ARL6IP5基因在原发性肝癌中的生物学作用

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NGAL基因在原发性肝癌中的表达及其功能分析

第５１卷　第１期２０１２年２月复旦学报（自然科学版）Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｆｕｄａｎ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ（Ｎａｔｕｒａｌ　Ｓｃｉｅｎｃｅ）Ｖｏｌ．５１Ｎｏ．１Ｆｅｂ．２０１２文章编号：０４２７－７１０４（２０１２）０１－００９１－０８收稿日期：２０１１－０６－１９基金项目：国家重点基础研究发展计划（“９７３”计划）（２００４ＣＢ５１８６０５），国家高技术研究发展计划（“８６３”计划）（２００６ＡＡ０２０５０１），国家重大科技专项基金（２００８ＺＸ１０００２－０２０），上海市科学技术委员会基金（０３ｄｚ１４０８６），国家自然科学基金项目（３００２４００１，３０７７１１８８）资助项目作者简介：李林国（１９８２—），女，硕士研究生；侯永敏，男，博士，通讯联系人，Ｅ－ｍａｉｌ：ｙｏｎｇｍｈ１＠ｙａｈｏｏ．ｃｏｍ．ｃｎ．ＮＧＡＬ基因在原发性肝癌中的表达及其功能分析李林国，周　同，侯永敏（复旦大学遗传工程国家重点实验室，上海２００４３３）摘　要：ＮＧＡＬ基因是Ｌｉｐｏｃａｌｉｎ家族成员，与ＭＭＰ９的功能密切相关，在乳腺癌、食管癌等多种恶性肿瘤中异常表达，为了研究其在原发性肝癌中的表达及功能，通过荧光实时定量ＰＣＲ法检测了ＮＧＡＬ基因在２３对肝癌组织标本中的表达情况．结果显示：在１２例肝癌组织中ＮＧＡＬ显著上调表达，占总样本数的５２．１７％（Ｐ＜０．０５），提示了ＮＧＡＬ基因的表达水平可能与肝癌的发生发展过程有关．通过构建绿色荧光蛋白融合表达载体，用脂质体法转化肝癌细胞株ＳＭＭＣ－７７２１进行瞬时表达．细胞周期实验显示ＮＧＡＬ的表达可促使ＳＭＣＣ－７７２１细胞从Ｇ１期向Ｓ期转化，转化ＮＧＡＬ的细胞中Ｓ期细胞显著增多（Ｐ＜０．０５），提示其可能具有促进肝癌细胞生长的功能；细胞凋亡实验发现ＮＧＡＬ的表达可显著抑制低血清诱导下的细胞凋亡率（Ｐ＜０．０５），提示其可能参与抑制肝癌细胞的凋亡．关键词：原发性肝细胞癌；ＮＧＡＬ；荧光实时定量ＰＣＲ；细胞周期；细胞凋亡中图分类号：Ｑ　７５６文献标志码：Ａ中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白（ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌ　ｇｅｌａｔｉｎａｓｅ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ　ｌｉｐｏｃａｌｉｎ，ＮＧＡＬ），也称为Ｌｉｐｏｃａｌｉｎ－２（脂质运载蛋白－２），是１９９３年在研究人中性粒细胞中的ＭＭＰ９（ｍａｔｒｉｘ　ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅｓ　９，９２ｋｕ）时新发现的一种２５ｋｕ的新蛋白，同源分析发现，ＮＧＡＬ与小鼠癌基因产物２４ｐ３蛋白的同源性很高，是Ｌｉｐｏｃａｌｉｎ家族的新成员［１］．Ｌｉｐｏｃａｌｉｎ家族由一系列的细胞外小分子组成，它们具有结合疏水性小分子的功能，并将小分子运输到特定的细胞膜受体上，发挥其作为运载体的功能，参与细胞生理稳态的调节［２］．ＮＧＡＬ与ＭＭＰ９的功能密切相关，它能抑制ＭＭＰ９在体内的降解，从而起到促进肿瘤的浸润与转移功能．近年来人们在ＮＧＡＬ基因与人类肿瘤之间的相互关系方面的研究取得了一定的进展．ＮＧＡＬ基因定位于染色体９ｑ３４上，是单拷贝基因，全长５　８６９ｂｐ，其中包括１　６９５ｂｐ的５′端非转录区，１７８ｂｐ的３′端非转录区及由７个外显子和６个内含子构成的３　６９６ｂｐ的原初转录区（ｐｒｉｍａｒｙｔｒａｎｓｃｒｉｂｅｄ　ｒｅｇｉｏｎ）［３］．Ｂｕｎｄｇａａｒｄ等在１９９４年克隆了ＮＧＡＬ的ｃＤＮＡ全序列，它含有６３ｂｐ的５′端非翻译区和５９１ｂｐ的编码区，共编码１９７个氨基酸，其中包括１９个氨基酸的前导序列和１７８个氨基酸残基的成熟肽段［４］．ＮＧＡＬ基因与小鼠的２４ｐ３基因ｃＤＮＡ全序列具有７１．３％的一致性，且外显子以及内含子连接处的位点具有高度保守性．同源比对提示，ＮＧＡＬ和２４ｐ３可能具有相近的功能［５－６］．ＮＧＡＬ蛋白由一条肽链构成，具有典型的β２折叠桶状结构．肽链由Ｎ端的３１０螺旋，Ｃ端的α螺旋和中间的８段反平行式β折叠构成的β折叠桶组成．ＮＧＡＬ蛋白β折叠桶封闭端的有游离的巯基Ｃ８７，这使得ＮＧＡＬ可与一些蛋白质分子，如ＭＭＰ－９，形成分子间二硫键，并以此来调节这些蛋白的功能或活性．ＮＧＡＬ蛋白在多种肿瘤中都上调表达，不同个体及不同部位的肿瘤ＮＧＡＬ蛋白的表达并不完全相同．有研究发现ＮＧＡＬ蛋白在乳腺癌中可能通过保护ＭＭＰ－９不被降解从而保持其活性，促进血管新生及肿瘤生长作用［７］．研究也发现ＮＧＡＬ蛋白在食道上皮癌的恶性转化中起着重要作用，它可能是一个癌基因或者癌促基因［８］，Ｌｉ等研究发现ＮＧＡＬ可能通过调节ＭＭＰ－９和ＭＭＰ－２的活性在肿瘤细胞的浸润中发挥作用［９］．Ｋｕｂｂｅｎ等发现ＮＧＡＬ／ＭＭＰ－９复合物与胃癌的预后显著相关［１０］．研究同样发现ＮＧＡＬ在卵巢癌［１１］、食道鳞状细胞癌［１２］等癌组织中异常表达．大多数结肠腺癌ＮＧＡＬ强阳性，肿瘤周围的腺瘤样增生也呈阳性，与周围的正常黏膜明显不同，而用Ｎｏｒｔｈｅｒｎ　ｂｌｏｔ检查发现结肠癌和肝癌组织中ＮＧＡＬｍＲＮＡ的水平升高［１３］．Ｐａｔｉｌ等通过ＤＮＡ芯片的方法发现了ＮＧＡＬ、ＧＰＣ３和ＤＫＫ１等在肝癌中高表达［１４］．ＮＧＡＬ基因在乳腺癌、食管癌、肝癌等多种恶性肿瘤中异常表达，且与癌症的进展、转移、预后等密切相关，提示ＮＧＡＬ可能在恶性肿瘤的早期诊断、判断预后等方面存在潜在的应用价值．原发性肝癌（ｐｒｉｍａｒｙ　ｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒ　ｃａｒｃｉｎｏｍａ，ＨＣＣ）是最常见的恶性肿瘤之一，它发病隐匿，早诊困难，易转移，预后差，在我国其死亡率居第三位．因此，探索具有临床诊断应用价值的肝癌生物分子标记，研究肝癌的发生发展机制具有重要意义．然而人们对ＮＧＡＬ基因在肝癌中研究还很少，仅有Ｐａｔｉｌ等［１４］利用ＤＮＡ芯片技术检测肝癌中的基因表达情况时发现ＮＧＡＬ是其中一个高表达基因，且未对其进行深入研究．所以本论文欲采用荧光实时定量ＰＣＲ法检测ＮＧＡＬ基因在肝癌及癌旁组织中的表达情况，以探索其在肝癌的早期诊断、判断预后等方面存在潜在的应用价值．同时克隆ＮＧＡＬ基因的全长ｃＤＮＡ序列，构建一系列真核生物表达载体，通过体外细胞实验研究其对细胞周期、细胞凋亡等方面的影响，初步探索其在肝癌发生发展中的作用，为肝癌的早期诊断和早期治疗提供理论依据．１　材料和方法１．１　材料５３例原发性ＨＣＣ肝癌与癌旁肝脏组织样品来自复旦大学附属中山医院（所有诊断均经病理切片证实），每例样品由癌组织和癌旁组织配对组成．组织离体后３０ｍｉｎ内取材，在液氮中快速冷冻１ｍｉｎ，－７０℃保存备用．本研究采用人肝癌细胞株ＳＭＭＣ－７７２１（由本实验室保存）．采用ＤＭＥＭ（ＧＩＢＣＯ，ＵＳＡ）培养基（含１０％ＦＢＳ），于３７℃，５％ＣＯ２细胞培养箱中培养．大肠杆菌ＤＨ５α由本实验室保存；实验中所用到的质粒ｐＥＧＦＰ－Ｃ１为本实验室保存．１．２　方法１．２．１　实时荧光定量ＰＣＲ采用ＴＲＩｚｏｌ试剂（上海生工生物工程有限公司）提取肝癌及癌旁组织标本总ＲＮＡ，所提取的总ＲＮＡ取２μＬ进行电泳检测，同时用紫外分光光度计ＦＳ－３１２（上海复生公司）检测Ａ２６０／Ａ２８０比值和浓度．逆转录反应：在０．５ｍＬ离心管中加入总ＲＮＡ　２μｇ，随机引物（ｈｅｘａｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ　ｍｉｘｔｕｒｅ）０．０２μｇ，用ＲＮａｓｅ－ｆｒｅｅ水补至反应总体积为１０μＬ；７０℃温浴５ｍｉｎ，冰浴２ｍｉｎ．随后加入１０μＬ反应缓冲液（５×ＲＴ缓冲液４μＬ，１０ｍｍｏｌ／Ｌ　ｄＮＴＰ混合物１μＬ，２００ｕｎｉｔｓ　Ｍ－ＭｕＬＶ　ＲＴａｓｅ　１μＬ，ＲＮａｓｅ－ｆｒｅｅ水４μＬ），离心数秒混匀；４２℃温浴６０ｍｉｎ；７０℃处理１５ｍｉｎ终止反应，－２０℃储存备用．按照ＳＹＢＲ＠Ｇｒｅｅｎ　Ｒｅａｌｔｉｍｅ　ＰＣＲ　Ｍａｓｔｅｒ　Ｍｉｘ试剂盒（ＴｏＹｏＢｏ）的实验方法在Ｂｉｏ－Ｒａｄ荧光实时定量ＰＣＲ仪上进行反应．引物设计参照ＧｅｎＢａｎｋ中的基因序列，采用Ｐｒｉｍｅｒ　Ｐｒｅｍｉｅｒ　５．０软件设计，由生工生物工程（上海）有限公司合成，引物序列见表１．每个反应均设３个平行管，总反应体系为２０μＬ，包含２×ＳＹＢＲ　Ｇｒｅｅｎ　ＰＣＲ　Ｍａｓｔｅｒ　Ｍｉｘ　１０μＬ，上、下游引物（１０μｍｏｌ／Ｌ）各１μＬ，模板１μＬ．反应条件为：初始变性９４℃，２ｍｉｎ，然后９５℃，１５ｓ，５８℃，２０ｓ，７２℃，２０ｓ，循环４５次．表１　实验中所用引物列表Ｔａｂ．１　Ｔｈｅ　ｐｒｉｍｅｒｓ　ｕｓｅｄ　ｉｎ　ｔｈｉｓ　ｐａｐｅｒ基因引物类型引　物ＮＧＡＬ　Ｒｅａｌ－ＴｉｍｅＲＴ－ＰＣＲ基因引物ＮＧＡＬｒｔＦ：５′－ＡＡＴＧＴＣＡＣＣＴＣＣＧＴＣＣＴＧＴＴＴＡ－３′，ＮＧＡＬｒｔＲ：５′－ＡＧＣＴＣＣＴＴＧＧＴＴＣＴＣＣＣＧＴＡ－３′；２９复旦学报（自然科学版）　第５１卷（续表）基因引物类型引　物ＧＡＰＤＨ　Ｒｅａｌ－ＴｉｍｅＲＴ－ＰＣＲ内参引物ＧＡＰＤＨ－ＲＴ－Ｆ：５′－ＧＡＡＧＧＴＧＡＡＧＧＴＣＧＧＡＧＴＣ－３′，ＧＡＰＤＨ－ＲＴ－Ｒ：５′－ＧＡＡＧＡＴＧＧＴＧＡＴＧＧＧＡＴＴＴＣ－３′；ＮＧＡＬ基因克隆引物ｈＮＧＡＬｃｌｏｎｅＦ：５′－ＣＡＣＣＡＣＡＧＣＧＣＣＴＧＣＴＴＣＣＴＣ－３′，ｈＮＧＡＬｃｌｏｎｅＲ：５′－ＧＧＧＴＣＴＣＣＣＡＧＣＴＣＣＣＴＣＡＡＴＧ－３′；ＮＧＡＬ载体构建引物ＮＧＡＬＥｃｏＲＩＦ１：５′－ＣＣＧＧＡＡＴＴＣＴＡＴＧＣＣＣＣＴＡＧＧＴＣＴＣＣＴＧＴＧ－３′，（下划线为ＥｃｏＲ　Ｉ位点）ＮＧＡＬＫｐｎＩＲ２：５′－ＧＧＧＧＴＡＣＣＴＣＡＧＣＣＧＴＣＧＡＴＡＣＡＣＴＧＧＴＣＧ－３′；（下划线为ＫｐｎＩ位点）１．２．２　数据分析根据荧光实时定量ＰＣＲ中Ｃｔ值（每个反应管内的荧光信号到达设定的阈值时所经历的循环数）和样本起始拷贝数的对应关系，利用Ｃｔ值就可以计算ＮＧＡＬ基因和和内参基因ＧＡＰＤＨ的表达量的比值，具体方法采用Ｌｉｖａｋ和Ｓｃｈｍｉｔｔｇｅｎ根据数学推导得出的比较阈值法，ＮＧＡＬ基因肝癌和癌旁肝组织表达水平的差异倍数被定义为２－ΔΔＣｔ，其中ΔΔＣｔ＝［ＣｔＮＧＡＬ（肝癌组织）－ＣｔＧＡＰＤＨ（肝癌组织）］－［ＣｔＮＧＡＬ（癌旁组织）－ＣｔＧＡＰＤＨ（癌旁组织）］．采用配对“ｔ”检验方法检验各组间ＮＧＡＬ表达差异，Ｐ值小于０．０５被认为两者之间的相关性有意义，小于０．０１被认为两者的相关性有显著意义．数据的统计分析采用ＳＰＳＳ　１５．０ｆｏｒ　Ｗｉｎｄｏｗｓ软件包进行．１．２．３　转ＮＧＡＬ基因ＳＭＭＣ－７７２１细胞株的建立以人正常肝组织ｃＤＮＡ文库为模板，用引物ｈＮＧＡＬｃｌｏｎｅＦ和ｈＮＧＡＬｃｌｏｎｅＲ通过ＬＡ　Ｔａｑ酶，以６２℃的退火温度进行扩增，将得到的目标片段，连接入ｐＭＤ１８－Ｔ载体，命名为ｐＭＤ１８Ｔ－ＮＧＡＬ．以该载体为模板，用引物ＮＧＡＬＥｃｏＲＩＦ１和ＮＧＡＬＫｐｎＩＲ２通过ＬＡ　Ｔａｑ酶进行扩增以在基因两端添加酶切位点，回收大小为６１４ｂｐ的片段，用ＥｃｏＲⅠ和ＫｐｎⅠ进行双酶切，回收酶切后的片段，连接至用同样的酶酶切的ｐＥＧＦＰ－Ｃ１载体片段中，转化大肠杆菌ＤＨ５α，用含卡那霉素的ＬＢ平板进行筛选，测序正确的阳性克隆命名为ｐＥＧＦＰ－ＮＧＡＬ．采用脂质介导法将ｐＥＧＦＰ－ＮＧＡＬ载体转染肝癌细胞株ＳＭＭＣ－７７２１，通过ＲＴ－ＰＣＲ法验证ＮＧＡＬ基因在ＳＭＭＣ－７７２１细胞株内过量表达．１．２．４　细胞周期分析构建了ｐＥＧＦＰ－ＮＧＡＬ真核表达载体，并通过脂质体Ｌｉｐｔｏ　２０００将载体导入细胞株内，观察ＮＧＡＬ基因对肝癌细胞株的细胞周期的影响．我们将ｐＥＧＦＰ－ＮＧＡＬ载体和ｐＥＧＦＰ－Ｃ１空载体平行转染ＳＭＣＣ－７７２１细胞株（ｎ＝３），进行细胞周期实验．