柱前衍生化高效液相色谱法分析当归多糖的单糖组成
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1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮 ( PM P) 柱前衍生化 H PLC 测定单糖含量的方法经过了不断地发展和完 善 [ 3~ 7] , 并成功地用于毛细管电泳分析。 PMP 是还原性糖的最好衍生化试剂之一, 如 PM P 衍生物不易 裂解, 分析时不产生异构峰, 且在 250 nm 处有强烈的紫外吸收。本研究采用 PMP 衍生化方法, 用常规 的紫外检测器和 C18烷基键合柱, 建立适于当归多糖单糖组成测定的 HPLC 新方法, 达到灵敏、快速、准 确、方便和可在线大批量分析的目标。
精确称取当归多糖样品 20. 0 m g于安瓿中, 分别加入 2 m ol /L TFA、2 m o l/L H 2SO4 以及其混酸溶液 2. 0 mL, 充氮气封管, 110e 油浴分别水解 2、4、6、8和 10 h。冷却至室温, 反应混合物 1000 r/m in离心 5 m in, 取上清液用 0. 3 m ol /L NaOH 溶液中和到约 pH 7. 0, 溶液用于 PMP 衍生化。 2. 3 单糖衍生物的制备
3. 4 当归多糖样品的单糖组成分析 3. 4. 1 多糖水解时间对分析结果的影响 考察了 TFA 的不同水 解时间对当归多糖的组成测定结果的影响, 结果如图 3所示。当 归多糖随水解时间的延长, 测定的单糖摩尔比率增加, 而在 110e 用 2 mm ol /L TFA 水解 8 h 后, 水解 已完全。可见, 当归多 糖经 TFA水解 8 h为其合适的水解时间。 3. 4. 2 不同酸水解对当归多糖的单糖组成测定的影响 选择用 于水解多糖的合适种类的酸对准确测定单糖组成非常重要。本
( 北京化学试剂厂 ) ; 葡萄糖 ( G lc) 、阿拉伯糖 ( A ra) 、甘露糖 ( M an) 、半乳糖 ( Gal)、鼠李糖 ( Rha )、木糖 ( Xyl)、岩藻糖 ( Fuc) 、葡萄糖醛酸 ( G lcUA) 、半乳糖醛酸 ( Ga lUA ) 均购自 S igm a 公司。其它试剂均为分 析纯。当归多糖由本药理学教研室制备 [ 8 ] 。 2. 2 当归多糖水解
经传统的干燥过程和未经干燥过程的 PM P 柱前衍生化 H PLC 图, 图中未发现有明显吸收峰改变。 ( 3) 对多糖的含量、组成等定量分析更有意义, 因此过程几乎无糖损失, 多糖水解液可直接进行 PM P 衍生 化, 可来自百度文库线大批量分析监测。
第 9期
杨兴斌等: 柱前衍生化高效液相色谱法分析当归多糖的单糖组成
采用 Ag ilent 1100 色谱系统。检测波长为 250 nm。柱温为室温; 流速 1. 0 mL /m in; 流动相: 溶剂 A, 15% ( V /V ) 乙腈 + 0. 05 m o l/L 磷酸缓冲液 ( KH 2PO4-NaOH, pH 6. 9) 。溶剂 B, 40% ( V /V ) 乙腈 + 0. 05 m o l/L 磷酸缓冲液 ( KH 2PO4-N aOH, pH 6. 9) ; 梯度模式: 时间梯度为: 0→ 10→ 30 m in, 相应浓度梯度为 0→ 8% → 20% 溶剂 B; 进样体积 20 LL。 2. 5 分析原理与方法 2. 5. 1 定量校正因子 以 Fuc为内标, 测定 8种单糖的定量较正因子 ( f i/ s ) 。精密称取各标准单糖并 配制成 2 mm o l/L 的母液, 用时稀释为 5个不同浓度的单糖溶液, 制备 PMP 衍生物, 并进行 H PLC 分析 ( 线性范围在 1~ 10 nm o l之间 ) 。 2. 5. 2 相关系数与回归方程 以单糖的浓度 X (W i /W s ) 与峰面积 Y (A i /A s )作图, 得回归方程与相关系 数。求出各单糖的斜率 b, 即定量较正因子 f。 f i/ s = ( W i /W s ) / ( A i /A s ) , A S, A i分别为 Fuc内标和标准单 糖的 H PLC 峰面积。 2. 5. 3 摩尔比的计算 以 Fuc为内标, 得到各单糖的峰面积与内标的峰面积比, 乘以 f /M (M 为单糖的 分子量 ) , 所得的值之比为摩尔比, 即: R i/s = f i/ s ( A i /A s ) /M。
