、病毒转导至细胞后多久才会表达？Lentivirus表达时间较长，但在一般代谢较旺盛的细胞（如293T，HEK293等）上，病毒转导24小时后可以观察到荧光；代谢比较缓慢的细胞（如原代培养细胞，神经干细胞，胚胎干细胞等）荧光蛋白表达时间较长，转导后72-96小时甚至更长时间才可以观察到荧光。
转导后的细胞可以连续培养一周，通过观察荧光的表达时间和表达强度来确定病毒对目的细胞的转导情况。
2、慢病毒对目的细胞的转导效率很低，如何提高病毒的转导效率？确保转导之前细胞处于良好的生长状态；可以使用易感细胞如293T进行滴度测试，验证病毒液滴度是否出现大幅下降；适当提高病毒转导的MOI值和延长转导时间。
3、慢病毒转导后，细胞状态很差甚至出现大量死亡，如何解决？转导前细胞状态不佳，加入病毒量太大，病毒携带的目的基因含有细胞毒性均有可能导致目的细胞状态异常，解决方法主要有：（1）稳定转导前细胞状态；（2）降低病毒加入量，降低MOI值，验证目的基因的细胞毒性；（3）转导6小时后观察细胞，如细胞状态出现异常时更换新鲜培养基，若无则24小时后更换。
慢病毒使用操作手册
慢病毒使用操作手册简介：慢病毒（Lentivirus）是一种常用于生命科学研究中的病毒载体，其具有较强的基因转染能力和稳定的基因表达特性。
本操作手册旨在向研究者提供一个详细的慢病毒使用指南，帮助他们顺利进行慢病毒基因转染实验并获得准确可靠的研究结果。
一、慢病毒基本原理慢病毒属于反转录病毒，其基因组为单链RNA。
慢病毒在寄主细胞内通过逆转录过程将RNA转录为DNA，随后将DNA插入宿主基因组中。
这使得慢病毒成为将外源基因稳定集成到宿主基因组中的理想工具。
二、慢病毒使用前准备1. 实验室条件准备：确保工作台面干净整洁，并准备好所需的培养物、培养器具和试剂。
2. 慢病毒载体制备：根据实验需要，选择合适的慢病毒载体，并通过慢病毒包装系统将目标基因插入载体中。
三、慢病毒转染实验步骤1. 细胞培养：将目标细胞接种在培养皿中，并选择合适的培养基进行细胞培养。
2. 慢病毒感染：将预制的慢病毒悬液加入培养皿中，控制感染浓度和时间，以实现最佳的感染效果。
3. 筛选标记：根据实验需要，在感染后适当的时间点添加筛选标记物，如抗生素或荧光标记剂。
4. 选择和扩增：将受筛选标记影响的细胞单克隆分离，扩增和保存。
5. 验证表达：使用合适的实验方法，如western blot或PCR等，来确认目标基因的表达情况。
6. 结果分析：对实验结果进行统计学分析，并绘制适当的图表。
四、注意事项和常见问题解决方案1. 实验前应认真阅读文献，了解慢病毒的基本原理和实验操作流程。
2. 制备慢病毒载体时，应仔细验证目标基因的序列和正确插入。
3. 慢病毒感染时应注意控制感染浓度和时间，避免细胞毒性和非特异性感染。
4. 筛选标记物的选择应根据实验需要和细胞类型进行合理选择。
5. 实验过程中，注意严格遵守实验室安全和生物安全操作规范。
6. 常见问题解决方案：如遇到感染效率低或细胞毒性问题，可以尝试优化感染条件或调整细胞培养条件。
如果基因表达不稳定，可以尝试选择合适的筛选标记物或优化基因载体。
慢病毒转染原理
慢病毒转染原理
慢病毒转染是一种常用的基因传递技术，它利用慢病毒病毒粒子作为载体将目标基因导入靶细胞。
慢病毒是一类特殊的病毒，具有较高的感染效率和稳定的基因表达能力，因此被广泛应用于基因转染领域。
慢病毒转染的基本原理可以分为以下几个步骤：
1. 构建慢病毒载体：首先，将目标基因插入到慢病毒载体的适当位点上。
慢病毒载体通常包括了病毒的基因组结构，例如表达型蛋白、包装型蛋白等。
2. 包装慢病毒：将构建好的慢病毒载体导入特定细胞系，并通过培养和传代扩增病毒。
这些细胞会产生足够多的慢病毒病毒颗粒。
3. 收集病毒颗粒：从培养基中收集慢病毒病毒颗粒。
通常，病毒颗粒可以通过浓缩和超速离心等方法获得。
4. 转染靶细胞：将收集到的病毒颗粒加入待转染的靶细胞培养基中。
病毒颗粒会与细胞表面的受体结合，进入细胞。
5. 病毒基因组整合到靶细胞基因组：一旦进入细胞内，慢病毒会释放出自己的遗传物质，包括病毒基因组RNA和逆转录酶。
逆转录酶能够将病毒基因组的RNA逆转录成DNA，并将其整合到宿主细胞的染色体上。
从而实现病毒基因的稳定表达。
综上所述，慢病毒转染是一种利用慢病毒病毒粒子作为载体将基因导入到靶细胞的技术。
通过包装慢病毒病毒颗粒，并与靶细胞进行转染，实现了基因的稳定表达。
这种技术在基因治疗、基因功能研究等领域具有重要的应用价值。
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慢病毒构建原理
◆慢病毒载体（Lentivirus）是一类改造自人免疫缺陷病毒（HIV）的病毒载体，是逆转录病毒的一种，基因组是RNA，其毒性基因已经被剔除并被外源性目的基因所取代，属于假型病毒。
可利用逆转录酶将外源基因整合到基因组中实现稳定表达，具有感染分裂期与非分裂期细胞的特性。
◆慢病毒基因组进入细胞后，在细胞浆中反转录为DNA，形成DNA整合前复合体，进入细胞核后，DNA整合到细胞基因组中。
整合后的DNA转录成mRNA，回到细胞浆中，表达目的蛋白；或产生小RNA。
慢病毒介导的基因表达或小RNA干扰作用持续且稳定，并随细胞基因组的分裂而分裂。
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◆慢病毒载体具有宿主范围广，基因容量大等特点。
体外应用时，慢病毒载体能够有效地感染培养的神经元、肝细胞、心肌细胞、肿瘤细胞、内皮细胞、干细胞等多种类型原代细胞和大部分细胞系。
由于慢病毒的感染具有整合特性，其能够将外源基因有效地整合到宿主染色体上，因而可以达到持久性表达，从而构建稳转细胞株，用于基因的细胞功能研究。
◆体内应用时，慢病毒载体的应用不如rAAV载体应用广泛，因为其具有一定的免疫原性，且随机整合特性可能导致细胞功能基因的异常。
相比较腺相关病毒，慢病毒的扩散范围较小，但其表达更快、基因容量更大（可容纳4kb），可作为大容量基因的载体。