制备单细胞悬液，计数．接种６０ｍｍ培养皿，每皿２×１０５～３×１０５个细胞，分别转染质粒ｐＥＧＦＰ－ＮＧＡＬ和ｐＥＧＦＰ－Ｃ１空载体．质粒用量为每皿２．５μｇ．孵育４ｄ．再经胰酶消化、ＰＢＳ液洗涤，－２０℃预冷的７０％乙醇１ｍＬ固定２ｈ，ＰＢＳ洗涤后加入５０μｇ／ｍＬ的碘化丙啶液（ＰＩ）１ｍＬ染色１５ｍｉｎ．７４μｍ尼龙网筛过滤，流式细胞仪（ＢＤ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）计量分析样品，统计分析采用“ｔ”检验．１．２．５　细胞凋亡检测制备单细胞悬液，计数．接种６０ｍｍ培养皿，每皿２×１０５～３×１０５个细胞，分别转染质粒ｐＥＧＦＰ－ＮＧＡＬ和ｐＥＧＦＰ－Ｃ１空载体．质粒用量为每皿２．５μｇ．孵育１ｄ后．换液后加入１％ＦＢＳ的低血清ＤＭＥＭ培养基，继续培养２４～７２ｈ，再经胰酶消化、ＰＢＳ液洗涤，－２０℃预冷的７０％乙醇１ｍＬ固定２ｈ，ＰＢＳ洗涤后加入５０ｇ／ｍＬ的碘化丙啶液（ＰＩ）１ｍＬ染色１５ｍｉｎ．７４μｍ尼龙网筛过滤，流式细胞仪计量分析样品，统计分析采用“ｔ”检验．２　结果与分析２．１　ＮＧＡＬ在肝癌和癌旁肝组织中的表达情况我们通过荧光实时定量ＰＣＲ技术检测发现５３对肝癌样品中ＮＧＡＬ基因的表达情况，表２所列为ＮＧＡＬ基因在５３对肝癌样品中表达的ΔΔＣｔ值．根据上文中提到的数据分析方法，可知２－ΔΔＣｔ值就是各３９　第１期李林国等：ＮＧＡＬ基因在原发性肝癌中的表达及其功能分析个样本间基因表达量的倍数关系，以ΔΔＣｔ值＞１表示下调；－１≤ΔΔＣｔ值≤１表示表达无显著变化；ΔΔＣｔ值＜－１表示上调．因为整个样本的收集时间较长，考虑到某些样本可能已经发生降解，对实验结果可能造成一些影响．当使用发生降解的ＲＮＡ样本进行Ｒｅａｌｔｉｍｅ　ＲＴ－ＰＣＲ实验时，内参基因ＧＡＰＤＨ达到同样的检测丰度需要的循环反应数更多，表现为Ｃｔ值增大，所以在本文中我们以癌旁组织中内参基因ＧＡＰＤＨ的Ｃｔ值小于２０作为合格ＲＮＡ样本的筛选标准．故我们选取其中２３对肝癌样本进行分析，发现ＮＧＡＬ上调表达的为１２例，无显著变化的为８例，下调表达的为３例，因此ＮＧＡＬ在５２．１７％的肝癌组织中上调表达，且差异具有统计学意义（Ｐ＝０．０３５＜０．０５）．结果表明在原发性肝癌中ＮＧＡＬ较高的表达水平具有普遍性，提示了ＮＧＡＬ基因的表达水平可能与肝癌的发生发展过程有密切的相关性．表２　ＮＧＡＬ基因Ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ　ＲＴ－ＰＣＲ结果Ｔａｂ．２　Ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ　ＲＴ－ＰＣＲ　ｒｅｓｕｌｔｓ　ｏｆ　ＮＧＡＬ　ｇｅｎｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ注：ΔΔＣｔ值＞１表示下调；－１≤ΔΔＣｔ值≤１表示表达无显著变化；ΔΔＣｔ值＜－１表示上调．２．２　ＮＧＡＬ基因的亚细胞定位研究用引物ｈＮＧＡＬｃｌｏｎｅＦ和ｈＮＧＡＬｃｌｏｎｅＲ克隆得到ＮＧＡＬ基因，并用ＮＧＡＬ基因构建载体ｐＥＧＦＰ－ＮＧＡＬ，并经测序验证其与预期序列完全一致．将构建好的重组子ｐＥＧＦＰ－ＮＧＡＬ转染ＳＭＣＣ－７７２１细胞．４８ｈ后Ｏｌｉｍｐｕｓ荧光显微镜下观察蛋白的亚细胞定位，分别使用４８８ｎｍ和４０５ｎｍ的激发光照射ＧＦＰ和ＤＡＰＩ染色的细胞核（图１）．显微镜下检测ＮＧＡＬ－ＧＦＰ在胞内的各部分也均有表达，且分布均匀，验证了ＮＧＡＬ是一种分泌蛋白，可存在于细胞内的各部分中．４９复旦学报（自然科学版）　第５１卷图１　ｐＥＧＦＰ－ＮＧＡＬ转染ＳＭＣＣ－７７２１细胞荧光显微镜观察结果（标尺＝５μｍ）Ｆｉｇ．１　Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ　ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ　ｏｂｓｅｒｖａｔｉｏｎ　ｒｅｓｕｌｔｓ　ｏｆ　ＳＭＣＣ－７７２１ｔｒａｎｓｆｅｒｒｅｄ（ｗｉｔｈ　ｐＥＧＦＰ－ＮＧＡＬ　Ｂａｒ＝５μｍ）Ａ．白光下细胞的形态；Ｂ．ＮＧＡＬ－ＧＦＰ在ＳＭＭＣ－７７２１细胞中的表达；Ｃ．细胞核ＤＡＰＩ染色；Ｄ．Ｂ、Ｃ的图像重叠２．３　ＮＧＡＬ基因过表达对肝癌细胞周期和细胞凋亡的影响以肝癌细胞株ＳＭＭＣ－７７２１为体外模型，研究过表达ＮＧＡＬ基因对ＳＭＭＣ－７７２１细胞周期和细胞凋亡的影响．按方法中所述，构建了ｐＥＧＦＰ－ＮＧＡＬ真核表达载体，并通过脂质体ｌｉｐｔｏ　２０００将载体导入细胞株内，为研究ＮＧＡＬ基因对肝癌细胞株的细胞周期的影响，我们将ｐＥＧＦＰ－ＮＧＡＬ载体和ｐＥＧＦＰ－Ｃ１空载体平行转染ＳＭＣＣ－７７２１细胞株（ｎ＝２），进行细胞周期实验．结果表明：转入ｐＥＧＦＰ－ＮＧＡＬ的细胞相比转入空载体的细胞进入Ｇ１，Ｓ，Ｇ２／Ｍ期的数量各不相同，且进入Ｓ期的细胞显著性增多（Ｐ＜０．０５）（图２）．为研究ＮＧＡＬ基因对肝癌细胞株的细胞凋亡的影响，我们将ｐＥＧＦＰ－ＮＧＡＬ载体和ｐＥＧＦＰ－Ｃ１空载体平行转染ＳＭＣＣ－７７２１细胞株（ｎ＝３），并用１％ＦＢＳ低血清诱导细胞凋亡，检测ｐＥＧＦＰ－ＮＧＡＬ对细胞凋亡的影响．结果表明：转染ｐＥＧＦＰ－ＮＧＡＬ载体能显著抑制低血清诱导的ＳＭＣＣ－７７２１肝癌细胞株的凋亡水平，Ｐ＝０．００３　３（图３）．３　讨　论ＮＧＡＬ蛋白在多种肿瘤组织中都上调表达，不同个体及不同部位的肿瘤ＮＧＡＬ蛋白的表达并不完全相同．研究表明ＮＧＡＬ蛋白分布于乳腺癌细胞系和乳腺癌组织中的胞浆内，呈颗粒状．肿瘤细胞周围的良性导管内也有弱阳性的分泌性ＮＧＡＬ蛋白存在．人乳腺癌组织中ＮＧＡＬ表达与乳腺癌的雌、孕激素受体水平和细胞增殖状态有关，ＮＧＡＬ蛋白阳性的肿瘤细胞其ｍＲＮＡ的表达水平是周围正常乳腺组织的２．８倍．在人的乳腺癌组织中用免疫组化法研究却未发现ＮＧＡＬ蛋白表达与ＨＥＲ－２／ｎｅｕ活化之间有关联，也未发现ＮＧＡＬ蛋白与乳腺癌的总体生存率相关［１５］．有研究发现ＮＧＡＬ蛋白在乳腺癌中可能通过保护ＭＭＰ－９不被降解从而增强其活性，促进血管新生及肿瘤生长来起作用［７］．研究发现在ＨＰＶ　Ｅ６Ｅ７癌基因转化基础上由ＴＰＡ促成的食管癌细胞系中，ＮＧＡＬ　ｍＲＮＡ的表达是明显升高的［１６］．同时ＮＧＡＬ蛋白在膀胱癌［１７］、肺癌、卵巢癌、前列腺癌等多种癌症中异常表达．目前对ＮＧＡＬ基因的功能研究还不充分，现在的研究显示ＮＧＡＬ蛋白与肿瘤的关系主要表现在以５９　第１期李林国等：ＮＧＡＬ基因在原发性肝癌中的表达及其功能分析下方面，ＮＧＡＬ蛋白可与ＭＭＰ９蛋白结合，形成ＭＭＰ９／ＮＧＡＬ复合物，并能保护ＭＭＰ９的不被降解，从而维持ＭＭＰ９的酶活性［１８］．ＮＧＡＬ蛋白能运载铁离子到细胞膜，从而激活或者抑制铁应答基因［１９］．体外实验证明ＮＧＡＬ蛋白通过增强细胞的铁吸收能力促进上皮细胞与间充质细胞之间的转化［２０］．ＮＧＡＬ蛋白可以通过自分泌的方式负调控红细胞的生成，过量的ＮＧＡＬ蛋白可以抑制红细胞前体细胞的分化及诱导其凋亡．ＮＧＡＬ蛋白通过二硫键与ＭＭＰ２９，即明胶酶Ｂ结合，调节ＭＭＰ２９的功能．ＭＭＰ２９一般以前酶的形式（Ｐｒｏ２ＭＭＰ２９）贮存于细胞内，当分泌到细胞外并切去Ｎ２端的一段序列后，才表现生物活性．ＮＧＡＬ蛋白可以结合ＭＭＰ的Ｎ２端胱氨酸开关，促进Ｐｒｏ２ＭＭＰ的活化．ＮＧＡＬ蛋白具有抵消金属基质蛋白酶２１的组织抑制剂（ｔｉｓｓｕｅ　ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ　ｏｆ　ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ２１，ＴＩＭＰ２１）对ＭＭＰ２９活性抑制的作用．因为ＭＭＰ２９在降解基底膜的Ⅳ型胶原和基质成分中起重要作用，因此推测ＮＧＡＬ可能在肿瘤的浸润和转移中发挥作用［１０］．ＮＧＡＬ蛋白能抑制Ｈ２Ｏ２导致的细胞凋亡，提示它可能具有缓解细胞在氧化应激条件下所受的损伤［２１］．ＮＧＡＬ在甲状腺癌细胞ＦＲＯ中高表达，消减表达ＮＧＡＬ的ＦＲＯ细胞在软琼脂上的生长能力及克隆形成率能力显著减弱，由此认为ＮＧＡＬ蛋白有助于甲状腺癌细胞的生存［２２］．对ＮＧＡＬ蛋白的功能研究提示其可能是一个癌基因或者促癌基因，在肿瘤的发生发展过程中发挥作用．本论文探索了ＮＧＡＬ在肝癌及其癌旁组织中的表达情况，发现ＮＧＡＬ基因在肝癌组织中高表达，由于样本量较少，未能统计分析其与肝癌的临床分期及预后等相关性．然而Ｓｕｎ等研究发现ＮＧＡＬ的在结直癌中的高表达并与肿瘤的分期及复发具有相关性，ＮＧＡＬ的表达水平可作为独立的预后因子判断结直肠癌的生存率［２３］．Ｋｉｍ等研究发现ＮＧＡＬ在肝癌组织中显著高表达，相对于癌旁组织，并且发现其通过阻隔ＪＮＫ和ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ信号传导通路抑制肝癌细胞的增殖和侵润，关于其机制的研究尚未完全清楚［２４］．Ｍａｒｔí等发现结肠癌肝转移术后患者中血清ＮＧＡＬ水平与临床预后及评分具有相关性，提示其可能作为结肠癌肝转移患者预后的潜在生物标记［２５］．Ｐａｔｉｌ等利用基因芯片的办法检测了７０３个基因，发现ＮＧＡＬ，ＧＰＣ３等分泌性蛋白的基因显著高表达，预示他们可能是具有前景的肝癌诊断标记［１４］．我们下一步实验将收集更多的临床肝癌样本及更详细的临床资料，进一步研究ＮＧＡＬ基因表达与肝癌临床分型分期及预后的相关性，探索其作为肝癌临床检测生物标记的可能性．本论文探索了ＮＧＡＬ基因转染肝癌细胞株ＳＭＣＣ－７７２１对其细胞周期及凋亡的影响，发现ＮＧＡＬ的表达可促使ＳＭＣＣ－７７２１细胞从Ｇ１期向Ｓ期转化，转化ＮＧＡＬ的细胞中Ｓ期细胞显著增多（Ｐ＜０．０５），提示其可能具有促进肝癌细胞生长的功能；细胞凋亡实验发现ＮＧＡＬ的表达可显著抑制低血清诱导下的细胞凋亡率（Ｐ＜０．０５），提示其可能参与抑制肝癌细胞的凋亡．Ｗｅｉｓｋｉｒｃｈｅｎ等研究发现ＮＧＡＬ的表达与肝脏的损伤具有相关性，并且导致炎症相关反应，白介素１β通过ＮＦ－κＢ活化可诱导ＮＧＡＬ在肝癌细胞株ＨｅｐＧ２中高表达［２６］．Ｒｏｕｄｋｅｎａｒ等发现当用Ｘ射线或者过氧化氢处理肝癌细胞株ＨｅｐＧ２时，ＮＧＡＬ可以被氧化应激诱导高显著高表达，当加入二甲亚砜或者半胱胺等抗氧化剂时，高表达的ＮＧＡＬ可以被抵消［２７］．研究表明ＮＧＡＬ基因的表达与肝脏的损伤及炎症反应相关，但是ＮＧＡＬ基因在肝癌中的作用机制还不明确．本论文探索了其对肝癌细胞株的细胞周期、细胞凋亡的影响，为进一步研究其机制打下了基础．本论文中细胞周期及凋亡试验中所使用的肝癌细胞株ＳＭＣＣ－７７２１，需研究细胞株本身ＮＧＡＬ的表达情况，对该细胞株的背景进行深入的了解．可对该细胞株进行ＮＧＡＬ基因的敲减实验，通过ＲＮＡｉ等方法抑制ＮＧＡＬ基因的表达，观察其对肝癌细胞株的细胞周期及细胞凋亡的影响．另外，还可以进一步研究ＮＧＡＬ基因起作用的细胞信号传导通路，进一步探索其在肝癌发生发展中的作用机制．ＮＧＡＬ基因在乳腺癌、食管癌、胰腺癌、结肠癌、肝癌等多种恶性肿瘤中异常表达，且与癌症的进展、转移、预后等密切相关．作为一种分泌蛋白，可能在恶性肿瘤的早期诊断、判断预后等方面存在潜在的应用价值，其在恶性肿瘤演进中的机制和意义还有待进一步深入研究．参考文献：［１］　Ｋｊｅｌｄｓｅｎ　Ｌ，Ｊｏｈｎｓｅｎ　Ａ　Ｈ，Ｓｅｎｇｅｌ　Ｈ，ｅｔ　ａｌ．Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｐｒｉｍａｒｙ　ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ　ｏｆ　ＮＧＡＬ，ａ　ｎｏｖｅｌ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ａｓｓｏｃｉａｔｅｄｗｉｔｈ　ｈｕｍａｎ　ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌ　ｇｅｌａｔｉｎａｓｅ［Ｊ］．Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９９３，２６８（１４）：１０４２５．