柱前衍生化高效液相色谱法分析当归多糖的单糖组成
当归多糖的成分
当归多糖的分级制备及组成分析孙元琳1’2，申瑞玲3，蔡宝玉4，汤坚1(1．江南大学食品学院，江苏无锡214036；2．山西运城学院生命科学系，山西运城044000 3．山西农业大学动物科技学院，山西太谷030801；4．江南大学测试中心，江苏无锡214036)当归多糖经离子交换柱层析得到3个多糖组分：W-ASPl由葡萄糖及少量阿拉伯糖和半乳糖组成，为中性多糖；W—ASP2主要由半乳糖、阿拉伯糖、葡萄糖及GalA(35．38％)组成，为弱酸性W-ASP3主要含半乳糖、阿拉伯糖和鼠李糖，Gal含量最高(58．27％)，结合单糖组成分析确定是一种果胶类多糖．酸水解结合HPAEC-PAD测定当归多糖中的糖醛酸种类为半乳糖醛酸．对于糖醛酸含量较高的多糖样品，糖醛酸对苯酚一硫酸试剂虽然显色，但不能反映真实含量，所以苯酚一硫酸法测量结果并不能代表其总糖含量(低于真实含量)．通过苯酚一硫酸法绘制半乳糖醛酸的于扰标准曲线，以消除GalA干扰可测得多糖样品的中性糖含量，再结合GalA的含量从而能够真实反映样品的总糖含量．当归多糖XC-1的分离与结构研究陈汝贤徐桂云#* 王海燕许鸿章刘叶民#!（中国协和医科大学中国医学科学院医药生物技术研究所北京10005）（!中国科学院化学研究所分子科学中心北京100080）XC-1的单糖组成及糖苷键XC-经水解、乙酰化后的GC分析）表明，该多糖是由葡萄糖组成。
毛细管电泳分析未发现有酸性糖，其结果也表明只含有葡萄糖，与乙酰化GC"测定结果一致。
经甲基化-水解-还原-乙酰化-GC分析，从部分甲基部分乙酰基单糖衍生物的实际保留时间与标准的2,3,4,6-0-四甲基-1,5-0-二乙酰基葡萄糖醇乙酸酯的实际保留时间进行比较，得到的相对比较，并结合GC-MS联用技术测定结果，确定了单糖的部分甲基化部分乙酰化糖醇乙酸保留值再与文献［3］值乙酯的结构。
[3] Jansson P F,Kenne L,Liedgren H et ai. Chem. Commun’ 1976, 8(15):1~74当归多糖ASP3的甲基化分析孙元琳中瑞玲汤坚顾小红(1．运城学院生命科学系，运城044000；2．郑州轻工业学院食品与生物工程学院，郑州450002；3．江南大学食品科学与技术国家重点实验室，无锡214122)果胶多糖是当归多糖的主要组成部分[1]其化学组成和糖链结构都比较复杂．甲基化分析是测定多糖分子糖苷键连接方式的有效方法【5 】．对于含有糖醛酸的多糖，如植物果胶或其它酸性多糖，其甲基化分析难度较大．这是因为：(1)甲基化反应在碱性条件下进行，糖醛酸在此过程中易发生口-消去反应，使与之相连的中性糖产生降解；(2)糖醛酸在酸性条件下不易水解，因此直接甲基化会使糖醛酸以及与其相连的中性糖的信息丢失，影响甲基化分析结果的准确性．由此，本实验采用氘代试剂NaBD4将多糖样品中的GalA还原为相应的中性糖，同时用氘进行标记(6，6’-d2-Gal)以区别于样品中的相应中性糖(Gal)，再进行甲基化分析，克服了上述缺陷．【1】Sun Y., Tang J., Gu X. H., et al.. In T. J. Riol.. Macromol.[J],2005,36;283--289【2】Dell A.,Methods in Enzymoloy[J],1990,193;647—660.当归多糖X—C一3一ii的糖链组成及结构研究徐桂云1，刘叶民1 陈淑贤广西师范大学学报(自然科学版)JOURNAl，OF GUANGXI NORMAl，UNIVERSITYV ol 21 No．2 2003年10月(1中国科学院化学研究所分子科学中心，北京10080；2中国医学科学院医药生物技术研究所，北京100050)近年来，已有报道当归多糖有抗肿瘤及抗辐射损伤的作用【3】．为研究多糖复合物结构和活性的关系，我们采用选择性酸水解方法和应用Gc／Ms和NMR技术研究了当归多糖x—C 一3一Ⅱ糖链组成和结构，在当归中首次发现以果糖为主链的多糖．采用温和酸水解多糖x c 3Ⅱ，然后将单糖衍生为糖醇乙酸酯衍生物的气相色谱分析表明X_C_ 3一Ⅱ糖链中有60％是呋喃型果糖．在这个分析条件下也得到了阿拉伯糖，通过定量得到阿拉伯糖：果糖=1：9．采用剧烈酸水解多糖X—C一3一Ⅱ后的分析结果是阿拉伯糖；半乳糖：葡萄糖=1：l：4．在后一步水解条件下未出现甘露糖的峰可表明果糖已被完全破坏，不影响X-C一3一Ⅱ中葡萄糖的测定．从而确定多糖X-C-3-Ⅱ中单糖组成为阿拉伯糖：半乳糖：葡萄糖：果糖=1：1：4：9．为确定单糖连接点，我们对多糖X-C-3-Ⅱ进行了甲基化分析．相对于两种不同的水解条件，我们称其为甲基化分析条件I和Ⅱ．色谱定性是通过对标准品1，5-O一二乙酰基一2,3,4，6一O一四甲基葡萄糖醇酯的相对净保留时间与文献值[3]比较确定的，并经Gc／Ms验证．各种糖残基的摩尔比按E．C．r．理论根据色谱峰面积和响应因子计算．我们得到如下结论：(1)X—C一3一Ⅱ是高分支的多糖；(2)果糖和阿拉伯糖是呋喃型糖苷；半乳糖和葡萄糖是吡喃型糖苷．这些信息在NMR谱中也可得到证实[2]；(3)多糖X-C-3-Ⅱ的主链由一1)Fruf(2一和一6)GIc，(1一组成．这样我们可以看出x—C一3一Ⅱ由两部分组成：一部分以一1)Frur(2一为主链，非还原性端基是Frur(2一，在一6，1)Frut(2一处接有侧链；另一部分具有更加复杂的分支结构并以一6)Glc。
柱前衍生化-高效液相色谱法分析木糖结晶母液的单糖组成
柱前衍生化-高效液相色谱法分析木糖结晶母液的单糖组成孟海波;高绍丰;张海燕;孟汉卿【摘要】The reversed - phase high performance liquid chromatographic ( HPLC) method of pre-column - derivatization with l-phenyl-3-methyl-5-pyrazolone (PMP) was developed to separate the traditional eight monosaccharides and detect the monosac-charide composition of crystallization solution of xylose. The results showed that crystallization solution of xylose consisted of mannose, rharanose, cellobiose, glucose, galactose, xylose, arabinose, fucose, and the dominant component monosaccharides were glucose, ga-lactose, xylose and arabinose. Peak height was used to quantify. The concentration of eight kinds of monosaccharide was liner with correspond peak area with correlation coefficients (r2) of 0.9897 -0.9994. The detection limit was 0.002 1 -0.003 1 mg/mL. The recovery was 98.4% - 101.0% , and relative standard deviation of detection results was 0.66% -0.21 % (n = 6). The HPLC method is simple, rapid, sensitive, convenient and can be applied to the quality control of crytallization solution of xylose.%采用1-苯基-甲基-吡唑啉酮(PMP)柱前衍生化-反相高效液相色谱(HPLC)法建立了8种常见单糖的分离模式,并用于木糖结晶母液单糖组成的定量分析.结果表明:木糖结晶母液至少由甘露糖、鼠李糖、纤维二糖、葡萄糖、半乳糖、木糖、阿拉伯糖及岩藻糖8种单糖组成,其中以葡萄糖、半乳糖、木糖和阿拉伯糖为主.以峰高定量,8种单糖的浓度与相应的峰高呈良好的线性关系,相关系数r2在0.9897 -0.9994范围内,方法检出限为0.0021-0.0031 mg/mL,回收率为98.4% -101.0%,测定结果的相对标准偏差为0.66%-1.21%(n=6).该方法简单、快速、灵敏,可用于木糖结晶母液的质量控制.【期刊名称】《化学分析计量》【年(卷),期】2011(020)005【总页数】3页(P47-49)【关键词】木糖结晶母液;单糖组成;衍生化;高效液相色谱【作者】孟海波;高绍丰;张海燕;孟汉卿【作者单位】济南圣泉唐和唐生物科技有限公司,济南,250204;济南圣泉唐和唐生物科技有限公司,济南,250204;济南圣泉唐和唐生物科技有限公司,济南,250204;济南圣泉唐和唐生物科技有限公司,济南,250204【正文语种】中文木糖、阿拉伯糖作为一种良好的食品添加剂已被广泛应用于食品生产中。