图 1 当归 多糖水解样品经干燥过程 ( a) 和无干燥过程 ( b)对单糖组成测定结果的影响 F ig. 1 T he chrom a tog ram of A ngelica polysaccha ride hydrolysa tes w ith dry ing ( a ) and w ithout dry ing process ( b)
关键词 当归多糖, 单糖组成, 衍 生化, 高效液相色谱
1引 言
当归多糖是当归的主要水溶性成分。药理学研究表明 [ 1, 2] , 当归多糖具有免疫调节、促进造血、抗 氧化损伤等显著生物活性。而多糖的单糖组成测定是控制多糖质量标准和提供多糖基本信息的最重要 环节。因单糖存在互变异构体、差向异构体、结构相似等特征, 而且往往同一待测样品, 如多糖、寡糖、糖 肽、糖蛋白等, 可能含有许多类型的单糖。所以, 单糖分析有其自身的特点, 必须具有高效的分离技术, 方可实现系列单糖的有效分离。
2004-08-14收稿; 2005-02-12 接受 本文系陕西省科技攻关项目 ( N o 2002K 10-G 2) 和西安市科技攻关项目 ( N o SF200224)
12 88
分析化学
第 33卷
离心, 用细针头吸弃下层, 重复 3次。上层为水相, 加 100 LL 水稀释, 混匀, 20 LL 进样。 2. 4 HPLC 分析方法
色谱峰的各峰保留时间依次为 PMP、M an、Rha、G lcUA、GalUA、G lc、Gal、Xy l、A ra、Fuc、异亚丙基丙酮 ( M esity l ox ide) 杂质峰 [ 7] , 如图 4( a) 所示。其中, 内标 Fuc与其它单糖有很好的分离, 其作为内标是合 适的。 PMP 衍生化试剂不干扰单糖衍生物的分析, 因为其出峰时间最快; 而 M esity l ox ide杂质峰也不影 响分析结果, 因为其出峰很慢, 远远滞后于各单糖衍生物的紫外吸收峰 [ 7] 。 3. 2 多糖水解样品制备条件优化
多糖水解样品的制备通常要经复杂的干燥过程, 方可进行下一步的衍生化。本样品制备方法省略 干燥过程, 而将多糖水解液直接用 NaOH 中和 (约中性 ), 中和溶液直接可进行 PM P衍生化, 这对于发展 多糖的定性定量在线分析技术有重要的实际意义。该制备方法的特点是: ( 1) 简化工艺、避免干燥损 失。 ( 2) 该多糖水解样品制备过程对多糖的组成测定无影响。图 1是当归多糖经 TFA 水解后, 水解液
研究考察了常用的 TFA、H2 SO 4 及其混酸等不同酸水解方法对当 归多糖的组成测定结果的影响 ( 图 4) 。结果表明, TFA 和 H 2SO4 对当归多糖的水解效果无明显影响, 但 TFA 和 H 2 SO4 混酸水解 该多糖时, 单糖测定结果有一定的变化, 其原因尚不清楚。所以, 本实验选用 TFA水解 8 h为当归多糖的合适水解时间。 3. 4. 3 当归多糖的单糖组成测定结果 由 H PLC 分析和摩尔比 计算结果可知, 当归多糖由 M an、Rha、G lcUA、G alUA、G lc、Gal、A ra 7种单糖组成, 摩尔比为 0. 57B1. 00B0. 13B3. 06B8. 16B7. 17B12. 7。各 单糖测定的精密度 ( RSD, n = 3) 均低于 4. 5% , 测定结果重复性 良好。
3 结果与讨论
3. 1 单糖对照品 PM P衍生物的 HPLC 分离 为实现当归多糖各组成单糖的高效分离, 本实验对当归多糖可能包含的 G lc、A ra、M an、G al、Rha、
Xyl、G lcUA、GalUA 及内标 Fuc等 9种标准单糖 PMP 衍生物的高效液相色谱分离条件进行了优化。结 果表明, 磷 酸缓 冲液 ( KH2 PO4-N aOH ) 的 pH 6. 9, 时 间梯 度 为 0→ 10→ 30 m in 和 相 应浓 度 梯度 为 0→ 8% → 20% 溶剂 B的梯度洗脱模式是分离此 9种单糖衍生物的较理想色谱分离条件。