［２］　Ｆｌｏｗｅｒ　Ｄ　Ｒ．Ｔｈｅ　ｌｉｐｏｃａｌｉｎ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｆａｍｉｌｙ：ａ　ｒｏｌｅ　ｉｎ　ｃｅｌｌ　ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ［Ｊ］．ＦＥＢＳ　ｌｅｔｔｅｒｓ，１９９４，３５４（１）：６９复旦学报（自然科学版）　第５１卷７－１１．［３］　Ｃｏｗｌａｎｄ　Ｊ　Ｂ，Ｂｏｒｒｅｇａａｒｄ　Ｎ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｐａｔｔｅｒｎ　ｏｆ　ｔｉｓｓｕｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｇｅｎｅ　ｆｏｒｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌ　ｇｅｌａｔｉｎａｓｅ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ　ｌｉｐｏｃａｌｉｎ　ｆｒｏｍ　ｈｕｍａｎｓ［Ｊ］．Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，１９９７，４５（１）：１７－２３．［４］　Ｂｕｎｄｇａａｒｄ　Ｊ　Ｒ，Ｓｅｎｇｅｌｏｖ　Ｈ，Ｂｏｒｒｅｇａａｒｄ　Ｎ，ｅｔ　ａｌ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ｃｌｏｎｉｎｇ　ａｎｄ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　ａ　ｃＤＮＡ　ｅｎｃｏｄｉｎｇＮＧＡＬ：ａ　ｌｉｐｏｃａｌｉｎ　ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ　ｉｎ　ｈｕｍａｎ　ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌｓ［Ｊ］．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ　ａｎｄ　Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ　ＲｅｓｅａｒｃｈＣｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ，１９９４，２０２（３）：１４６８－１４７５．［５］　Ｋｊｅｌｄｓｅｎ　Ｌ，Ｃｏｗｌａｎｄ　Ｊ　Ｂ，Ｂｏｒｒｅｇａａｒｄ　Ｎ．Ｈｕｍａｎ　ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌ　ｇｅｌａｔｉｎａｓｅ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ　ｌｉｐｏｃａｌｉｎ　ａｎｄｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ　ｐｒｏｔｅｉｎｓ　ｉｎ　ｒａｔ　ａｎｄ　ｍｏｕｓｅ［Ｊ］．Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ　ｅｔ　Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ　Ａｃｔａ（ＢＢＡ）－Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ　ａｎｄＭｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，２０００，１４８２（１－２）：２７２－２８３．［６］　熊华淇，许丽艳．ＮＧＡＬ基因的功能及其在人正常和肿瘤组织中的表达［Ｊ］．国外医学：生理病理科学与临床分册，２００２，２２（００１）：１２－１４．［７］　Ｆｅｒｎáｎｄｅｚ　Ｃ　Ａ，Ｙａｎ　Ｌ，Ｌｏｕｉｓ　Ｇ，ｅｔ　ａｌ．Ｔｈｅ　ｍａｔｒｉｘ　ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ－９／ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌ　ｇｅｌａｔｉｎａｓｅ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄｌｉｐｏｃａｌｉｎ　ｃｏｍｐｌｅｘ　ｐｌａｙｓ　ａ　ｒｏｌｅ　ｉｎ　ｂｒｅａｓｔ　ｔｕｍｏｒ　ｇｒｏｗｔｈ　ａｎｄ　ｉｓ　ｐｒｅｓｅｎｔ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｕｒｉｎｅ　ｏｆ　ｂｒｅａｓｔ　ｃａｎｃｅｒ　ｐａｔｉｅｎｔｓ［Ｊ］．Ｃｌｉｎ　Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ，２００５，１１（１５）：５３９０．［８］　许丽艳，李恩民．ＮＧＡＬ基因在永生化食管上皮细胞恶性转化中过表达的研究［Ｊ］．生物化学与生物物理进展，２００１，２８（００６）：８３９－８４３．［９］　Ｌｉ　Ｅ　Ｍ，Ｘｕ　Ｌ　Ｙ，Ｃａｉ　Ｗ　Ｊ，ｅｔ　ａｌ．Ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ　ｏｆ　ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌ　ｇｅｌａｔｉｎａｓｅ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ　ｌｉｐｏｃａｌｉｎ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｅｓｏｐｈａｇｅａｌｃａｒｃｉｎｏｍａ　ｃｅｌｌ　ｌｉｎｅ　ＳＨＥＥＣ［Ｊ］．Ａｃｔａ　Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ　ｅｔ　Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ　Ｓｉｎｉｃａ，２００３，３５（３）：２４７．［１０］　Ｋｕｂｂｅｎ　Ｆ　Ｊ　Ｇ　Ｍ，Ｓｉｅｒ　Ｃ　Ｆ　Ｍ，Ｈａｗｉｎｋｅｌｓ　Ｌ　Ｊ　Ａ　Ｃ，ｅｔ　ａｌ．Ｃｌｉｎｉｃａｌ　ｅｖｉｄｅｎｃｅ　ｆｏｒ　ａ　ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ　ｒｏｌｅ　ｏｆｌｉｐｏｃａｌｉｎ－２ａｇａｉｎｓｔ　ＭＭＰ－９ａｕｔｏｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｔｈｅ　ｉｍｐａｃｔ　ｆｏｒ　ｇａｓｔｒｉｃ　ｃａｎｃｅｒ［Ｊ］．Ｅｕｒ　Ｊ　Ｃａｎｃｅｒ，２００７，４３（１２）：１８６９－１８７６．［１１］　Ｌｉｍ　Ｒ，Ａｈｍｅｄ　Ｎ，Ｂｏｒｒｅｇａａｒｄ　Ｎ，ｅｔ　ａｌ．Ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌ　ｇｅｌａｔｉｎａｓｅ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ　ｌｉｐｏｃａｌｉｎ（ＮＧＡＬ）ａｎ　ｅａｒｌｙ－ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ　ｂｉｏｍａｒｋｅｒ　ｆｏｒ　ｏｖａｒｉａｎ　ｃａｎｃｅｒ：ＮＧＡＬ　ｉｓ　ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ　ｗｉｔｈ　ｅｐｉｄｅｒｍａｌ　ｇｒｏｗｔｈ　ｆａｃｔｏｒ－ｉｎｄｕｃｅｄｅｐｉｔｈｅｌｉｏ－ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ　ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ［Ｊ］．Ｉｎｔ　Ｊ　Ｃａｎｃｅｒ，２００７，１２０（１１）：２４２６－２４３４．［１２］　Ｚｈａｎｇ　Ｈ，Ｘｕ　Ｌ，Ｘｉａｏ　Ｄ，ｅｔ　ａｌ．Ｕｐｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌ　ｇｅｌａｔｉｎａｓｅ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ　ｌｉｐｏｃａｌｉｎ　ｉｎ　ｏｅｓｏｐｈａｇｅａｌｓｑｕａｍｏｕｓ　ｃｅｌｌ　ｃａｒｃｉｎｏｍａ：ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ　ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ　ｗｉｔｈ　ｃｅｌｌ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｔｕｍｏｕｒ　ｉｎｖａｓｉｏｎ［Ｊ］．Ｊｏｕｒｎａｌｏｆ　Ｃｌｉｎｉｃａｌ　Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ，２００７，６０（５）：５５５．［１３］　Ｃｈａｋｒａｂｏｒｔｙ　Ｓ．Ｎｇａｌ／Ｌｉｐｏｃａｌｉｎ－２ｉｓ　ａ　ｍａｒｋｅｒ　ｏｆ　ｅａｒｌｙ　ｄｙｓｐｌａｓｔｉｃ　ｃｈａｎｇｅｓ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｐａｎｃｒｅａｓ　ａｎｄ　ａ　ｐｏｓｓｉｂｌｅｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ　ｍａｒｋｅｒ　ｉｎ　ｐａｎｃｒｅａｔｉｔｉｓ　ａｎｄ／ｏｒ　ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ　ａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａ［Ｊ］．Ｃａｎｃｅｒ　Ｂｉｏｍａｒｋｅｒｓ，２００８，４（３）：１３２－１３２．［１４］　Ｐａｔｉｌ　Ｍ　Ａ，Ｃｈｕａ　Ｍ　Ｓ，Ｐａｎ　Ｋ　Ｈ，ｅｔ　ａｌ．Ａｎ　ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ　ｄａｔａ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ａｐｐｒｏａｃｈ　ｔｏ　ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚｅ　ｇｅｎｅｓ　ｈｉｇｈｌｙｅｘｐｒｅｓｓｅｄ　ｉｎ　ｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒ　ｃａｒｃｉｎｏｍａ［Ｊ］．Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，２００５，２４（２３）：３７３７－３７４７．［１５］　Ｓｔｏｅｓｚ　Ｓ　Ｐ，Ｆｒｉｅｄｌ　Ａ，Ｈａａｇ　Ｊ　Ｄ，ｅｔ　ａｌ．Ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｏｕｓ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｌｉｐｏｃａｌｉｎ　ＮＧＡＬ　ｉｎ　ｐｒｉｍａｒｙ　ｂｒｅａｓｔｃａｎｃｅｒｓ［Ｊ］．Ｉｎｔ　Ｊ　Ｃａｎｃｅｒ，１９９８，７９（６）：５６５－５７２．［１６］　Ｍａｒｕ　Ｄ　Ｍ．