氨基苯甲酸衍生化高效液相色谱法 分析多糖中的单糖及糖醛酸组成
或荧
试剂 进 行 衍 生 后 再 利 用 色 谱 方 法 分 离 和 检
测。目前， 用于 单 糖 衍 生 化 的 试 剂 很 多， 主 要 有 $! 苯基 !% ! 甲基 !" ! 吡唑 啉 酮 （ "#" ） 、 !， & ! 二 硝 基 苯、 对 甲氧基苯胺、 ! ! 氨基 吡 啶、 ’ ! 氨 基 喹 啉、 苯 甲 酸、 对氨
（ $ * 江南大学化学与材料工程学院，江苏 无锡 !$*".( ；! * 江南大学分析测试中心，江苏 无锡 !$*".( ； . * 中国药科大学生命科学与技术学院，江苏 南京 !$"""’ ） 衍生反相离子对 色 谱 法 同 时 分 离 检 测 多 糖 中 单 糖 及 糖 醛 酸 组 成 的 摘要： 建立了一种柱前对氨基苯甲酸 （ ! /6786 ） 方法， 筛选出适合于 ! /6786 糖衍生物分离的色谱柱， 考 察 了 流 动 相 组 成 对 ’ 种 单 糖 和 两 种 糖 醛 酸 的 ! /6786 衍 生化产物的保留值及分离的影响， 优化了反应温度和 反 应 时 间 等 衍 生 化 条 件， 并应用优化的分析方法测定了螺旋 藻中的单糖和糖醛酸的组成。采用紫外检测时， 方法的检出限为（ !/ %% & $./ * ）0 $" 1 # 0() 9 : ； 采 用 荧 光 检 测 时， 方 法的检出限为 （ ./ .+ & $#( ）0 $" 1 + 0() 9 : 。 关键词： 柱前衍生化； 高效液相色谱法； 对氨基苯甲酸； 单糖； 糖醛酸； 多糖 中图分类号： ;(%+- - 文献标识码： 6 - - 文章编号： $""" /+#$. （ !""# ） "$ /""#% /"%- - 栏目类别： 研究论文
当归多糖的结构研究进展
当归多糖的结构研究进展李卫燕;李萍;闫涵威;孙莉;曹蔚【摘要】目的：总结近年来各学者在当归多糖结构领域的研究成果，以期对后期的研究提供借鉴。
方法查阅以近10年来为主的相关文献，对其结构研究成果进行总结归纳。
结果文献中对当归总多糖、中性多糖和酸性多糖的重均相对分子质量、单糖组成及其比例、单糖连接位点等结构信息都有不同程度的研究。
结论文献中对当归总多糖和中性多糖的结构研究较为深入，但对当归酸性多糖的研究相对浅显。
%Objective To summarize the research results of polysaccharide structure from A ngelica sinensis ,and to provide reference for researchers .Methods Relative literatures reported within 10 years about the structure of polysaccharide from Angelicasinen‐sis were summarized .Results The average molecular weight ,monosaccharide composition and their molar ratio ,the sequence of glucopyranosyl residues of the total polysaccharides ,neutral and acidic polysaccharides were researched .Conclusion The studies on the total sugar and neutral polysaccharides were comprehensive ,but the structure of the acidic polysaccharide needs further study .【期刊名称】《西北药学杂志》【年(卷),期】2015(000)003【总页数】5页(P321-325)【关键词】当归;多糖;结构【作者】李卫燕;李萍;闫涵威;孙莉;曹蔚【作者单位】第四军医大学药学院天然药物学教研室，西安 710032;第四军医大学药学院天然药物学教研室，西安 710032;第四军医大学药学院天然药物学教研室，西安 710032;沈阳军区司令部门诊部，沈阳 110006;第四军医大学药学院天然药物学教研室，西安 710032【正文语种】中文【中图分类】R284(Oliv.) DielsKey words:Angelicasinensis; polysaccharide; structure*通信作者：曹蔚，女，副教授，硕士生导师当归始载于《神农本草经》，为伞形科植物当归Angelicasinensis (Oliv.)Diels 的干燥根。
一种确定油藏微生物耗氧量和耗氧速率的方法
［ ］ 王正平 ， ２ 马晓晶， 陈兴娟． 乳液 的制 备及应用 ［ ］ 化学工 程 微 Ｊ．
师 ， ０４，１１ ２ ６ ２０ ０ （ ）：ｌ一６ ． ２
［ ］ Ｐ ｔｃａＰ Ｆａ ｃｓ Ｂ， ａ ３ ａｒ ｉ ， ｒｎｅｃ Ｃ ｒ Ａ，ｅ １ ａ ｐｅｓ ｃ ｉｇｆｒｔｅ ｉ ｍｅ ｔ ．Ｓ ｍ ｌ ｔ ｋｎ ｈ ａ ａ ｏ
２０ ０． ２
的分 离 ， 到理想 的分离效 果 。 得
参 考 文 献
［ ］ 杨 兴斌 ， １ 赵燕 ，周 四元 ， 柱前衍生化 高效液相色谱法分 析 等． 当归多糖的单 糖 组 成 ［ ］ 分 析 化学 ，０ ５，３（ ： ８ Ｊ． ２ ０ ３ ９） １２７—
１ ９ ． ０ ２
可 以用 于其 他 类 似 物质 中硝 基 苯 类 物 质 的 检测 。
一
公 开 号 ：Ｎ ０ ５ ５３ Ｃ １ １７ ６４
种食 品 中牛磺酸 含量 的测 定方 法
公 开 日 ：０ ９ １ ． ４ ２０ ．１ ０
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公 开 号 ：Ｎ ０ ５ １２ Ｃ １ １７ ５２
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鱼体 中硝 基苯 类物质 的色谱检 测方 法
公 开 号 ：Ｎ ０ ５ ６４ Ｃ １ １７ ５ １ 公 开 日 ：０ ９ １ ． １ ２ ０ ． １ １
申请 人 ： 尼 测 试 科 技 （ 京 ） 限公 司 谱 北 有
热煮沸 ， 冷却后过滤 ， ０４ ｍ滤膜 ， 过 ．５ 注入液相色谱仪 。运
柱前衍生化高效液相色谱法分析多糖中的单糖组成
柱前衍生化高效液相色谱法分析多糖中的单糖组成马定远 陈 君 李 萍3胡卓逸(中国药科大学生药药用植物教研室,南京210038)(中国药科大学生化研究室,南京210009)摘 要 报道了多糖中单糖组成的柱前衍生化高效液相色谱测定方法。
采用反向高效液相色谱250nm 紫外检测和使用梯度洗脱,6种还原单糖的12苯基232甲基252吡唑啉酮衍生实现了良好的分离并具有良好的峰形。
对单糖组成的定量测定进行了方法学考察,建立了单糖组成分析的数据分析方法,并用所建立方法对一个多糖中的单糖组成进行了分析,获得良好的重复性。
关键词 单糖,多糖,衍生化,高效液相色谱 2001207204收稿;2002201209接受1 引 言单糖的组成分析是糖分析中的一项重要内容。
已有的糖组成分析方法以气相色谱法和高效液相色谱法为主。
由于单糖分子的多样性,关于糖的分析方法仍在不断发展。
12苯基232甲基252吡唑啉酮(PMP )衍生化方法自运用以来,得到不断完善1～3。