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3. 3 多糖水解样品 PMP 衍生化工艺优化 已报道的单糖 PMP 衍生化方法是将衍生化后的溶液用氯仿萃取, 萃取后的水层溶液进行干燥, 其
目的是挥弃 PM P残留衍生化试剂, 纯化单糖衍生物样品。我们的实验结果表明, 在本色谱分离条件下, PM P溶剂峰出峰时间明显超前于单糖衍生物峰, 所以单糖 PM P 衍生物的干燥过程对分析结果无影响 ( 图 2) , 故本实验省去此干燥过程, 缩短了样品制备时间, 便于批量在线分析。
图 3 当归 多糖 经 TFA 水 解的 时 间对 各组成单糖的测定影响
F ig. 3 The e ffects of com ponent m onosacchar ides o f A ngelica polysaccha rides fo r different trifluoacetic ac id ( T FA ) hydro lysis tim e 1. 葡萄糖醛酸 ( glu cu ron ic acid) ; 2. 甘露糖 ( m annose) ; 3. 鼠李糖 ( rhamn ose); 4. 半乳糖 醛酸 ( ga laduron ic acid ) ; 5. 半 乳 糖 ( galactose); 6. 葡 萄 糖 ( g lucose) ; 7. 阿 拉 伯 糖 ( arabonose) 。
2 实验部分
2. 1 仪器和试剂 Ag ilent 1100 液相色谱仪 (美国惠普公司 ) ; ZORBAX EXTEND-C18分析柱 ( 美国 Ag ilent公司 ) ; 旋转
蒸发仪 ( 瑞士 BUCH I公司 ) ; EZ-DRY 冷冻干燥机 ( 美国 F ilter公司 )。 三氟乙酸 ( TFA, M erck公司 ) ; 甲醇 ( 色谱纯, 天津市科密欧化学试剂 ) ; 乙腈 ( TEDIA 公司 ) ; PMP
(第四军医大学药理学教研室 1, 化学教研室 2, 西安 710032)
摘 要 采用 1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮 ( PM P)柱前衍 生化反相高效液相色谱 (H PLC )法, 建立 了 9种常见单 糖的分离模式, 并成功地用于当归多糖的单糖组成分析, 具有良好的重复性。结果表明, 当 归多糖由 甘露糖、 鼠李糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸 、葡萄糖、半乳糖及阿拉伯糖 7种单糖组成, 其摩尔比为 0. 57B1. 00B0. 13B 31 06B8. 16B7. 17B12. 69。该 H PLC 方法是简单、快速、灵敏、方便的分 析技术, 可用于当归多糖的质量控制。
PM P在使用前用色谱纯甲醇重结晶两次。衍生化方法参考文献 [ 3~ 7] , 并作适当的改进: 取配制 好的 2 mm ol /L 单糖标准品 ( 9种 ) 各 50 LL 或当归多糖水解液样品各 100 LL, 并分别加入一定量的 Fuc 内标, 置于不同的试管中; 依次加入 50 LL 0. 5 m o l/L 的 PMP 甲醇溶液和 0. 3 m o l/L N aOH 溶液, 混匀; 70e 水浴反应 30 m in, 取出, 冷却 10 m in, 用 50 LL 0. 3 m o l/L H C l中和; 加入 1 mL 氯仿萃取, 充分震荡、
图 2 单糖对照品 PM P 衍生物的干燥过程 ( a)和无 干燥过程 ( b)对分析结果的影响 F ig. 2 The chrom atogram of 1-pheny -l 3-m ethy -l 5-py ra zolon ( PM P ) de rivatives o f standard m ono sacchar ides w ith dry ing process ( a) and w itout dry ing pro cess ( b)