Ｌｏｓｓ　ｏｆ　ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌ　ｇｅｌａｔｉｎａｓｅ　ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ　ｌｉｐｏｃａｌｉｎ（ＮＧＡＬ）ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｉｎ　ｅｓｏｐｈａｇｅａｌａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａ（ＥＡＣ）ｉｓ　ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ　ｗｉｔｈ　ｈｉｇｈｅｒ　ｐａｔｈｏｌｏｇｉｃ　ｓｔａｇｅ　ａｎｄ　ｐｏｏｒ　ｓｕｒｖｉｖａｌ［Ｃ］∥９８ｔｈ　ＡｎｎｕａｌＭｅｅｔｉｎｇ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｕｎｉｔｅｄ－Ｓｔａｔｅｓ－ａｎｄ－Ｃａｎａｄｉａｎ－Ａｃａｄｅｍｙ－ｏｆ－Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ，Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ：２００９．［１７］　Ｄｏｋｕｎ　Ｏ　Ｙ，Ｆｌｏｒｌ　Ａ　Ｒ，Ｓｅｉｆｅｒｔ　Ｈ－Ｈ，ｅｔ　ａｌ．Ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ　ｏｆ　ＳＮＣＧ，Ｓ１００Ａ４，Ｓ１００Ａ９ａｎｄ　ＬＣＮ２ｇｅｎｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ａｎｄ　ＤＮＡ　ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ　ｉｎ　ｂｌａｄｄｅｒ　ｃａｎｃｅｒ［Ｊ］．Ｉｎｔ　Ｊ　Ｃａｎｃｅｒ，２００８，１２３（１２）：２７９８－２８０７．［１８］　Ｙａｎ　Ｌ，Ｂｏｒｒｅｇａａｒｄ　Ｎ，Ｋｊｅｌｄｓｅｎ　Ｌ，ｅｔ　ａｌ．Ｔｈｅ　ｈｉｇｈ　ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ｗｅｉｇｈｔ　ｕｒｉｎａｒｙ　ｍａｔｒｉｘ　ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ（ＭＭＰ）ａｃｔｉｖｉｔｙ　ｉｓ　ａ　ｃｏｍｐｌｅｘ　ｏｆ　ｇｅｌａｔｉｎａｓｅ　Ｂ／ＭＭＰ－９ａｎｄ　ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌ　ｇｅｌａｔｉｎａｓｅ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ　ｌｉｐｏｃａｌｉｎ（ＮＧＡＬ）．Ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ　ｏｆ　ＭＭＰ－９ａｃｔｉｖｉｔｙ　ｂｙ　ＮＧＡＬ［Ｊ］．Ｊ　Ｂｉｏｌ　Ｃｈｅｍ，２００１，２７６（４０）：３７２５８－３７２６５．［１９］　Ｙａｎｇ　Ｊ，Ｇｏｅｔｚ　Ｄ，Ｌｉ　ＪＹ，ｅｔ　ａｌ．Ａｎ　ｉｒｏｎ　ｄｅｌｉｖｅｒｙ　ｐａｔｈｗａｙ　ｍｅｄｉａｔｅｄ　ｂｙ　ａ　ｌｉｐｏｃａｌｉｎ［Ｊ］．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ｃｅｌｌ，２００２，１０（５）：１０４５－１０５６．［２０］　Ｇｗｉｒａ　Ｊ　Ａ，Ｗｅｉ　Ｆ，Ｉｓｈｉｂｅ　Ｓ，ｅｔ　ａｌ．Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌ　ｇｅｌａｔｉｎａｓｅ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ　ｌｉｐｏｃａｌｉｎ　ｒｅｇｕｌａｔｅｓｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ　ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｓｉｓ　ｉｎ　ｖｉｔｒｏ［Ｊ］．Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２００５，２８０（９）：７８７５．［２１］　Ｒｏｕｄｋｅｎａｒ　Ｍ　Ｈ，Ｈａｌａｂｉａｎ　Ｒ，Ｇｈａｓｅｍｉｐｏｕｒ　Ｚ，ｅｔ　ａｌ．Ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌ　ｇｅｌａｔｉｎａｓｅ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ　ｌｉｐｏｃａｌｉｎ　ａｃｔｓ　ａｓ　ａｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ　ｆａｃｔｏｒ　ａｇａｉｎｓｔ　Ｈ２Ｏ２ｔｏｘｉｃｉｔｙ［Ｊ］．Ａｒｃｈｉｖｅｓ　ｏｆ　Ｍｅｄｉｃａｌ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２００８，３９（６）：５６０－５６６．７９　第１期李林国等：ＮＧＡＬ基因在原发性肝癌中的表达及其功能分析［２２］　Ｉａｎｎｅｔｔｉ　Ａ，Ｐａｃｉｆｉｃｏ　Ｆ，Ａｃｑｕａｖｉｖａ　Ｒ，ｅｔ　ａｌ．Ｔｈｅ　ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌ　ｇｅｌａｔｉｎａｓｅ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ　ｌｉｐｏｃａｌｉｎ（ＮＧＡＬ），ａ　ＮＦ－ｋａｐｐａＢ－ｒｅｇｕｌａｔｅｄ　ｇｅｎｅ，ｉｓ　ａ　ｓｕｒｖｉｖａｌ　ｆａｃｔｏｒ　ｆｏｒ　ｔｈｙｒｏｉｄ　ｎｅｏｐｌａｓｔｉｃ　ｃｅｌｌｓ［Ｊ］．Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ　ＵＳＡ，２００８，１０５（３７）：１４０５８－１４０６３．［２３］　Ｓｕｎ　Ｙ，Ｙｏｋｏｉ　Ｋ，Ｌｉ　Ｈ，ｅｔ　ａｌ．ＮＧＡＬ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｉｓ　ｅｌｅｖａｔｅｄ　ｉｎ　ｂｏｔｈ　ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ　ａｄｅｎｏｍａ－ｃａｒｃｉｎｏｍａ　ｓｅｑｕｅｎｃｅａｎｄ　ｃａｎｃｅｒ　ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ　ａｎｄ　ｅｎｈａｎｃｅｓ　ｔｕｍｏｒｉｇｅｎｅｓｉｓ　ｉｎ　ｘｅｎｏｇｒａｆｔ　ｍｏｕｓｅ　ｍｏｄｅｌｓ［Ｊ］．Ｃｌｉｎ　Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ，２０１１，１７（１３）：４３３１－４３４０．［２４］　Ｌｅｅ　ＥＫ，Ｋｉｍ　Ｈ　Ｊ，Ｌｅｅ　Ｋ　Ｊ，ｅｔ　ａｌ．Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｉｎｖａｓｉｏｎ　ｏｆ　ｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒ　ｃａｒｃｉｎｏｍａｃｅｌｌｓ　ｂｙ　ｌｉｐｏｃａｌｉｎ　２ｔｈｒｏｕｇｈ　ｂｌｏｃｋａｄｅ　ｏｆ　ＪＮＫ　ａｎｄ　ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ　ｓｉｇｎａｌｉｎｇ［Ｊ］．Ｉｎｔ　Ｊ　Ｏｎｃｏｌ，２０１１，３８（２）：３２５－３３０．［２５］　ＭａｒｔíＪ，Ｆｕｓｔｅｒ　Ｊ，Ｈｏｔｔｅｒ　Ｇ，ｅｔ　ａｌ．Ｓｅｒｕｍ　ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌ　ｇｅｌａｔｉｎａｓｅ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ　ｌｉｐｏｃａｌｉｎ　ｉｎ　ｐａｔｉｅｎｔｓ　ｗｉｔｈｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ　ｌｉｖｅｒ　ｍｅｔａｓｔａｓｅｓ：ｐｒｅｌｉｍｉｎａｒｙ　ｒｅｓｕｌｔｓ　ｏｆ　ａｎ　ｅｘｐｌｏｒａｔｏｒｙ　ｐｒｏｓｐｅｃｔｉｖｅ　ｓｔｕｄｙ［Ｊ］．Ｉｎｔ　Ｊ　ＢｉｏｌＭａｒｋｅｒｓ，２０１０，２５（１）：２１－２６．［２６］　Ｂｏｒｋｈａｍ－Ｋａｍｐｈｏｒｓｔ　Ｅ，Ｄｒｅｗｓ　Ｆ，Ｗｅｉｓｋｉｒｃｈｅｎ　Ｒ，ｅｔ　ａｌ．Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ｌｉｐｏｃａｌｉｎ－２ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｉｎ　ａｃｕｔｅ　ａｎｄｃｈｒｏｎｉｃ　ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ　ｌｉｖｅｒ　ｉｎｊｕｒｙ　ｍｏｄｅｒａｔｅｄ　ｂｙ　ｐｒｏ－ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ　ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ　ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ－１βｔｈｒｏｕｇｈ　ｎｕｃｌｅａｒｆａｃｔｏｒ－κＢ　ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ［Ｊ］．Ｌｉｖｅｒ　Ｉｎｔ，２０１１，３１（５）：６５６－６６５．［２７］　Ｒｏｕｄｋｅｎａｒ　Ｍ　Ｈ，Ｋｕｗａｈａｒａ　Ｙ，Ｂａｂａ　Ｔ，ｅｔ　ａｌ．Ｏｘｉｄａｔｉｖｅ　ｓｔｒｅｓｓ　ｉｎｄｕｃｅｄ　ｌｉｐｏｃａｌｉｎ　２ｇｅｎｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ：ａｄｄｒｅｓｓｉｎｇ　ｉｔｓ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｕｎｄｅｒ　ｔｈｅ　ｈａｒｍｆｕｌ　ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ［Ｊ］．Ｊ　Ｒａｄｉａｔ　Ｒｅｓ（Ｔｏｋｙｏ），２００７，４８（１）：３９－４４．Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ａｎｄ　Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ　Ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆ　ＮＧＡＬ　Ｇｅｎｅ　ｉｎＨｕｍａｎ　Ｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒ　ＣａｒｃｉｎｏｍａＬＩ　Ｌｉｎ－ｇｕｏ，ＺＨＯＵ　Ｔｏｎｇ，ＨＯＵ　Ｙｏｎｇ－ｍｉｎ（Ｓｔａｔｅ　Ｋｅｙ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　ｏｆ　Ｇｅｎｅｔｉｃ　Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｆｕｄａｎ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｓｈａｎｇｈａｉ　２００４３３，Ｃｈｉｎａ）Ａｂｓｔｒａｃｔ：ＮＧＡＬ（ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌ　ｇｅｌａｔｉｎａｓｅ　ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ　ｌｉｐｏｃａｌｉｎ）ｇｅｎｅ　ｉｓ　ａ　ｎｅｗ　ｍｅｍｂｅｒ　ｏｆ　Ｌｉｐｏｃａｌｉｎ　ｆａｍｉｌｙ，ａｎｄ　ｉｓｃｌｏｓｅｌｙ　ｒｅｌａｔｅｄ　ｔｏ　ｔｈｅ　ｆｕｎｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ＭＭＰ－９．ＮＧＡＬ　ｉｓ　ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ　ａｂｎｏｒ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整合素α6在原发性肝细胞癌发生、发展中的相关作用研究进展