Strydom 运用此法对中性、酸性和碱性醛糖进行了分析,可以使15种单糖得到很好的分离2。
本文首先建立了6种常见单糖(包括一种酸性糖)的分离模式,通过内标法对3种中性单糖的定量进行了方法学考察,并应用所建立的方法对多糖中的单糖进行了组成分析,为此法的更好运用提供了依据。
2 实验部分2.1 仪器与试剂HP1100型高效液相色谱系统,包括G 1312A 二元泵,G 1315A DAD 检测器,HP ChemStation 色谱工作站(Hewlett 2Packard )。
衍生化试剂12苯基232甲基252吡唑啉酮(PMP ,上海化学试剂采购供应站试剂厂),甲醇重结晶两次。
色谱用乙睛(T edia )、三氟乙酸(CP 级,上海化学试剂公司)。
单糖对照品:葡萄糖(G lc ,上海化学试剂公司)、甘露糖(Man ,Sigma 公司)、半乳糖(G al ,Sigma 公司)、鼠李糖(Rham 公司)、葡萄糖醛酸(G lcUA )和木糖(Xyl )(上海化学试剂二厂产品)。
微波辅助提取_柱前衍生高效液相色谱法分析板蓝根多糖的单糖组成
收稿日期：2011-06-21；修订日期：2011-10-10作者简介：周威（1982-），男（汉族），湖北鄂州人，现为复旦大学药学院博士研究生，主要从事药物质量分析和药物代谢动力学研究工作．*通讯作者简介：段更利（1955-），男（汉族），上海人，现任复旦大学药学院教授，博士研究生导师，硕士学位，主要从事新药质量标准研究和体内方法学研究工作．微波辅助提取-柱前衍生高效液相色谱法分析板蓝根多糖的单糖组成周威1，张晓燕1，2，段更利1*（1．复旦大学药学院，上海201203；2．武汉大学基础医学院，湖北武汉430071）摘要：目的建立了一种微波辅助提取柱前衍生高效液相色谱法测定板蓝根多糖的单糖组成。
方法采用了微波辅助提取，PMP 柱前衍生单糖，Dikma －C 18色谱柱，流动相为乙腈－磷酸盐缓冲液，检测波长为250nm 。
结果L －鼠李糖，D －葡萄糖和D －半乳糖在0．156 62．5μg /ml 浓度范围内线性关系良好（r ＞0．9995），板蓝根多糖主要由D －葡萄糖、L －鼠李糖和D －半乳糖组成。
结论该方法简便、快速、准确，适用于分析测定板蓝根多糖的单糖组成。
关键词：板蓝根多糖；单糖；微波辅助提取；柱前衍生；高效液相色谱DOI 标识：doi ：10．3969/j．issn．1008-0805．2012．01．105中图分类号：R284．2文献标识码：B 文章编号：1008-0805（2012）01-0236-02板蓝根为十字花科植物菘蓝Isatis indigotica Fort 的干燥根，具有清热解毒、凉血利咽之功效［1］，是传统的抗病毒中药之一，临床上常用于抗病毒、抗菌。
据报道板蓝根多糖具有多种生物活性，是一种免疫增强剂［2 4］。
板蓝根多糖所含组分的相对分子质量差别较大，成分结构复杂等因素给板蓝根多糖的进一步开发利用造成困难。
水煎煮法作为板蓝根多糖的传统提取方法，表现出耗时、费力等不足。
(色谱)高效液相色谱法分析生漆多糖中的单糖组成
Xylos e 1. 59 2. 56 4. 12 98. 8 3. 93
0 0
G l ucuronic aci d / / / /
18. 22 16. 50 32. 70
3. 5 讨论 本文 采用氨 基色谱 柱, 漆 多糖中 的葡萄 糖醛酸
因在固定相 上产生吸附作用而不 出峰。而图 1-b 上
的峰 1 经实验证 明为葡 萄糖醛 酸内酯 的峰, 这是漆 多糖 在三氟乙酸 水解时, 葡萄 糖醛酸 极易发 生内酯 化[ 7, 8] 的缘故。湖北毛坝大木漆多糖中的鼠李糖含量
容至 1. 0mL 。( 2) 漆多糖完 全酸水解产物制备: 取漆 多 糖 50mg , 酸 处 理过 程同 ( 1) , 干 燥 后加 水 定 容至 1. 0mL 。
回收率测 定 准确 称取上 述标准单 糖配成
1. 0mL 溶 液, 依次量 取 0. 1, 0. 2, 0. 5mL 分别 加入 3
3. 4 回收率与定量分析 对 2. 3 项 所得 的样 品溶 液进 行回 收实 验, 单糖
加入量折 算成 0. 1mL 标准溶 液的单糖 量, 测 定结果 取平均值( 见表 2) 。
Damu Lacquer Polysaccharide( L PS) ( b)
不同 品种 和来源 的漆 多糖 中单糖 含量 ( 摩 尔百
份毛 坝大 木漆 多 糖样 品 50mg 中, 干 燥, 按“样 品配
制”方法处理后, 加水定容至 1. 0mL 。
样品测定 用
-B on dap akLeabharlann NHTM 2
色谱
柱
和示差
折光检测器 ( 25℃水浴 恒温) , 以乙腈 ∶水∶甲 醇( 70
∶25∶5, V / V ) 作流 动相, 流 速 1. 6mL / min, 进 样量
柱前衍生化高效液相色谱法分析9种多糖中的单糖组成
柱前衍生化高效液相色谱法分析9种多糖中的单糖组成王媛媛;张晖;杨俊松;宗智慧【摘要】Objective To establish a precolumnderivatization procedure with 1-phenyl-3-methyl-5-pyrazolone ( PMP )-high performance liquid chromatography ( HPLC ) method for the determination of the monosaccharide composition of nine polysaccharides.Methods The nine polysaccharides were hydrolyzed, derivatized by PMP and analyzed by HPLC with the Inertsil ODS-SP C18 column(260mm ×4.6mm,5μm).The mobile phase was the 20%triethylamine-buffer solution withKH2PO4(pH=6.9),and the flow rate was 1.0 ml/min.The UV absorbance was detected at a wavelength of 254 nm,and the injection volume was 10μl with the column temperature 30℃.Results The method was successful in the separation of the mixture monosac-charide standards.The calibration line of each monosaccharide had a good relationship.And the precision, stability and reproducibility were also good.The nine polysaccharides were composed of different monosac-charide and the contents had some difference.Conclusion The method was accurate and stable for the deter-mination of the monosaccharide composition and content of nine polysaccharides.%目的：建立1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮（ PMP）柱前衍生化-高效液相色谱法（ HPLC）对甘草多糖等9种多糖的单糖组成成分进行分析。
多糖的提取和分析方法
糖类是自然界中存在最多的有机化合物 ,也是重 提取率的同时 ,由于多糖不耐酸碱 ,因此会使部分多
要的生物高分子化合物和信息物质 。多糖 (polysac2 糖分解 ,也存在着一定的不足 。
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© 1994-2008 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved.