第 33卷 2005年 9月
分析化学 ( FENX I HUAXUE ) 研究简报 Ch inese Journal o fA na ly tica l Chem istry
第 9期 1287~ 1290
柱前衍生化高效液相色谱法分析当归多糖的单糖组成
杨兴斌 1 赵 燕 2 周四元 1 刘 莉 1 王海芳1 梅其炳* 1
精确称取当归多糖样品 20. 0 m g于安瓿中, 分别加入 2 m ol /L TFA、2 m o l/L H 2SO4 以及其混酸溶液 2. 0 mL, 充氮气封管, 110e 油浴分别水解 2、4、6、8和 10 h。冷却至室温, 反应混合物 1000 r/m in离心 5 m in, 取上清液用 0. 3 m ol /L NaOH 溶液中和到约 pH 7. 0, 溶液用于 PMP 衍生化。 2. 3 单糖衍生物的制备
3. 4 当归多糖样品的单糖组成分析 3. 4. 1 多糖水解时间对分析结果的影响 考察了 TFA 的不同水 解时间对当归多糖的组成测定结果的影响, 结果如图 3所示。当 归多糖随水解时间的延长, 测定的单糖摩尔比率增加, 而在 110e 用 2 mm ol /L TFA 水解 8 h 后, 水解 已完全。可见, 当归多 糖经 TFA水解 8 h为其合适的水解时间。 3. 4. 2 不同酸水解对当归多糖的单糖组成测定的影响 选择用 于水解多糖的合适种类的酸对准确测定单糖组成非常重要。本
( 北京化学试剂厂 ) ; 葡萄糖 ( G lc) 、阿拉伯糖 ( A ra) 、甘露糖 ( M an) 、半乳糖 ( Gal)、鼠李糖 ( Rha )、木糖 ( Xyl)、岩藻糖 ( Fuc) 、葡萄糖醛酸 ( G lcUA) 、半乳糖醛酸 ( Ga lUA ) 均购自 S igm a 公司。其它试剂均为分 析纯。当归多糖由本药理学教研室制备 [ 8 ] 。 2. 2 当归多糖水解
经传统的干燥过程和未经干燥过程的 PM P 柱前衍生化 H PLC 图, 图中未发现有明显吸收峰改变。 ( 3) 对多糖的含量、组成等定量分析更有意义, 因此过程几乎无糖损失, 多糖水解液可直接进行 PM P 衍生 化, 可来自百度文库线大批量分析监测。
第 9期
杨兴斌等: 柱前衍生化高效液相色谱法分析当归多糖的单糖组成
采用 Ag ilent 1100 色谱系统。检测波长为 250 nm。柱温为室温; 流速 1. 0 mL /m in; 流动相: 溶剂 A, 15% ( V /V ) 乙腈 + 0. 05 m o l/L 磷酸缓冲液 ( KH 2PO4-NaOH, pH 6. 9) 。溶剂 B, 40% ( V /V ) 乙腈 + 0. 05 m o l/L 磷酸缓冲液 ( KH 2PO4-N aOH, pH 6. 9) ; 梯度模式: 时间梯度为: 0→ 10→ 30 m in, 相应浓度梯度为 0→ 8% → 20% 溶剂 B; 进样体积 20 LL。 2. 5 分析原理与方法 2. 5. 1 定量校正因子 以 Fuc为内标, 测定 8种单糖的定量较正因子 ( f i/ s ) 。精密称取各标准单糖并 配制成 2 mm o l/L 的母液, 用时稀释为 5个不同浓度的单糖溶液, 制备 PMP 衍生物, 并进行 H PLC 分析 ( 线性范围在 1~ 10 nm o l之间 ) 。 2. 5. 2 相关系数与回归方程 以单糖的浓度 X (W i /W s ) 与峰面积 Y (A i /A s )作图, 得回归方程与相关系 数。求出各单糖的斜率 b, 即定量较正因子 f。 f i/ s = ( W i /W s ) / ( A i /A s ) , A S, A i分别为 Fuc内标和标准单 糖的 H PLC 峰面积。 2. 5. 3 摩尔比的计算 以 Fuc为内标, 得到各单糖的峰面积与内标的峰面积比, 乘以 f /M (M 为单糖的 分子量 ) , 所得的值之比为摩尔比, 即: R i/s = f i/ s ( A i /A s ) /M。