ｗａｎｇｊｉｋ２００６＠ｑｑ．ｔｏｍ
（ＤＳＴ）。＠Ｓｒｃ激酶家族，形成了Ｂ结构尾端多个磷酸化酪氨酸残基。④接头蛋白（ＳＨＣ），可以与ｐ
的磷酸化酪氨酸残基相连接，并激活Ｒａｓ — ＭＡＰＫ途
从而参与肝癌细胞的黏附与转移过程。２．２ＢＳｔｉｐｐ等在在体肿瘤研究中发现，十
整合素家族是一类由Ｏｒ．和１３两个亚单位以非
共价键结合形成的异二聚体跨的表达。在这些研究中，仪整合素的作用比Ｏｒ．ｐ，整合素更为引人注目。针对１３亚单位研究发现，Ｂ的胞质末端与其
恶性肿瘤的侵袭、转移是一个动态的、连续的过程。研究发现，恶性肿瘤的发生、发展、侵袭和转移常常伴有ＥＣＭ及其细胞表面受体表达的变化。整合素的表达在不同肿瘤细胞以及同一细胞的不同阶
段各有不同。
肝癌转移的关键步骤之一是改变细胞外基质
（ＥＣＭ）与肿瘤细胞的亲和性。近年来随着研究的深入，确定了整合素在癌症黏附、侵袭、转移过程中
起到了关键作用。而在肝癌的转移过程中，对整合
关键词：肝肿瘤；整合素０【亚单位；层黏连蛋白；转移
ｄｏｉ：１０．３９６９／ｊ。ｉｓｓｎ．１００２－２６６Ｘ．２０１３．１２．０４０