刘 婷等 多糖的提取和分析方法 20081Vol122 ,No . 3 化工时刊
第 22 卷第 3 期 2008 年 3 月
化工时刊
Che mical Industry
Time s
Vol. 22 ,No . 3 Mar. 3. 2008
多糖的提取和分析方法
刘 婷 周光明
(西南大学化学化工学院 ,重庆 400715)
摘 要 对近年来多糖的最新提取和分析方法 ,按不同方面分析的分类对多糖的一些分析检测技术进行了综述 ,并 对各种检测技术从方法 、操作等方面进行了优缺点比较 ,为多糖分析的进一步发展研究提供参考 。 关键词 多糖 提取 分析方法
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化工时刊 20081Vol122 ,No . 3 论文综述《Overview of The sise s》
颜军等[22]通过斑点分离度 ,清晰度 ,有无拖尾现 象及展层时间等方面 ,利用薄层色谱法快速分析了多 糖的单糖组成 ,通过实验确定了适合的展开剂为展开 系统 (乙酸乙脂∶吡啶∶无水乙醇∶水 = 8∶2∶1∶2) ,合适 的显色剂为苯胺 - 二苯胺磷酸显色剂 。
柱前衍生化高效液相色谱等度洗脱分析单糖的方法建立_徐瑾
柱前衍生化高效液相色谱等度洗脱分析单糖的方法建立徐瑾¹常州工程职业技术学院摘要以1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(PMP)为柱前衍生化试剂,建立了高效液相色谱等度洗脱分离分析5种单糖的方法。
采用简化的衍生化方法,在流动相:乙腈-醋酸盐缓冲液(0.1mol/L,p H=5.5,V/V=22B78)的色谱分离条件下,5种单糖衍生物可以达到基线分离,检测限分别为0.54~0.90ng,也对方法的线性范围、精密度、稳定性进行了系统的考察。
关键词单糖1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮衍生化高效液相色谱等度洗脱1.前言近年来,糖类物质在生物学领域的作用已越来越被重视,人们将研究的重点放在糖类物质的定量、定性以及结构分析上,并对此做了大量的研究。
因为糖的种类较多,且结构近似,所以无论对哪种糖进行分析,首先必须将分析的对象与其它糖分离开来。
另一方面糖类物质几乎没有光学活性,对分离后的物质进行直接光学检测比较困难,结合灵敏度、选择性等方面的问题,人们多采用通过化学标记将糖类物质转变为具有光学活性的物质,然后再进行分离分析的方法。
衍生方法与高效液相色谱(HPLC)结合使用不但能提高检测的灵敏度,而且可以改善分离特性。
迄今为止,文献报道的用于糖类物质衍生的紫外衍生试剂种类很多[1-3],它们都各有优缺点。
近年来出现的1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(PMP)是一种具有强紫外吸收的衍生试剂,Honda等[4]发现该试剂可以与还原性的糖在温和条件下反应,无需酸催化,不会引起脱甲硅基的作用,产物无立体异构体,在紫外245nm处有强烈的吸收。
该方法自应用以来,已得到了不断的完善[3-6]。
马定远等[7]在前人的基础上简化了其衍生化方法,建立了单糖组成分析的数据分析方法,并用所建立的方法对一个多糖中的单糖组成进行了分析,获得良好的重复性。
鉴于该物质的这些优点,本文采用它对单糖进行柱前衍生,结合HPLC技术,建立了5种常见单糖的等度洗脱分离模式,通过外标法对这5种单糖进行了定量研究。
柱前衍生化高效液相色谱法测定当归酸性多糖单糖组成的新方法
⑥
２ ０ １ ５ Ｓ ｃ ｉ ． Ｔ ｅ ｃ ｈ ． Ｅ ｎ ｇ ｒ ｇ ．
医药卫 生
柱 前衍 生化高效液 相色谱法测定 当归酸 性 多糖 单糖组成 的新 方法
李卫 燕 李 萍 曹 蔚
（ 第 四军 医大学药学 系天然药物学教研室 ， 西安 ７ １ ０ ０ ３ ２ ）
摘 要 首次建立柱前衍 生化 高效液相 色谱 法分 析 当归酸 性 多糖 中糖 醛酸 、 氨 基糖和 中性糖 的方 法。Ｄ － 甘露糖 、 Ｄ ・ 葡萄糖 胺、 Ｌ ． 鼠李 糖、 Ｄ ． 半乳糖胺 、 Ｄ ． 葡萄糖醛酸 、 Ｄ ． 半乳糖醛酸 、 Ｄ ． 葡萄糖、 Ｄ ． 半乳糖 、 Ｌ ． 阿拉伯 糖和 Ｄ ． 岩藻糖等 ｌ ０种单糖 经柱 前衍
乳糖 醛 酸 （ Ｇ ａ ｌ Ｕ Ａ） 、 Ｄ － 葡 萄糖 （ Ｇ ｌ ｕ ） 、 Ｄ 一 半 乳 糖 （ Ｇ ａ １ ） 、 Ｌ ． 阿拉伯糖 （ Ａ ｍ） 和Ｄ ． 岩藻糖 （ Ｆ ｕ ｃ ） 均购 自 Ｓ ｉ ｇ ｍ ａ 公司 ； 乙腈 和甲醇 （ 色谱纯 ） 购 自韩 国德山药
品公 司 。
生化法处理后作为标准 品。色谱条 件： Ｈ ｙ ｐ ｅ ｒ ｓ ｉ ｌ Ｂ Ｄ Ｓ Ｃ ８ 色谱 柱 （ ４ ． ６ ｍ ｉ ｌ ｌ ｉ ． ｄ ．×２ ５ ０ ｍｍ， ５ ｍ） ， 流动相 由 乙酸铵水 溶液（ １ ０ ０
ｍ ｍｏ ｌ ／ Ｌ ， ｐ Ｈ＝ ５ ． ０ ） 、 乙腈和 四氢 呋喃以 ８ １ ： １ ７ ： ２ 的体 积 比组成 ， 流 动相流速 １ ． ０ ｍ Ｌ ／ ｍｉ ｎ ， 检测 波长 ２ ５ ０ ａ ｍ， 柱温２ ５℃。 实验
１ ． ３ 当归 酸性 多糖 的提 取和 纯 化
将 当归药 材 粉碎 ， 称 ｌ ｋ ｇ 置 于圆底烧瓶 中， 加 入 ５倍 量 的 ９ ５％ 乙醇 回 流提 取三 次 ， 每次 ２ ｈ 。用 纱 布过 滤 ， 药渣 晾干 。 干燥 的药 渣 重 新 置 于 圆底 烧 瓶 中， 加人 ８倍 量 的 １ ． ０ ｍ ｏ ｌ ／ Ｌ的 Ｎ ａ Ｏ Ｈ溶液 ， 回流 提取 两次 ， 每次 １ ｈ 。提 取完 成 后 再 次 用纱 布过 滤 ， 收集 滤液 ， ４ ０ ０ ０ ｒ ／ ｍｉ ｎ离 心 １ ０ ｍ ｉ ｎ ， ５ ５ ｏ Ｃ用旋 转 蒸
柱前衍生化HPLC法分析沙参多糖中单糖组成
柱前衍⽣化HPLC法分析沙参多糖中单糖组成收稿⽇期:2008204225作者简介:任浩娜(19762),⼥(汉族),辽宁沈阳⼈,硕⼠研究⽣,E 2m a il renhaona76@163.co m;毕开顺(19562),男(汉族),河北唐⼭⼈,教授,主要从事中药分析和中药质量控制研究,T el .024*********。
⽂章编号:100622858(2009)0320206204柱前衍⽣化HPLC 法分析沙参多糖中单糖组成任浩娜,陈晓辉,毕开顺,张晖芬(沈阳药科⼤学药学院,辽宁沈阳110016)摘要:⽬的建⽴北沙参多糖中单糖的组成和含量的检测⽅法。
⽅法以三氟⼄酸⽔解沙参多糖,⽔解产物加⼊衍⽣化试剂12苯基232甲基252吡唑酮(P M P)⽣成衍⽣化产物,采⽤R P 2HPLC 法,⾊谱柱:C 18⾊谱柱(250mm @4.6mm,5L m ),流动相:体积分数为19%的⼄腈溶液2醋酸铵缓冲液(醋酸铵2冰醋酸,p H 5.5,体积⽐为100B 1),等度洗脱,流速:1.0mL #m i n -1,检测器:紫外检测器,检测波长:250n m,柱温:35e 。
结果沙参多糖由D 2⽢露糖、D 2⿏李糖、半乳糖醛酸、D 2葡萄糖、D 2半乳糖、L 2(+)2阿拉伯糖等8种单糖(有2种未鉴定出的单糖)组成。