图 1 当归 多糖水解样品经干燥过程 ( a) 和无干燥过程 ( b)对单糖组成测定结果的影响 F ig. 1 T he chrom a tog ram of A ngelica polysaccha ride hydrolysa tes w ith dry ing ( a ) and w ithout dry ing process ( b)
关键词 当归多糖, 单糖组成, 衍 生化, 高效液相色谱
1引 言
当归多糖是当归的主要水溶性成分。药理学研究表明 [ 1, 2] , 当归多糖具有免疫调节、促进造血、抗 氧化损伤等显著生物活性。而多糖的单糖组成测定是控制多糖质量标准和提供多糖基本信息的最重要 环节。因单糖存在互变异构体、差向异构体、结构相似等特征, 而且往往同一待测样品, 如多糖、寡糖、糖 肽、糖蛋白等, 可能含有许多类型的单糖。所以, 单糖分析有其自身的特点, 必须具有高效的分离技术, 方可实现系列单糖的有效分离。
2004-08-14收稿; 2005-02-12 接受 本文系陕西省科技攻关项目 ( N o 2002K 10-G 2) 和西安市科技攻关项目 ( N o SF200224)
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分析化学
第 33卷
离心, 用细针头吸弃下层, 重复 3次。上层为水相, 加 100 LL 水稀释, 混匀, 20 LL 进样。 2. 4 HPLC 分析方法
色谱峰的各峰保留时间依次为 PMP、M an、Rha、G lcUA、GalUA、G lc、Gal、Xy l、A ra、Fuc、异亚丙基丙酮 ( M esity l ox ide) 杂质峰 [ 7] , 如图 4( a) 所示。其中, 内标 Fuc与其它单糖有很好的分离, 其作为内标是合 适的。 PMP 衍生化试剂不干扰单糖衍生物的分析, 因为其出峰时间最快; 而 M esity l ox ide杂质峰也不影 响分析结果, 因为其出峰很慢, 远远滞后于各单糖衍生物的紫外吸收峰 [ 7] 。 3. 2 多糖水解样品制备条件优化
多糖水解样品的制备通常要经复杂的干燥过程, 方可进行下一步的衍生化。本样品制备方法省略 干燥过程, 而将多糖水解液直接用 NaOH 中和 (约中性 ), 中和溶液直接可进行 PM P衍生化, 这对于发展 多糖的定性定量在线分析技术有重要的实际意义。该制备方法的特点是: ( 1) 简化工艺、避免干燥损 失。 ( 2) 该多糖水解样品制备过程对多糖的组成测定无影响。图 1是当归多糖经 TFA 水解后, 水解液
研究考察了常用的 TFA、H2 SO 4 及其混酸等不同酸水解方法对当 归多糖的组成测定结果的影响 ( 图 4) 。结果表明, TFA 和 H 2SO4 对当归多糖的水解效果无明显影响, 但 TFA 和 H 2 SO4 混酸水解 该多糖时, 单糖测定结果有一定的变化, 其原因尚不清楚。所以, 本实验选用 TFA水解 8 h为当归多糖的合适水解时间。 3. 4. 3 当归多糖的单糖组成测定结果 由 H PLC 分析和摩尔比 计算结果可知, 当归多糖由 M an、Rha、G lcUA、G alUA、G lc、Gal、A ra 7种单糖组成, 摩尔比为 0. 57B1. 00B0. 13B3. 06B8. 16B7. 17B12. 7。各 单糖测定的精密度 ( RSD, n = 3) 均低于 4. 5% , 测定结果重复性 良好。
3 结果与讨论
3. 1 单糖对照品 PM P衍生物的 HPLC 分离 为实现当归多糖各组成单糖的高效分离, 本实验对当归多糖可能包含的 G lc、A ra、M an、G al、Rha、
Xyl、G lcUA、GalUA 及内标 Fuc等 9种标准单糖 PMP 衍生物的高效液相色谱分离条件进行了优化。结 果表明, 磷 酸缓 冲液 ( KH2 PO4-N aOH ) 的 pH 6. 9, 时 间梯 度 为 0→ 10→ 30 m in 和 相 应浓 度 梯度 为 0→ 8% → 20% 溶剂 B的梯度洗脱模式是分离此 9种单糖衍生物的较理想色谱分离条件。
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3. 3 多糖水解样品 PMP 衍生化工艺优化 已报道的单糖 PMP 衍生化方法是将衍生化后的溶液用氯仿萃取, 萃取后的水层溶液进行干燥, 其