ifit5基因

ifit5基因摘要：1.介绍ifit5基因2.ifit5基因在生物体内的功能3.ifit5基因与疾病的关系4.ifit5基因在医学研究中的应用5.我国对ifit5基因的研究进展正文：ifit5基因，全称为干扰素诱导的蛋白5，是一种在生物体内发挥重要作用的基因。

它主要通过干扰素信号通路调控免疫应答，对抗病毒感染和肿瘤发生等方面具有显著作用。

在生物体内，ifit5基因通过干扰素信号通路来调控免疫应答。

当病毒感染或肿瘤发生时，干扰素信号通路会被激活，从而引发ifit5基因的表达。

表达出的ifit5蛋白能够抑制病毒的复制，降低肿瘤的发生风险。

此外，ifit5基因还能通过影响细胞周期调控、细胞凋亡等过程，进一步维护生物体的健康。

近年来，研究发现ifit5基因与许多疾病密切相关。

例如，在病毒感染性疾病中，ifit5基因的表达水平通常会增加，帮助机体抵御病毒入侵。

而在肿瘤发生过程中，ifit5基因的表达受到抑制，导致肿瘤细胞恶性增殖。

因此，通过调控ifit5基因的表达，有望为治疗病毒感染和肿瘤等疾病提供新的策略。

在医学研究领域，ifit5基因已成为一个备受关注的课题。

研究者通过基因敲除、过表达等技术手段，研究ifit5基因在不同疾病模型中的作用，为寻找新型治疗靶点提供理论依据。

同时，针对ifit5基因的调控机制也成为研究的重点，以期为开发相关药物提供方向。

近年来，我国对ifit5基因的研究取得了显著进展。

我国科学家通过研究发现，ifit5基因在某些病毒感染和肿瘤发生过程中具有重要作用，为相关疾病的治疗提供了新的思路。

此外，我国还积极开展ifit5基因相关药物的研究，为临床应用提供支持。

总之，ifit5基因作为一种重要的生物学基因，在生物体的免疫应答和疾病发生发展中发挥着关键作用。

肝癌早期检测的生物标志物筛选与实验研究

肝癌早期检测的生物标志物筛选与实验研究肝癌是世界上最常见的恶性肿瘤之一，其高度侵袭性和易转移性使之成为难治性疾病。

据统计，全球每年约有75万人死于肝癌，我国更是肝癌的高发地区之一。

与许多其他癌症一样，肝癌早期发现和治疗是预防和控制该疾病的关键。

因此，研究肝癌早期检测的生物标志物是当前的热点和难点问题之一。

生物标志物是指能够说明生物体内某种生理或病理状态的物质或指标。

在肝癌的早期检测中，生物标志物可以作为一个重要的参考。

目前，临床上用于肝癌早期筛查的生物标志物有AFP、PIVKA-II、ALT、AST、GGT、TB、ALB等。

然而，这些检测指标的特异性和敏感性都存在较大的局限，存在误诊和漏诊的风险。

在分子生物学技术不断更新的今天，通过对患者血液样本、组织样本和体液样本中生物标志物的高通量筛选，以发现能够早期和准确诊断肝癌的生物标志物，已成为研究的重点和热点。

以下将介绍目前常用的一些生物标志物筛选技术和肝癌生物标志物的研究情况。

一、基因芯片技术基因芯片技术是一种高通量筛选生物标志物的方法，其通过分析组织或细胞中的RNA或DNA来获取分子水平的信息。

通过将数以万计的基因序列固定在一个晶片上，检测样本中的RNA或DNA与芯片上的基因序列的杂交程度，可以快速地得到许多生物标志物的表达情况，为寻找肝癌早期生物标志物提供了重要的依据。

目前，该技术已被广泛应用于肝癌的研究，如对比肝癌与正常肝组织的基因表达谱、对比不同肝癌患者的基因表达谱、对比肝癌早期与晚期患者的基因表达谱等。

例如，研究表明，在肝癌组织中，FAM19A4、TMEM106B、AP1S2、IGHG1等基因的表达显著下调，而DSC2、SLC25A13、KRT6C等基因的表达显著上调，这些基因可以作为评估肝癌预后和治疗效果的生物标志物。

二、蛋白质芯片技术蛋白质芯片技术是一种用于分析大量蛋白质表达水平的高通量生物芯片技术。

该技术通过将数千个蛋白质固定在晶片上，将样本中的蛋白质与晶片上的蛋白质发生特异性的相互作用，以确定不同生物样本中的蛋白质表达量和表达模式，可以为肝癌早期诊断和治疗提供重要的生物标志物。

自噬相关基因5在肝癌组织中的表达及临床意义

《中国癌症杂志》2018年第28卷第5期 CHINA ONCOLOGY 2018 Vol.28 No.5321欢迎关注本刊公众号·论　著·基金项目：国家自然科学基金（81472302，81572425）。

通信作者：李航宇 E-mail: li_hangyu@自噬相关基因5在肝癌组织中的表达及临床意义彭雪强1，杨　良1，张小东1，马英博1，杨　朔1，李　岩1，魏士博1，范　庆1，华向东2，刘金钢1，李航宇11.中国医科大学附属第四医院普外科，辽宁沈阳 110032；2.中国医科大学肿瘤医院肝胆外科，辽宁沈阳 110042［摘要］背景与目的：肝细胞癌（hepatocellular carcinoma ，HCC ）是死亡率极高的原发性肝癌，其恶变的机制目前尚未明确。

近些年随着对自噬研究的深入，发现自噬可以提供肿瘤生长高能量的需求，增加肿瘤细胞对极端低氧、化疗药物等环境的适应性，因而与肿瘤的恶性进程关系密切。

该研究旨在探讨自噬小体形成中泛素样连接系统Atgl2-Atg5-Atgl6参与自噬的关键因子，自噬相关基因5（autophagy-related gene 5，Atg 5）在HCC 组织中的表达及与临床病理参数的关系。

方法：回顾性分析中国医科大学肿瘤医院于2015年3月—2017年6月进行肝癌手术切除的110例已确诊无误的HCC 标本，免疫组织化学染色检测110例癌旁及HCC 组织中Atg5蛋白的表达，同时分析HCC 组织中Atg5蛋白表达与患者临床病理学特征之间的关系。

蛋白质印迹法（Western blot ）与实时荧光定量聚合酶链反应（real-time fluorescent quantitative polymerase chain reaction ，RTFQ-PCR ）分别检测46例癌旁和HCC 组织中Atg5蛋白及mRNA 的表达。

结果：免疫组织化学结果显示，HCC 组织Atg5蛋白的阳性率71.82%（79/110），明显高于癌旁组织的阳性率20.09%（23/110）,差异有统计学意义（P <0.05）。

FCRL5蛋白对肝癌细胞增殖与侵袭迁移能力的作用及机制

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中国老年学杂志２０２１年７月第４１卷
论和实践依据。
１资料与方法１１临床资料选取江汉大学附属湖北省第三人民医院肝胆外科２０１０～２０１３年确诊的年龄≥６０岁的肝细胞癌患者１０４例作为研究对象，患者均符合原发性肝癌诊疗规范（２０１１年版）中诊断标准，〔１０〕患者自愿提供肝癌及癌旁组织标本用作分析。本研究经医院医学伦理协会批准，并获取患者及家属知情同意书。收集每例患者的癌组织及癌旁组织（距离癌灶５ｍ以上）标本。１２肝癌组织及癌旁正常组织ＦＣＲＬ５表达水平测定肝癌组织取肿瘤病灶边缘约２ｃｍ处，癌旁正常组织为距离癌灶５ｍ以上。取０２ｇ肝癌组织及癌旁正常组织，制成肝癌组织及癌旁组织匀浆后，酶联免疫吸附试验（ＥＬＩＳＡ）检测ＦＣＲＬ５表达量。Ｗｅｓｔｅｒｎ印迹检测ＦＣＲＬ５表达量：用含有ＰＭＳＦ的裂解缓冲液（Ｂｅｙｏｔｉｍｅ）裂解肝癌组织及癌旁正常组织。将裂解物在１５０００ｒ／ｍｉｎ，４℃下离心１０ｍｉｎ，收集上清液并保存在－８０℃ 下以备后用。使用二喹啉甲酸（ＢＣＡ）蛋白质测定试剂盒（Ｂｅｙｏｔｉｍｅ）测定蛋白质浓度。对蛋白质进行十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（ＳＤＳＰＡＧＥ），并根据制造商的方案（ＢｉｏＲａｄ，Ｒｉｃｈｍｏｎｄ，ＣＡ，ＵＳＡ）使用转移装置转移至聚偏氟乙烯（ＰＶＤＦ）膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）。用含有０１％Ｔｗｅｅｎ２０的ＴＢＳＴ缓冲液（１０ｍｍｏｌ／ＬＴｒｉｓＨＣｌ，ｐＨ８０和１５０ｍｍｏｌ／ＬＮａＣｌ）中的脱脂奶粉封闭膜，在相同缓冲液中洗涤并用以下抗体探测：抗ＦＣＲＬ５（Ａｂｃａｍ）和抗 β肌动蛋白抗体（ＣｅｌｌＳｉｇｎａｌｉｎｇＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）在４℃过夜。然后将膜在ＴＢＳＴ缓冲液中洗涤并与各自的第二抗体一起温育。使用Ｏｄｙｓｓｅｙ红外成像系统（ＬｉＣｏｒＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）获得红外荧光图像，进行半定量比较分析。免疫组化方法测定ＦＣＲＬ５的表达水平，进行标准抗生物素蛋白生物素复合物过氧化物酶免疫组织化学染色。在二甲苯和梯度醇脱蜡后，通过水浴釜加热３０ｍｉｎ，在柠檬酸盐缓冲液（１０ｍｍｏｌ／ＬｐＨ６０）中进行加热的抗原修复。内源性过氧化物酶在０３％过氧化氢中封闭１０ｍｉｎ。通过在１０％正常动物血清中孵育１０ｍｉｎ来阻断非特异性结合。将切片在４℃ 下与一抗孵育２４ｈ，所述一抗为抗ＦＣＲＬ５的多克隆抗体（ＨＰＡ０２１０３０，ＳｉｇｍａＡｌｄｒｉｃｈ）。将生物素化的第二抗体（ＩｇＧ）和辣根过氧化物酶标记的抗生物素蛋白与样品一起温育。使用二氨基联苯胺（ＤＡＢ）显色。