D 2⽢露糖、D 2⿏李糖、半乳糖醛酸、D 2葡萄糖、D 2半乳糖、L 2(+)2阿拉伯糖的线性分别为4~80L m ol #L -1(r =0.9990)、12~240L mol #L -1(r =0.9990)、5.6~1.12@103L m ol #L -1(r =0.9994)、1.54@103~30.80@103L m ol #L -1(r =0.9990)、80.0~1.6@103L m ol #L -1(r =0.9990)、64.00~1.28@103L mol #L -1(r =0.9992);平均加样回收率分别为94.0%、88.5%、93.9%、95.9%、89.2%、90.8%。
当归多糖的成分及其生物学作用
当归多糖的成分及其生物学作用作者：李成军金香兰沈云虹作者单位：齐齐哈尔医学院机能实验室【摘要】当归被广泛应用在中药的复方和验方中，随着对中药的广泛开发和利用，当归的主要成分被分离、纯化并且进行相应的结构确定，当归多糖是当归中主要生物活性物质，采用水提、醇沉和离子交换树脂和凝胶树脂的综合利用，当归多糖已经被分离出来。
生物学和药理学研究显示当归多糖在抗肿瘤、肝损伤、免疫作用等方面具有明显的作用。
本文就当归多糖的成分和生物学功能和临床应用加以综述，同时提出了当归多糖的研究方向。
【关键词】当归多糖提取分离抗肿瘤生物学功能临床应用当归为伞形科(Umbrelliferae)植物当归（Angelica sinensis(Oliv)Diels）的根，当归入肝、心、脾经，药性甘、辛、温，具有补血活血、调经止痛、润燥滑肠等功效，为临床使用频率最高的中药之一，素有“十方九归”之称［1-2 ］。
随着现代分析方法和仪器在中医药领域的应用，多糖、苯酞类、萜类、芳香族化合物等多种成份从当归中被分离出来。
当归多糖是当归中的主要成分之一，近年来国内外对当归多糖的成分研究和药理学研究有了新的进展，发现其对机体免疫系统、造血系统的明显作用以及抗肿瘤、抗放射性损伤的良好疗效［3］。
现就其提取分离、成分、生物学功能和临床应用等方面的研究进展综述如下。
1 当归多糖的提取、分离当归粉碎，过40 目筛，用一定浓度的乙醇溶液在较高温度内热处理原料2~3 次，得预处理当归粉。
预处理当归粉于80℃热水提取，离心，合并上清液，用乙酸调pH为4~5左右，离心去除沉淀，上清液浓缩后加乙醇至一定体积，4℃静置过夜，过滤，沉淀依次用无水乙醇、丙酮和乙醚洗涤，得到当归多糖粗品。
将其加入一定量去离子水溶解，用不同的方法去除游离蛋白后，透析，冷冻干燥得到初步纯化多糖。
初步纯化的多糖经济自交换柱和凝胶色谱柱柱层析，依次用磷酸盐缓冲液、0～1mol/L NaCl 溶液梯度洗脱，控制一定的洗脱速度一般为1.5~2ml/min，每管4~5ml 分部收集，逐管检测多糖含量(苯酚硫酸法A490nm)和蛋白质含量(紫外A280nm)［4-5］。
单糖柱前PMP衍生HPLC测定方法探讨
单糖柱前PMP衍生HPLC测定方法探讨朱照武;庄洋;向春林;赵娜;李珊;向玲芳;莫开菊【摘要】This article discussed the impact of PMP pre-column derivation on monosaccharide derivatives from extraction pH and extraction times.Moreover, the influence of mobile phase on the HPLC chromato-graphic peaks also have been studied from the ratio of mobile phase, the pH of buffer and the concentra-tion of buffer.The resultsindicated:Neutralized the derivation liquid with HCl to pH7.0 could avoid the loss of derivatives products to the utmost.Extracting three times by chloroform could remove almost PMP and avoid the loss of derivatives.Reducing the ratio of organic phase or the pH of buffer could improve the seperation of peaks;the asymmetry factor of peaks could be maintained in the optimum range by increas-ing the concentration of buffer.%从PMP萃取酸度、萃取次数探讨了柱前PMP衍生方法对单糖-PMP衍生物的影响,并从流动相比例、缓冲液pH值、缓冲盐浓度三个方面对单糖柱前衍生HPLC的分离效果进行了优化研究.结果表明:单糖进行PMP衍生后,用HCl中和至pH为7.0,能最大限度避免单糖-PMP衍生产物的损失;使用三氯甲烷萃取PMP 三次时,能在除去PMP的情况下避免单糖-PMP衍生产物的损失;降低流动相中有机相的比例或提高缓冲液的pH值,有利于色谱峰分离度的提高;提高缓冲盐浓度,有利于保持色谱峰的对称性.【期刊名称】《湖北民族学院学报（自然科学版）》【年(卷),期】2015(033)003【总页数】5页(P337-341)【关键词】单糖;PMP衍生物;高效液相色谱;分离度;不对称因子【作者】朱照武;庄洋;向春林;赵娜;李珊;向玲芳;莫开菊【作者单位】湖北民族学院生物科学与技术学院,湖北恩施445000;生物资源保护与利用湖北省重点实验室(湖北民族学院) ,湖北恩施445000;湖北民族学院生物科学与技术学院,湖北恩施445000;生物资源保护与利用湖北省重点实验室(湖北民族学院) ,湖北恩施445000;湖北民族学院生物科学与技术学院,湖北恩施445000;生物资源保护与利用湖北省重点实验室(湖北民族学院) ,湖北恩施445000;生物资源保护与利用湖北省重点实验室(湖北民族学院) ,湖北恩施445000;湖北民族学院生物科学与技术学院,湖北恩施445000;生物资源保护与利用湖北省重点实验室(湖北民族学院) ,湖北恩施445000;湖北民族学院生物科学与技术学院,湖北恩施445000;生物资源保护与利用湖北省重点实验室(湖北民族学院) ,湖北恩施445000;湖北民族学院生物科学与技术学院,湖北恩施445000;生物资源保护与利用湖北省重点实验室(湖北民族学院) ,湖北恩施445000【正文语种】中文【中图分类】O657.72多糖类物质广泛存在于自然界中，近年来，我国对植物多糖展开了广泛的研究，植物多糖的药理活性是研究的重点［1－4］.多糖是由单糖通过糖苷键连接而成的，多糖的单糖组成作为一级结构的主要内容，自然成为研究多糖生物活性的基础［5］.糖类物质因不具有发色基团不能直接使用紫外和荧光检测而限制了分析手段的应用，自1989年Honda等［6－8］首次在弱碱性条件下成功实现PMP糖类衍生，使糖类被标记上紫外吸收基团，具有强烈的紫外吸收，糖类的分析方法就得到快速发展.其中，PMP柱前衍生化HPLC分析成为糖类分析的重要方法.