目的是挥弃 PM P残留衍生化试剂, 纯化单糖衍生物样品。我们的实验结果表明, 在本色谱分离条件下, PM P溶剂峰出峰时间明显超前于单糖衍生物峰, 所以单糖 PM P 衍生物的干燥过程对分析结果无影响 ( 图 2) , 故本实验省去此干燥过程, 缩短了样品制备时间, 便于批量在线分析。
图 3 当归 多糖 经 TFA 水 解的 时 间对 各组成单糖的测定影响
F ig. 3 The e ffects of com ponent m onosacchar ides o f A ngelica polysaccha rides fo r different trifluoacetic ac id ( T FA ) hydro lysis tim e 1. 葡萄糖醛酸 ( glu cu ron ic acid) ; 2. 甘露糖 ( m annose) ; 3. 鼠李糖 ( rhamn ose); 4. 半乳糖 醛酸 ( ga laduron ic acid ) ; 5. 半 乳 糖 ( galactose); 6. 葡 萄 糖 ( g lucose) ; 7. 阿 拉 伯 糖 ( arabonose) 。
2 实验部分
2. 1 仪器和试剂 Ag ilent 1100 液相色谱仪 (美国惠普公司 ) ; ZORBAX EXTEND-C18分析柱 ( 美国 Ag ilent公司 ) ; 旋转
蒸发仪 ( 瑞士 BUCH I公司 ) ; EZ-DRY 冷冻干燥机 ( 美国 F ilter公司 )。 三氟乙酸 ( TFA, M erck公司 ) ; 甲醇 ( 色谱纯, 天津市科密欧化学试剂 ) ; 乙腈 ( TEDIA 公司 ) ; PMP
(第四军医大学药理学教研室 1, 化学教研室 2, 西安 710032)
摘 要 采用 1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮 ( PM P)柱前衍 生化反相高效液相色谱 (H PLC )法, 建立 了 9种常见单 糖的分离模式, 并成功地用于当归多糖的单糖组成分析, 具有良好的重复性。结果表明, 当 归多糖由 甘露糖、 鼠李糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸 、葡萄糖、半乳糖及阿拉伯糖 7种单糖组成, 其摩尔比为 0. 57B1. 00B0. 13B 31 06B8. 16B7. 17B12. 69。该 H PLC 方法是简单、快速、灵敏、方便的分 析技术, 可用于当归多糖的质量控制。
PM P在使用前用色谱纯甲醇重结晶两次。衍生化方法参考文献 [ 3~ 7] , 并作适当的改进: 取配制 好的 2 mm ol /L 单糖标准品 ( 9种 ) 各 50 LL 或当归多糖水解液样品各 100 LL, 并分别加入一定量的 Fuc 内标, 置于不同的试管中; 依次加入 50 LL 0. 5 m o l/L 的 PMP 甲醇溶液和 0. 3 m o l/L N aOH 溶液, 混匀; 70e 水浴反应 30 m in, 取出, 冷却 10 m in, 用 50 LL 0. 3 m o l/L H C l中和; 加入 1 mL 氯仿萃取, 充分震荡、
图 2 单糖对照品 PM P 衍生物的干燥过程 ( a)和无 干燥过程 ( b)对分析结果的影响 F ig. 2 The chrom atogram of 1-pheny -l 3-m ethy -l 5-py ra zolon ( PM P ) de rivatives o f standard m ono sacchar ides w ith dry ing process ( a) and w itout dry ing pro cess ( b)
第 33卷 2005年 9月
分析化学 ( FENX I HUAXUE ) 研究简报 Ch inese Journal o fA na ly tica l Chem istry
第 9期 1287~ 1290
柱前衍生化高效液相色谱法分析当归多糖的单糖组成
杨兴斌 1 赵 燕 2 周四元 1 刘 莉 1 王海芳1 梅其炳* 1