血清白细胞介素-6对乙型肝炎病毒相关原发性肝癌的预测价值研究

ＴｈｉｒｄＨｏｓｐｉｔａｌｏｆＮａｎｔｏｎｇ，ｆｒｏｍＭａｙ２００８ｔｏＪｕｎｅ２０１２ｗｅｒｅｃｏｌｌｅｃｔｅｄ，ａｍｏｎｇｗｈｏｍ，３２ｐａｔｉｅｎｔｓｗｉｔｈＨＢＶ
表达水平显著高于肝硬化患者，肝硬化患者高于健康对照组（ｔ＝６．４４２、６．０６９，Ｐ均＝０．０００）；血清
ＩＬ．６与ＡＦＰ呈正相关关系（ｒ＝０．２６２、Ｐ＝０．０４７），二者预测ＨＢＶ相关ＰＨＣ发生ＲＯＣ面积分别为０．８５９和０．９０４；二者均能较好预￣Ｉ］ＨＢＶ相关ＰＨＣ发生（ｚ＝７．９１７、１０．００８，Ｐ均＝０．０００）；以血清ＩＬ．６和
关ＰＨＣ及３２例ＨＢＶ相关肝硬化患者为研究对象，采用酶联免疫吸附试验检测血清ＩＬ一６表达水平，分
析其与甲胎蛋白（ＡＦＰ）的相关性及对ＨＢＶ相关ＰＨＣ发生的判断。结果ＨＢＶ相关ＰＨＣ患者血清ＩＬ一６
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ｌｍｍ＠１６３．ｃｏｎｒ
［Ａｂｓｔｒａｃｔ］ＯｂｊｅｃｉｆｖｅＴｏｅｘｐｌｏｒｅｔｈｅｃｌｉｎｉｃａｌｖａｌｕｅｏｆｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ（ＩＬ）－６ｆｏｒｈｅｐａｔｉｔｉｓＢｖｉｕｒｕｓ（ＨＢＶ）ｒｅｌａｔｅｄｐｉｒｍａｒｙｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｒｃａｒｃｉｎｏｍａ（ＰＨＣ）．ＭｅｔｈｏｄｓＴｏｔａｌｏｆ３６ｐａｔｉｅｎｔｓｗｉｔｈＨＢＶｒｅｌａｔｅｄＰＨＣｉｎｔｈｅ

常春藤皂苷元调控IL-6抑制肝癌细胞增殖的免疫机制

doi：10.3969/j.issn.1000-484X.2023.09.013常春藤皂苷元调控IL-6抑制肝癌细胞增殖的免疫机制①崔文超刘明远关宝生②曾佳②田亚妮白雪③ （佳木斯大学基础医学院，佳木斯 154007）中图分类号R285 文献标志码 A 文章编号1000-484X（2023）09-1864-08［摘要］目的：揭示常春藤皂苷元（HD）对IL-6的调控作用及其抑制肝癌细胞增殖的免疫机制。

方法：①生物信息学分析受IL-6调控的免疫途径：利用GEO2R工具分析基因芯片数据集GSE14632中的差异表达基因，Immport数据库下载免疫基因，筛选二者交集基因，KOBAS数据库对交集基因进行京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路富集分析。

②实验验证HD对IL-6的调控作用：Western blot检测HD（0、30、60、120 μg/ml）干预下HepG2细胞内IL-6蛋白的相对表达量；构建H22荷瘤小鼠模型，荷瘤小鼠被随机分为5个实验组，每组12只：对照组、阳性环磷酰胺（CTX）25 mg/kg组、常春藤皂苷元低剂量组（100 mg/kg）、中剂量组（200 mg/kg）和高剂量组（400 mg/kg），小鼠腹腔注射给药，连续给药14 d，第15天所有动物称重后处死并取肿瘤组织，Western blot检测各实验组肿瘤组织中IL-6、KRAS、RAF1、MEK2、p-ERK1/2、p-JNK、AKT、NF-κB p50、PD-L1和p-STAT3蛋白相对表达。

结果：生物信息学分析发现MAPK信号通路、PD-L1的表达和PD-1检查点通路受到IL-6信号途径的调控；体外实验结果表明，与对照组相比，IL-6在HD（30、60、120 μg/ml）干预组蛋白相对表达呈现下降趋势（P<0.01）；体内实验结果表明，与对照组相比，IL-6、KRAS、RAF1、MEK2、p-ERK1/2、p-JNK、AKT、NF-κB p50、PD-L1和p-STAT3在HD（100、200、400 mg/kg）干预组蛋白相对表达总体呈现下降趋势（P<0.01）。

AAV在肝脏及眼部中的应用

ITRS是AAV病毒基因组复制和包装成病毒颗粒所必需的唯一顺式作用元件，其他结构和非结构蛋白可通过反式作用提供。

rAAV的构建通常涉及rep 和cap 基因的剔除和报告基因或治疗基因插入ITRs元件之间，产生的载体质粒随后与一个表达AAV的rep和cap基因的包装质粒一起共转染到组织培养细胞中。

带有报告基因或外源基因的重组AAV基因组就会被拯救、复制和包装成rAAV[11]，如图1所示。

图 1 AAV野生型及AAV载体基因组结构从1966年第一篇报道发现AAV是独立于腺病毒的新病毒起，到1984年第一篇应用rAAV为载体感染哺乳动物细胞的文章发表，rAAV作为一种新型病毒载体引起广泛关注，目前对其应用研究主要集中于以之为载体的基因治疗[10]。

相关临床应用的推进过程较为慎重缓慢，将rAAV注射进机体组织中，可以在动物或人体内获得长期有效的转基因表达，所涉及的组织器官包括肌肉组织、造血干细胞、心血管系统、肿瘤组织、中枢神经系统、呼吸道和肺的上皮组织等，其中最有效的是骨骼肌、脑、视网膜、肝脏、肠道固有层，所涉及的疾病包括ɑ1-抗胰蛋白酶缺乏症、老年性肌肉萎缩、凝血因子缺陷症、帕金森病、肿瘤等。

但rAAV载体在应用时也要注意一些不足之处，如包装外源基因的容量小于4.7 kb、滴度低和表达“滞后性”，即被转染细胞重组AAV-DNA转变为转录活跃的双链模式需要一定的时间等[2, 5]。

2. rAAV在肝脏疾病基因治疗中的应用2.1 肝脏及肝脏疾病肝脏是人体最大的实质性器官，也是人体的代谢中心器官，参与分泌胆汁、代谢、凝血、解毒及免疫等多项重要而复杂的生理功能，承担着人体内营养物质的消化，能量转换，解毒等重要的代谢功能。

肝脏是最先被用于基因治疗的器官之一，国内外科研人员开始探索利用日新月异的分子生物学技术对肝脏疾病进行基因水平上的治疗，力图走出对症治疗的常规思路，从根本上阻断肝脏疾病的发生发展。

但随着研究的深入，人们发现肝细胞是最难转化的细胞之一。

基于生物信息学分析LPAR5在甲状腺乳头状癌中的表达及其意义

基于生物信息学分析LPAR5在甲状腺乳头状癌中的表达及其意义作者：李娜连续兰宏伟许红昕来源：《中国现代医生》2021年第09期[摘要] 目的通過生物信息学的方法分析溶血磷脂酸受体5（LPAR5）在甲状腺乳头状癌（PTC）中的表达及临床意义，为PTC分子生物研究和生物标志物筛选提供理论依据。

方法2020年5月开始从GEO数据库中筛选数据，最终筛选出编号为GSE3678的基因芯片，并对样本进行规范化处理，筛选出差异表达基因LPAR5。

利用TCGA数据库验证LPAR5在甲状腺癌组织和正常甲状腺组织差异表达情况，同时在ulcan数据库分析LPAR5表达与PTC患者临床特征之间的关系。

通过GEPIA2分析LPAR5基因与甲状腺癌生存率之间的关系。

结果共筛选出甲状腺癌差异基因755个，其中表达上调差异基因314个，表达下调差异基因441个，基于TCGA基因表达数据分析得出LPAR5在甲状腺癌中表达高于正常甲状腺组织，LPAR5表达量与甲状腺癌患者的临床分期和N分期密切相关（P0.05），GEPIA2分析显示甲状腺癌患者LPAR5高表达组总生存率高于低表达组（P0.05）。

结论本研究通过生物信息学分析得到了甲状腺癌中的部分差异基因，并通过TCGA数据库分析进一步验证了LPAR5在甲状腺癌中的高表达，且与肿瘤临床分期和N分期密切相关，进一步证明了LPAR5可能参与PTC的发生发展，并影响PTC淋巴结转移。

[关键词] 甲状腺乳头状癌;LPAR5;生物信息学;GEO;TCGA;GEPIA2[中图分类号] R736.1 [文献标识码] A [文章编号] 1673-9701（2021）09-0001-04The expression and significance of LPAR5 in papillary thyroid carcinoma based on bioinformaticsLI Na1 LIAN Xu1 LAN Hongwei2 XU Hongxin11.Department of Endocrinology， Hongqi Hospital Affiliated to Mudanjiang Medical College，Mudanjiang 157000， China;2.Department of Oncology， Hongqi Hospital Affiliated to Mudanjiang Medical College， Mudanjiang 157000， China;[Abstract] Objective To analyze the expression and clinical significance of lysophosphatidic acid receptor 5 （LPAR5） in papillary thyroid carcinoma（PTC） by means of bioinformatics， so as to provide a theoretical basis for PTC molecular biology research and biomarker screening. Methods The data from the GEO database from May 2020 were screened. Finally the gene chip numbered GSE3678 was screened out. The samples were and standardized to screen out the differentially expressed gene LPAR5. The TCGA database was used to verify the differential expression of LPAR5 in thyroidcancer tissues and normal thyroid tissues. The relationship between the LPAR5 expression and clinical characteristics of PTC patients was analyzed in the ulcan database. The relationship between the LPAR5 gene and thyroid cancer survival rate was analyzed by GEPIA2. Results A total of 755 differential genes in thyroid cancer were screened， including 314 upregulated differentially expressed genes and 441 downregulated differentially expressed genes. Based on the analysis of TCGA gene expression data，it was concluded that the expression of LPAR5 in thyroid cancer was higher than that in normal thyroid tissue. The expression of LPAR5 was closely related to the clinical stage and N stage of thyroid cancer patients （P<0.05）， but had no correlation with gender and age （P>0.05）. GEPIA2 analysis showed that the overall survival rate of patients with thyroid cancer in the LPAR5 high expression group was higher than that in the low expression group（P0.05）. Conclusion This study obtained some differential genes in thyroid cancer through bioinformatics analysis， and further verified the high expression of LPAR5 in thyroid cancer through TCGA database analysis， and was closely related to the clinical stage and N stage of the tumor， which further proved that LPAR5 might be involved in the occurrence and development of PTC and affect PTC lymph node metastasis.[Key words] Papillary thyroid carcinoma; LPAR5; Bioinformatics; GEO; TCGA; GEPIA2甲状腺癌是内分泌最常见的恶性肿瘤，从全球范围来看，过去的30年甲状腺癌的发病率增长了300%[1]，是所有实体恶性肿瘤中发病率增长最快的。

