心肌组织裂解液诱导骨髓间充质干细胞向心肌样细胞分化的研究

心肌组织裂解液诱导骨髓间充质干细胞向心肌样细胞分化的研究
目的探讨心肌组织裂解液定向诱导骨髓间充质干细胞（BMSCs）分化为心肌样细胞的可行性。

方法体外分离、培养及鉴定大鼠BMSCs，实验分为3组：空白对照组、正常心肌组织裂解液诱导组和梗死心肌组织裂解液诱导组。

分别对第3代BMSCs进行定向诱导，倒置相差显微镜观察诱导后细胞形态变化。

诱导4周后，Westem-blot检测心肌肌钙蛋白T（cTnT）、心肌连接蛋白43（cx43）的表达。

结果P3代BMSCs CD34染色呈阴性，而CD105、CD106染色呈阳性。

两个诱导组cTnT、Cx43蛋白表达量均高于空白对照组，且梗死心肌裂解液诱导组的蛋白表达量高于正常心肌组织裂解液诱导组，差异有统计学意义（P＜0.05）。

结论正常心肌组织裂解液及梗死心肌组织裂解液均可诱导BMSCs分化为心肌样细胞，且梗死心肌组织裂解液组诱导分化效率更高。

标签：骨髓间充质干细胞；心肌组织裂解液；心肌样细胞
冠状动脉粥样硬化性心脏病是我国心血管患者住院的首要原因，发病率逐年上升。

心肌梗死是冠心病患者的严重表现形式，梗死部位的心肌细胞被瘢痕组织所替代，导致不同程度的心室重构，心梗后患者往往存在不同程度的心脏功能不全，逐渐进展演变为心力衰竭；若抢救不及时甚至可能危及生命，其病理基础为心肌坏死。

成体心肌细胞属于终末分化细胞，不能通过自身的再生对损伤后的心肌细胞进行修复，细胞移植是目前治疗心肌梗死等心血管疾病的重要手段，治疗后患者心功能得以改善。

BMSCs具有向神经细胞、脂肪细胞及心肌细胞等多种类型细胞分化的潜能，BMSCs是细胞移植治疗心肌损伤最有前景的种子细胞之一。

诱导BMSCs分化为心肌细胞是干细胞工程研究领域的热点问题。

目前诱导分化的主要方法为：①化学诱导法。

采用试剂为5一氮杂胞苷及TGF-B1、BMP-2、Wntl1等细胞因子；②心肌微环境诱导法。

细胞共培养法最为常见；相对于化学诱导法这种方法具有无细胞毒副作用，且定向诱导特异性较高的特点，更适于临床应用。

本实验应用正常心肌裂解液和梗死心肌裂解液对BMSCs做体外诱导，使其定向分化为心肌样细胞，并从形态学、蛋白表达的层次观察并鉴定诱导分化的有效性，探索体外BMSCs诱导分化为心肌样细胞的新方法及条件，为细胞移植治疗心肌损伤的临床应用奠定基础。

1.材料与方法
1.1实验动物及主要试剂
健康雄性2月龄SD大鼠，体重（150±13）g（大理大学实验动物中心提供），DMEM/F12培养基，胎牛血清（hyclone公司，USA），辣根过氧化物酶标记的IgG抗体（GENE公司），兔抗鼠CD34、CDl05、CDl06抗体（福州迈新公司），DAB显色液、BCA蛋白测定试剂盒（福州迈新公司），山羊抗鼠的单克隆一抗cTnT，山羊抗鼠单克隆一抗Cx43（美国SantaCruz公司），FITC标记的兔抗山羊IgG抗体（武汉博士德）。

1.2.1心肌梗死模型制备
雄性SD大鼠，12%乌拉坦1 ml/100g腹腔注射麻醉，左胸第4肋间逐层切开胸腔及心包，于肺动脉圆锥与左心耳下缘之间游离并结扎左冠状动脉前降支，术后观察15 min，左前壁变苍白、心肌收缩力减弱、ECG示ST段抬高0.2 mv 为造模成功的指标，逐层关闭胸腔，术后存活大于6 h者作为心肌梗死模型。

1.2.2心肌组织裂解液制备
脱颈处死大鼠，分别取梗死区域及周围正常部位心肌组织，剪碎为 1 mm3左右的组织块，组织均浆机中破碎10 min，加入DMEM/F12培养液制备成20 mg/mL的组织均浆液，2500 rpm离心5 min，吸取上清后用0.22岬的滤器过滤备用。

诱导分化实验中使用的梗死及正常心肌组织裂解液的蛋白浓度均为0.05 mg/mL。

1.3 BMSCs的分离培养及鑒定
0.38%NH4C1红细胞溶解法联合贴壁培养法分离培养鼠BMSCs，接种于含DMEM/F12完全培养基的75 cm2培养瓶，37℃、5%C02的培养箱中培养，培养后第2天首次半量换液，以后视细胞生长情况2～3天换液1次，0.25%的胰酶消化传代，取第3代BMSCs行CD34、CD105、CD106免疫细胞化学染色鉴定培养细胞表面抗原表达。