杨兴斌等［9］建立了当归多糖单糖组成的PMP柱前衍生化HPLC方法，Lv等［10］利用PMP柱前衍生化HPLC法分析出绿茶多糖由甘露糖、木糖、阿拉伯糖等9种单糖组成.尽管PMP在糖类检测方面具有优越性，但是糖类－PMP衍生方法仍存在一定不足.有报道指出，PMP衍生产物易丢失1分子PMP，且PMP试剂的疏水性偏低，多次萃取难以完全去除，萃取过程也会引起部分样品的损失［11］.Castells［12］也报道过PMP萃取过程会导致衍生产物的损失.此外，戴军［13］对三氯甲烷萃取时溶液的酸度进行研究，发现溶液偏碱性时衍生产物在三氯甲烷中有一定的溶解度，会造成损失，这与Strydom［14］的研究结果一致；若萃取时溶液偏酸性，衍生产物不稳定，也会造成结果偏低.单糖种类繁多，许多植物多糖的单糖组成复杂，经常需要调整液相色谱条件使各种单糖衍生物的色谱峰达到完全分离.在色谱柱固定的条件下，色谱峰的分离效果很大程度取决于流动相，因此，了解流动相对色谱峰分离效果及峰形的影响有利于在不同条件下获得良好的单糖衍生物色谱图.本文从单糖的PMP衍生方法及衍生产物的HPLC分离两个方面进行探讨，为单糖柱前PMP衍生HPLC方法的优化提供一定的理论依据.1.1 材料与试剂D－甘露糖、D－半乳糖、L－鼠李糖、L－阿拉伯糖德国Dr.Ehrenstorfer公司；D－葡萄糖、L－岩藻糖美国sigma公司；1－苯基－3－甲基－5－吡唑啉酮（PMP）、D－葡萄糖醛酸、D－半乳糖醛酸国药集团化学试剂有限公司；甲醇、乙腈色谱纯美国TEDIA天地试剂公司；磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、氢氧化钠、盐酸、三氯甲烷均为国产分析纯国药集团化学试剂有限公司.1.2 仪器与设备P680 ALPG高效液相色谱仪，包括DAD－100检测器、TCC－100柱温箱和Chromeleon色谱工作站（戴安中国有限公司）；MS1 Minishaker漩涡混合器（德国IKA公司）；GZX－9140 MBE数显鼓风干燥箱（上海博迅实业有限公司医疗设备厂）；KQ5200B型超声波清洗器（昆山市超声仪器公司）.1.3 方法1.3.1 单糖的衍生分别配制一定浓度的甘露糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖及岩藻糖的单糖标准溶液和混合标准溶液.各标准溶液分别取50 μL置于5 mL的具塞试管中，各加50 μL 0.6mol／L的NaOH溶液，漩涡混匀；再加100μL0.5mol／L的PMP甲醇溶液，漩涡混匀，在70℃的烘箱中避光反应100min，取出避光放置10min冷却至室温，加一定量的0.3 mol／L 的HCL，加水至2 mL，再加2 mL的三氯甲烷，漩涡混匀，静置，弃去三氯甲烷相，如此萃取几次.将水相用0.45μm微孔膜过滤后供HPLC进行分析.1.3.2 高效液相色谱分析色谱条件：Agilent ZORBAX Eclipse XDB－C18色谱柱（250mm×4.6mm，5μm）；流动相：A液：0.1mol／L的pH6.7磷酸钾盐缓冲液，B液：乙腈；柱温：30℃；检测波长：250 nm；流速：1 mL／min；进样体积：20μL.1.3.3 萃取酸度对PMP衍生产物的影响衍生反应结束后，待混合标准液冷却至室温，分别加入80、90、100、110、120μL 0.3mol／L的盐酸，加水至2mL，同1.3.1法萃取、过0.45μm微孔膜后进行HPLC分析.1.3.4 萃取过程对PMP残留及衍生产物的影响样品按1.3.1衍生中和后，加入三氯甲烷，漩涡混匀10s间隔5s，重复3次后，静置，弃去三氯甲烷层，如此分别萃取1、2、3、4、5次.样品过0.45μm微孔膜后进行HPLC分析.1.3.5 流动相比例对单糖衍生物的分离度影响混合标准单糖溶液进行PMP衍生后，分别在流动相比例为A液∶B液＝80∶20、81∶19、82∶18、83∶17的条件下进行HPLC分析，比较色谱峰的分离度R．1.3.6 流动相pH值对单糖衍生物的分离度影响分别配制pH为6.5和6.7的0.1 mol／L的磷酸钾盐缓冲液为A液，以最佳流动相比例对单糖衍生物进行HPLC分析，比较色谱峰的分离度R．1.3.7 磷酸缓冲盐浓度对色谱峰对称性的影响分别配制浓度为0.01、0.05、0.1mol／L pH6.7的磷酸钾盐缓冲液作为流动相A液，在最佳流动相比例下，对葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖、岩藻糖四种单糖衍生物进行HPLC分析，比较色谱峰的不对称因子As．2.1 萃取酸度对PMP衍生产物的影响PMP衍生结束后，加入HCl中和，在中性条件下，利用三氯甲烷萃取出多余的PMP，保留单糖－PMP衍生产物.萃取时溶液环境偏酸或偏碱均会对单糖－PMP 衍生产物造成影响，如表1，若溶液偏碱性，则单糖－PMP衍生物的峰面积低于完全中和时的测定结果，若中和过度，溶液偏酸性，单糖－PMP衍生物的峰面积也低于完全中和时的测定结果.总之，萃取时溶液偏酸或偏碱均会影响试验结果，这与戴军［13］的研究一致.试验结果表明，萃取酸度对不同单糖衍生物的影响不同，对葡萄糖醛酸和半乳糖醛酸的PMP衍生产物的影响最大，对甘露糖和鼠李糖的PMP衍生物的影响最小.溶液呈中性时，八种单糖－PMP衍生物峰面积的总和最大.2.2 萃取过程对PMP残留的影响萃取时，若PMP萃取不彻底，HPLC图谱中PMP峰明显，影响图谱效果；若PMP萃取过度，可能会造成单糖－PMP衍生产物的损失.分别对混合标准品的衍生液萃取1、2、3、4、5次后的结果如图1和表2.三氯甲烷萃取一次时，溶液中单糖－PMP衍生产物的峰面积最大，但PMP残留严重，峰面积大于单糖－PMP衍生产物，当萃取次数达到3次时，PMP残留量较低，不影响图谱效果，萃取4次时图谱上已无明显PMP峰.但随着萃取次数的增加，单糖－PMP衍生物的含量却逐步降低，萃取5次时，单糖－PMP衍生物的含量出现明显下降.因此，综合考虑单糖－PMP衍生物的保留、PMP的去除以及萃取工作量，选择萃取3次较合适.2.3 流动相比例对单糖衍生物分离度的影响在实验条件下，8种单糖衍生物的保留顺序依次为甘露糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖、岩藻糖.四种流动相比例条件下，8种单糖衍生物的色谱峰分离效果如图2.由图2看出，pH6.7的缓冲液∶乙腈＝80∶20时，鼠李糖和葡萄糖醛酸衍生物的色谱峰完全重叠，且与半乳糖醛酸衍生物不能完全分离；随着缓冲液比例的提高，鼠李糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸衍生物色谱峰的分离度逐渐提高，当缓冲液比例提高到82%时，8种单糖衍生物达到完全分离；继续提高缓冲液比例至83%时，分离效果进一步改善.4种流动相比例下，各单糖衍生物色谱峰的分离度R如表3，提高缓冲液比例降低有机相比例时，色谱峰的分离度R提高，但保留时间延长，流动相比例为83∶17时，样品运行时间长达50 min.因此，选择刚好能使八种单糖衍生物完全分离的流动相比例，即pH6.7磷酸缓冲液∶乙腈＝82∶18.2.4 缓冲液pH值对单糖衍生物分离度的影响色谱柱使用一段时间后，柱效降低，流动相比例为pH6.7的磷酸缓冲液∶乙腈＝82∶18时，鼠李糖与半乳糖醛酸的分离度R下降，不能完全分离.