NLR及PLR与原发性肝癌关系的研究

NLR及PLR与原发性肝癌关系的研究NLR及PLR与原发性肝癌关系的研究原发性肝癌是一种高度致命的肿瘤，其发展迅速且晚期病人的治疗难度较大。

因此，寻找早期诊断的生物标志物和新的治疗方法具有重要意义。

最近的研究表明，中性粒细胞与淋巴细胞的比值（NLR）及血小板与淋巴细胞的比值（PLR）与原发性肝癌的发生和进展相关联。

中性粒细胞和淋巴细胞是我们体内免疫系统的重要成分。

中性粒细胞激活后可释放多种炎症介质，如白细胞介素-6（IL-6）和肿瘤坏死因子-α（TNF-α），以及促血管生成因子，从而促进肿瘤的生长和扩散。

而淋巴细胞则具有抗肿瘤的作用，可以通过识别和杀伤恶性细胞来抑制肿瘤的发展。

因此，NLR的增加意味着机体炎症反应的增强，同时也意味着免疫系统的抑制。

实验研究显示，肝癌患者的NLR值明显升高，与晚期疾病、淋巴结转移、肿瘤大小、血管侵犯和生存率等相关。

因此，NLR在原发性肝癌的早期诊断和预后评估中具有潜在价值。

PLR是指血小板与淋巴细胞的比值，也是一种炎症指标。

血小板在肝癌生长和转移中发挥重要作用。

当肿瘤生长时，癌细胞会释放血小板活化因子，引发血小板的聚集和释放促癌物质。

这些物质不仅可以促进肿瘤生长，还可以抑制淋巴细胞的活性。

因此，PLR的升高也意味着肝癌病情的恶化。

研究发现，PLR与原发性肝癌的肿瘤大小、肝脏功能受损、淋巴结转移和预后有关。

除了NLR和PLR，也有研究探讨了它们与肝癌相关临床特点的关系。

研究发现，NLR和PLR与肝癌的血清肿瘤标志物如甲胎蛋白（AFP）和转铁蛋白（FT）的水平呈正相关。

在抗肿瘤治疗中，NLR和PLR的变化也与疗效相关。

研究发现，在TACE（经肝动脉化疗栓塞术）治疗后，NLR和PLR的下降与肿瘤缩小和生存率改善有关。

这些研究提示NLR和PLR可以作为评估肝癌治疗效果和预后的标志物。

尽管目前的研究显示了NLR和PLR与原发性肝癌的关联，但仍然有许多问题需要进一步研究。

首先，NLR和PLR的确切机制尚不清楚，在肝癌发生和进展中的作用有待深入探索。

凋亡相关基因在肝癌发生发展中的作用及临床应用

凋亡相关基因在肝癌发生发展中的作用及临床应用肝癌是世界上常见的恶性肿瘤之一，其发病率逐年上升。

肝癌的病因复杂，其中凋亡相关基因在肝癌的发生发展中扮演着重要的角色。

在本文中，我们将探讨凋亡相关基因在肝癌中的作用，以及其在临床上的应用。

1. 凋亡相关基因的概念凋亡是一种重要的细胞死亡方式，其通过一系列紧密联系的信号通路来实现。

凋亡相关基因是调控凋亡的关键基因，其负责向细胞传递死亡信号，促进或抑制细胞的凋亡。

凋亡相关基因通常分为两类：促进性基因和抑制性基因。

促进性基因包括Bax、P53、Fas等，它们通过不同途径作用于细胞，从而产生信号，引发细胞凋亡。

抑制性基因包括Bcl2、Bcl-xL等，对细胞凋亡起到抑制的作用。

2. 凋亡相关基因在肝癌中的作用研究表明，凋亡相关基因在肝癌的发生和发展中扮演着重要的角色。

促进性基因Bax在肝癌中表达增加，而抑制性基因Bcl2则表达下降。

这表明Bax/Bcl2比值的增加可能是肝癌生长和转移的重要原因。

另外，P53也被证实在肝癌中起着重要作用。

P53是一个转录因子，其通过调节多种基因的表达来抑制肿瘤的生长和转移。

研究表明，大约一半的肝癌患者P53基因突变，导致P53功能受损，从而促进肝癌的发生和发展。

3. 凋亡相关基因在肝癌治疗中的应用基于对凋亡相关基因的研究，一些新的治疗方法正在发展中。

例如，Bcl2抑制剂和P53基因治疗等，这些新型治疗方法在临床研究中显示出了很多前景。

Bcl2抑制剂是通过抑制抑制性基因Bcl2的表达来促进肿瘤细胞凋亡的一类药物。

已有的研究表明，Bcl2抑制剂在多种癌症治疗中取得了一定的成果，包括肝癌。

在肝癌中，Bcl2抑制剂能够促进肝癌细胞的凋亡和组织损伤，从而有效地抑制肝癌的生长和转移。

P53基因治疗则是通过注入人工修复的P53基因来恢复P53功能，增强对肝癌的抵抗力。

已有的研究表明，P53基因治疗能够有效地抑制肝癌的生长和转移。

4. 结论综上所述，凋亡相关基因在肝癌的发生和发展中发挥着重要的作用。

ARHI 基因在胰腺癌细胞中的抑癌作用及其机制研究

ARHI 基因在胰腺癌细胞中的抑癌作用及其机制研究路新卿;张文娴;李校天;翟建文;沈香荣;刘志军【摘要】Objective To observe the effects of aplysia ras homolog I (ARHI)gene on pancreatic cancer cell (PANC-1 and MiaPaCa-2 )proliferation and to study the inhibition mechanism on the cancer cell growth.Methods PANC-1 and MiaPaCa-2 cell lines were transfected with the ARHI constructs or with an empty plasmid as a control using lipofectmine 2000,and ARHI or vector stable transfected cell line was established by G418 selection.ARHI protein expression was analyzed by western blot method respectively.The growth curve was used to determine the effect of ARHI on the proliferation of stable transfected cellline.Western blot was used to examine the expression of protein T-AKT,p-AKT.Results The ARHI stable transfected pancreatic cancer cells produced obvious expression of ARHI protein,but failed to induce detectable ARHI expression in empty plasmid transfected cells.The stable transfected pancreatic cancer cells all revealed a trend of increase with time prolonged in the non-transfected group,the empty plasmid transfected group and ARHI group,but pancreatic cancer cells grew most slowly in ARHI group.Statistical difference existed among these groups(P < 0.05 or<0.01).The level of phosphorylated AKT in ARHI transfectants was found down-regulated when compared with vector controls in the regulation of PI3K/AKT signaling pathway.Conclusion ARHI inhibited the growth of pancreatic cancer cell.ARHI expression blocked the activation of PI3K/AKTsignaling in pancreatic cancer cells and may play an important role in the pancreatic carcinogenesis.%目的：观察 ARHI 基因对人胰腺癌细胞株（PANC-1和 MiaPaCa-2细胞株）生长的影响，探讨其抑制细胞生长的作用机制。

NLRP36在anisomycin抗肝细胞肝癌中的作用及其机制

NLRP3/6在anisomycin抗肝细胞肝癌中的作用及其机制背景与目的:anisomycin是一种能够抑制肽链延伸,阻滞蛋白合成的细菌源性小分子抗生素。

文献报道和本课题组之前的研究均证实anisomycin体外能够抑制多种肿瘤细胞生长,诱导细胞凋亡,但其作用机制尚未明了,也未见anisomycin对肝脏肿瘤生物学行为的影响与机制的报道。

肝细胞肝癌(Hepatocellular carcinoma,HCC)是一种常见的恶性肿瘤,具有病情发展快、恶性度高和生存期短等特点。

由于失代偿性肝硬化通常伴随着HCC 的发生,临床上缺乏高效、低毒和靶向治疗的药物。

炎症与肿瘤的发生、发展和转移密切相关,炎症小体信号在调控固有炎症性免疫应答与细胞死亡中发挥至关重要的作用。

因此,探明HCC发生和发展的生物学机制以及干预路径,寻找有效的药物靶点具有极其重要的科学意义。

本研究试图探明炎症小体NLRP3(NOD-like receptor family pyrin domain containing 3)和NLRP6(NOD-like receptor family pyrin domain containing 6)在anisomycin抗HCC中的作用及其机制,以期为临床治疗HCC提供新的策略和理论支持。

方法:(1)anisomycin体外处理人源肝脏肿瘤细胞Hep3B及鼠源肝脏肿瘤细胞Hepa1-6,以人源正常肝脏细胞LO-2作为对照,检测anisomycin对这些细胞增殖、凋亡、粘附及迁移等生物学行为的影响;利用Western Blot检测NLRP3炎症小体和Wnt通路中关键分子的表达水平,ELISA检测细胞上清中炎症性细胞因子IL-1β和IL-18的分泌量,确定anisomycin对Wnt信号通路的影响以及与NLRP3炎症小体活性变化的关系;收集肝脏肿瘤病人临床样本,通过IHC、Western Blot和qPCR测定NLRP3在肿瘤组织与癌旁组织之间的差异表达,进一步明确其与肝脏肿瘤发生的关系;通过热漂移检测(Thermal drift detection,TSA)and)和表面等离子共振(Surface plasma resonance,SPR)技术确定anisomycin在HCC 细胞膜上直接作用的分子;利用免疫共沉淀(Co-Immunoprecipitation,Co-IP)与荧光能量共振转移(Fluorescence resonance energy transfer,FRET)确定关键分子过氧化物酶体增殖激活受体δ(Peroxisome proliferation activated receptors,PPARδ)、热休克蛋白90(Heat shock protein,HSP90)及NLRP3之间的相互作用关系,并通过相应的分子激动剂和抑制剂的干预以明确各分子间的上下游调控关系;最后建立小鼠荷瘤模型以确认anisomycin在体内抗肝脏肿瘤的效果,苏木素-伊红染色观察anisomycin体内注射60 d后小鼠重要生命脏器心、肝、脾和肾组织的病理学变化,并检测小鼠血清中ALT、AST、BUN和TNF-α的水平。

肝细胞肝癌中p15基因产物的表达及其意义

肝细胞肝癌中p15基因产物的表达及其意义王英;崔忠;李开宗;李玉松;秦亚东;王文勇;王剑波【期刊名称】《中国普通外科杂志》【年(卷),期】2004(13)7【摘要】用免疫组织化学方法 (SABC法 )检测p15基因在 5 3例肝细胞肝癌(HCC )标本中的表达。

p15基因阳性表达率为 64 .2 % ( 3 4/5 3 )。

病理I ,II级p15阳性率明显高于III级 (均为P <0 .0 5 ) ;临床分期T1 ,T2 期p15阳性率均明显高于T3期 (均为P <0 .0 5 )与T4 期 (均为P <0 .0 1)。

提示p15基因的异常表达在HCC的发生、发展中可能起重要作用 ;p15基因表达可以作为病程、预后判断的候选检测指标 ,对HCC的基因治疗有潜在的价值和意义。

【总页数】3页(P540-542)【关键词】肝细胞癌;病理学;肝肿瘤;病理学;基因P15【作者】王英;崔忠;李开宗;李玉松;秦亚东;王文勇;王剑波【作者单位】解放军第四六七医院外一科;解放军白求恩国际和平医院肝胆外科;第四军医大学【正文语种】中文【中图分类】R735.7;R730.261【相关文献】1.肝细胞肝癌中p15、p16基因表达的关系 [J], 王英;李开宗;李玉松2.肝细胞肝癌中p15,p16基因表达的关系 [J],3.皮肤血管瘤组织中p15基因产物表达及意义 [J], 李华;王育斌;张端莲;陕声国;余瑛;杨勇4.肝细胞肝癌中p15和hsp70基因表达的关系及意义 [J], 王英;崔忠;李开宗;王红娟;李玉松;王文勇5.宫颈癌组织中p16和p15基因产物表达及其生物学意义 [J], 李霞因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。