1.4体外诱导BMSCs向心肌样细胞转化
取生长良好的P3 BMSCs制成3×105/mL的细胞悬液，滴加30uL于25 mm2于6孔板上，置于37℃培养箱中继续培养。

4～6 h后待细胞贴壁，将6孔板内细胞分成3组：①空白对照组，细胞仅含15%胎牛血清的DMEM/F12完全培养基中培养。

②正常心肌裂解液组：完全培养基中加入正常心肌组织裂解液100 uL；
③梗死心肌裂解液组：完全培养基中加入梗死心肌组织裂解液100uL。

1.5 Westem-blot检测cTnT、Cx43表达
制备10%聚丙烯酰胺分离胶，三组样品上样量均为50ug，聚丙烯酰胺凝胶电泳，上层胶恒压80 v，30 min，下层胶恒压100 v，80 min，电泳结束后，恒流250 mA湿转1 h。

转膜完毕后，将PVDF膜置于5%脱脂奶粉中封闭1 h，加入1：500的山羊抗鼠的单克隆一抗cTnT，1：1000的山羊抗鼠单克隆一抗Cx43，4℃孵育过夜。

PBS洗涤3次，10 min/次，然后将PVDF膜加入1：300的兔抗山羊IgG，室温孵育2 h后，PBS洗涤3次，5 min/次，ECL化学发光试剂在化学发光仪下显色。

实验重复3次，使用Quantity one软件进行灰度分析，结果用目的蛋白与B-actin的比值表示。

2.1诱导细胞形态学改变加入诱导液的第2天细胞变短变钝，第5天大部分细胞由长梭形变成短杆状，呈端端相连，紧密连接的“竹节样”改变，同时连续诱导第10天多个区域出现大量多核肌管结构，第12天融合多核肌管均出现自律性搏动。

2.2 BMSCs免疫细胞化学染色鉴定
P3代细胞呈现骨髓间充质干细胞特征性的形态和生长方式，并进行了CD34、CD105和CD106免疫细胞化学染色分析，P3代细胞的CD34染色均呈阴性反应，而CD105、CD106染色阳性细胞>98%以上。

见图1、图2。

2.3 Western blot检测结果
诱导4周后梗死心肌裂解液组蛋白表达量高于其他两组，组间比较，差异有统计学意义（P＜0.05），且正常心肌裂解液组蛋白表达量高于空白对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）。

见图3。

3.讨论
骨髓间充质干细胞表面抗原具有多样性，表达CD44、CD105、CD106等多種粘附因子，是鉴别骨髓间充质干细胞的表面抗原，但不表达CD34、CD45、CD29等造血干细胞特有的表面标志物。

我们通过免疫细胞化学染色的方法检测P3代细胞CD34、CD105、CD106的表达，发现CD34（-）、CDl05（+）、CD106（+）结果可初步证明所培养的细胞为BMSCs。

干细胞巢是指干细胞在体内所处的微环境，巢中调控干细胞增值及分化的外部信号组成了干细胞赖以生存的微环境。

干细胞处于分化还是静息状态、向哪种类型的组织细胞分化均由干细胞自身的功能状态及其所处的微环境所决定。

微环境指的是干细胞周围的细胞和细胞外基质，它与干细胞的增殖、迁移、分化有着密切的联系。

有学者认为在不同的微环境中干细胞能向不同类型的组织细胞分化，即“环境依赖性分化”的特性。

微环境中各种细胞因子对干细胞向何种细胞分化有着决定性作用。

我们的实验在体外培养的条件下加入正常心肌裂解液及梗死心肌组织裂解液，从而改变干细胞所处的微环境，对所培养的BMSCs进行诱导，结果证明诱导后的细胞能出现心肌样细胞的形态改变。

目前对体外微环境诱导BMSCs向心肌样细胞分化的具体机制并不明确。

Filipczyk等认为其机制可能有分泌性细胞因子及蛋白的调节作用、细胞外BMSCs的调控作用、细胞间直接作用参与干细胞生长分化的调控等。

心肌肌钙蛋白是心肌源性特异性标志物，由cTnI、cTnC、cTnT三个亚单位组成，在心肌的舒缩活动中起重要作用。

其中以cTnT亚单位的特异性最高，连接蛋白43（Cx43）是心肌细胞闰盘缝隙连接的主要结构蛋白，本实验通过Westera blot检测在两个诱导组细胞内均发现cTnT（+）表达、Cx43（+）表达，结果表
明心肌组织裂解液可诱导BMSCs向心肌样细胞分化，同时诱导后的细胞具备闰盘的结构，能够进行同步收缩。

综上所述，本实验证明了正常心肌组织裂解液及梗死心肌组织裂解液体外诱导骨髓间充质干细胞向心肌样细胞分化的可行性，且梗死心肌裂解液的诱导分化效率更高，结果将为下一步的临床种子细胞的选择打下了基础。