在保持流动相比例不变的条件下，降低缓冲液pH，八种单糖衍生物的分离效果如图3.在本试验条件下，将磷酸缓冲液的pH从6.7降低到6.5，能显著改善鼠李糖和葡萄糖醛酸衍生物的分离效果，达到完全分离，但同时样品分离时间延长.两种pH条件下，八种单糖衍生物的分离度R如表4，pH6.5条件下各色谱峰的分离度R几乎均大于pH6.7.因此，降低磷酸缓冲液的pH，有助于提高色谱峰的分离效果.2.5 缓冲盐浓度对色谱峰的影响分别使用盐浓度为0.01、0.05、0.10mol／L的pH6.7磷酸钾盐缓冲液作为流动相A液，对葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖、岩藻糖四种单糖衍生物进行HPLC分析，比较不同缓冲盐浓度对色谱峰不对称因As的影响．结果如图4和表5，在实验范围内，缓冲盐浓度越高，不对称因子As越小，峰形越好.当盐浓度为0.01 mol／L 时，色谱峰的不对称因子As均高于1．4，明显拖尾；当盐浓度为0.05mol／L时，色谱峰的不对称因子As有所降低，色谱峰对称性提高；当盐浓度为0.10mol／L 时，色谱峰的不对称因子As在1．05～1．2之间，对称性较好．本文研究了单糖衍生方法的中和、萃取过程对单糖－PMP衍生物的影响以及流动相对HPLC色谱峰的影响，结果表明：1）衍生结束后使用HCl完全中和，可以避免单糖－PMP衍生产物的损失.可能是由于单糖－PMP衍生物含有碱性基团，易在碱性条件下随三氯甲烷萃取损失，而在酸性的环境中不稳定，其原因需进一步研究确认.2）使用三氯甲烷萃取PMP时，萃取多次可以显著降低PMP的残留，但在中性条件下萃取，仍然会造成单糖－PMP衍生产物的损失.选择萃取3次，能较好平衡PMP去除和衍生产物保留的关系.3）降低流动相中有机相的比例或降低缓冲液的pH值，均能提高单糖衍生物色谱峰的分离效果；提高缓冲盐浓度，能改善色谱峰的峰形，防止拖尾.使用磷酸缓冲液作为无机相时，为保持峰形对称，需要较高的盐浓度，而高浓度的盐溶液对液相色谱系统和色谱柱均不利，有研究表明使用低浓度的乙酸铵盐溶液也能得到对称性好的色谱峰［15－17］，因此，应考虑使用乙酸铵盐或寻找其他的缓冲体系替代磷酸缓冲盐.实验中样品不同浓度会影响色谱图响应值.【相关文献】［1］柳志宇.玛咖多糖提取及其单糖组成的研究［D］.北京：北京林业大学，2012.［2］唐策.黄连多糖的提取方法、单糖组成及其抑制α－葡萄糖苷酶活性研究［D］.成都：成都中医药大学，2013.［3］美合日阿依·伊萨克，马虎，周文婷，等.维药榅桲多糖抗血栓作用及其机制研究［J］.中国药理学通报，2015，31（2）：295－296.［4］李慧文，韩春姬，洪喜道，等.红参多糖对免疫抑制小鼠免疫功能的影响［J］.延边大学农学学报，2012，34（4）：330－333＋343.［5］王蓉，吴剑波.多糖生物活性的研究进展［J］.国外医药抗生素分册，2001，22（3）：97－100.［6］陈克克.地瓜儿多糖的单糖组成实验中两种流动相的比较研究［J］.陕西农业科学，2009，5（5）：41－45＋49.［7］Honda S，Akao E，Su－uzki S，et al.High－performance liquid chromatography of reducing carbohydrates as strongly uitraviolet－absorbing and electro⁃chemically sensitive 1－phenyl－3－methyl－5－pyrazolone derivatives［J］.Analytical Biochemistry，1989，180：351－357.［8］Honda S，Togashi K，Taga A.Unusual separation of l－phenyl－3－mehtyl－5－pyrazolone derivatives of aldoses by capillary zone electrophoresis［J］.J ChormatogrA，1997，791：307－311.［9］Honda S，Suuzki S，Taga A.Analysis of carbohydrates as l－phenyl－3－methyl－5－pyrazolone derivatives by capillary／microchip electrophoresis and capillary electrochromatography［J］.J.Pharm.Biomed.Anal.2003，30：1689－1714.［10］杨兴斌，赵燕，周四元，等.柱前衍生化高效液相色谱法分析当归多糖的单糖组成［J］.分析化学，2005，33（9）：1287－1290.［11］Lv Y，Yang XB，Zhao Y，et al.Separation and quantification of component monosaccharides of the tea polysaccharides from Gynostemma pentaphyl⁃lum by HPLC with indirect UV detection［J］.Food Chemistry，2009，112（3）：742－746.［12］张萍.1，3取代吡唑啉酮类试剂的合成及其用于糖类物质的衍生化和分析研究［D］.西安：西北大学，2011.［13］C.B.Castells，V.C.Arias，R.C.Castells.Precolumn derivatization of reducing carbohydrates with 4－（3－methyl－5－oxo－2－pyrazolin－1－yl）benzoic acid.Study of reaction，high－performance 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柱前衍生化一高效液相色谱法分析木糖结晶母液的单糖组成
可 以看 出， ８个 组 分 的 平 均 回 收 率 为 ９ ． ％ ～ ８４
５０ ． ｌ ０ ０
．
１ ． ５０
２ ． ００
２ ５０
１ ． ０１ ０％
表 ３ ８种 单 糖 组 分 的 回 收 率 （ ５ ｎ＝ ）
ｔ ａ ｉ ／ｒ ｎ
孟海波 ， ： 等 柱前衍生化 一高效液相 色谱法分 析木糖结 晶母液 的单糖组成
４ ７
柱前衍生化 一 高效液相色谱法分析木糖结晶母液的单糖组成
孟 海 波 高绍 丰 张 海 燕 孟 汉 卿
（ 济南圣泉唐和唐生物科技有限公 司 ， 济南 ２００ ５ ２４）
摘要
采 用 １苯基．． 一 ３ 甲基 －一 ５吡唑啉 酮（ ＭＰ 柱前衍 生化 一反相 高效 液相 色谱 （ Ｌ 法建立 了 ８种 常见单 糖 Ｐ ） ＨＰ Ｃ）
稀释 ， 匀 ， 混 然后 用 ０ ４ ｍ 水 性 滤 膜 过 滤 ，０ Ｌ ．５ １
进样 。
１４ 色谱 条件 ．
色 谱 柱 ：ｙ ｍｅｙＣ８ （ ． ｍ ×１０ｍ ５ Ｓｍ ｔ １柱 ４ ６ｍ ｒ ５ ｍ，
ｍ） 美 国 Ｗａ ｒ 公 司 ； ｉｎｘＵ ｔ Ｍａ ０ ０色谱 ， ｔｓ ｅ Ｄｏ ｅ ｌ ｔ ３ ０ ｉ ｅ
量 ， 单糖 的 浓度 与 相 应 的峰 高呈 良好 的 线 性 关 系 ， 关 系数 ｒ在 ０ ９ ９ ０ ９ ９ 范 围 内 ， 法检 出限 为 ０ ０ ２ｌ ８种 相 ． ８ ７～ ．９ ４ 方 ．０
柱前衍生-高效毛细管电泳法分析金樱子多糖中单糖组成
柱前衍生-高效毛细管电泳法分析金樱子多糖中单糖组成陈传平;吴剑峰;方士英;陈乃东【摘要】采用水提-醇沉法提取金樱子多糖,经DEAE离子交换柱层析分离得单一多糖;多糖酸解后经1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(PMP)柱前衍生化,以标准品单糖为对照,运用高效毛细管电泳(HPCE)法分析金樱子单一多糖的单糖组成.研究结果表明,所分离的金樱子单一多糖由木糖、葡萄糖、核糖、甘露糖、半乳糖及鼠李糖组成,其物质的含量比为25.97％、17.66％、11.45％、4.12％、36.36％和3.85％.【期刊名称】《黄山学院学报》【年(卷),期】2018(020)003【总页数】5页(P60-64)【关键词】金樱子;多糖;高效毛细管电泳;单糖【作者】陈传平;吴剑峰;方士英;陈乃东【作者单位】皖西卫生职业学院,安徽六安237005;皖西学院生物与制药工程学院,安徽六安237012;皖西卫生职业学院,安徽六安237005;皖西学院生物与制药工程学院,安徽六安237012;皖西卫生职业学院,安徽六安237005;皖西学院生物与制药工程学院,安徽六安237012【正文语种】中文【中图分类】R284.1金樱子（Rosa laevigata Michx）又称刺榆子、金壶瓶等，为蔷薇科常绿攀缘植物金樱子的果实，在我国南方地区分布广泛[1]。
作为传统中药，《本草纲目》记载金樱子“性酸、涩、平、无毒；主治脾泻下痢、止小便利、涩精气，久服，令人耐寒轻身，补血益精，有奇效”[2]。
现代药理研究表明金樱子多糖是其主要活性成分之一，具有免疫调节、降血脂、抗氧化、清除自由基及抗衰老等作用[3]。
多糖的活性与其一级结构及空间结构等因素有关，其单糖的组成是研究多糖的生物活性的基础[4]。
高效毛细管电泳（HPCE）是上世纪80年代后期发展起来的一种分析技术[5]，具有分离效率高、快速[6]、操作简便、可选择模式多及洁净无污染等特点[7]，被广泛应用于各种活性多糖的单糖组成分析。
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图 3 当归 多糖 经 TFA 水 解的 时 间对 各组成单糖的测定影响
F ig. 3 The e ffects of com ponent m onosacchar ides o f A ngelica polysaccha rides fo r different trifluoacetic ac id ( T FA ) hydro lysis tim e 1. 葡萄糖醛酸 ( glu cu ron ic acid) ; 2. 甘露糖 ( m annose) ; 3. 鼠李糖 ( rhamn ose); 4. 半乳糖 醛酸 ( ga laduron ic acid ) ; 5. 半 乳 糖 ( galactose); 6. 葡 萄 糖 ( g lucose) ; 7. 阿 拉 伯 糖 ( arabonose) 。
3 结果与讨论
3. 1 单糖对照品 PM P衍生物的 HPLC 分离 为实现当归多糖各组成单糖的高效分离, 本实验对当归多糖可能包含的 G lc、A ra、M an、G al、Rha、
Xyl、G lcUA、GalUA 及内标 Fuc等 9种标准单糖 PMP 衍生物的高效液相色谱分离条件进行了优化。结 果表明, 磷 酸缓 冲液 ( KH2 PO4-N aOH ) 的 pH 6. 9, 时 间梯 度 为 0→ 10→ 30 m in 和 相 应浓 度 梯度 为 0→ 8% → 20% 溶剂 B的梯度洗脱模式是分离此 9种单糖衍生物的较理想色谱分离条件。
1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮 ( PM P) 柱前衍生化 H PLC 测定单糖含量的方法经过了不断地发展和完 善 [ 3~ 7] , 并成功地用于毛细管电泳分析。 PMP 是还原性糖的最好衍生化试剂之一, 如 PM P 衍生物不易 裂解, 分析时不产生异构峰, 且在 250 nm 处有强烈的紫外吸收。本研究采用 PMP 衍生化方法, 用常规 的紫外检测器和 C18烷基键合柱, 建立适于当归多糖单糖组成测定的 HPLC 新方法, 达到灵敏、快速、准 确、方便和可在线大批量分析的目标。
(第四军医大学药理学教研室 1, 化学教研室 2, 西安 710032)
摘 要 采用 1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮 ( PM P)柱前衍 生化反相高效液相色谱 (H PLC )法, 建立 了 9种常见单 糖的分离模式, 并成功地用于当归多糖的单糖组成分析, 具有良好的重复性。结果表明, 当 归多糖由 甘露糖、 鼠李糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸 、葡萄糖、半乳糖及阿拉伯糖 7种单糖组成, 其摩尔比为 0. 57B1. 00B0. 13B 31 06B8. 16B7. 17B12. 69。该 H PLC 方法是简单、快速、灵敏、方便的分 析技术, 可用于当归多糖的质量控制。
关键词 当归多糖, 单糖组成, 衍 生化, 效液相色谱
1引 言
当归多糖是当归的主要水溶性成分。药理学研究表明 [ 1, 2] , 当归多糖具有免疫调节、促进造血、抗 氧化损伤等显著生物活性。而多糖的单糖组成测定是控制多糖质量标准和提供多糖基本信息的最重要 环节。因单糖存在互变异构体、差向异构体、结构相似等特征, 而且往往同一待测样品, 如多糖、寡糖、糖 肽、糖蛋白等, 可能含有许多类型的单糖。所以, 单糖分析有其自身的特点, 必须具有高效的分离技术, 方可实现系列单糖的有效分离。
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3. 3 多糖水解样品 PMP 衍生化工艺优化 已报道的单糖 PMP 衍生化方法是将衍生化后的溶液用氯仿萃取, 萃取后的水层溶液进行干燥, 其
目的是挥弃 PM P残留衍生化试剂, 纯化单糖衍生物样品。我们的实验结果表明, 在本色谱分离条件下, PM P溶剂峰出峰时间明显超前于单糖衍生物峰, 所以单糖 PM P 衍生物的干燥过程对分析结果无影响 ( 图 2) , 故本实验省去此干燥过程, 缩短了样品制备时间, 便于批量在线分析。
研究考察了常用的 TFA、H2 SO 4 及其混酸等不同酸水解方法对当 归多糖的组成测定结果的影响 ( 图 4) 。结果表明, TFA 和 H 2SO4 对当归多糖的水解效果无明显影响, 但 TFA 和 H 2 SO4 混酸水解 该多糖时, 单糖测定结果有一定的变化, 其原因尚不清楚。所以, 本实验选用 TFA水解 8 h为当归多糖的合适水解时间。 3. 4. 3 当归多糖的单糖组成测定结果 由 H PLC 分析和摩尔比 计算结果可知, 当归多糖由 M an、Rha、G lcUA、G alUA、G lc、Gal、A ra 7种单糖组成, 摩尔比为 0. 57B1. 00B0. 13B3. 06B8. 16B7. 17B12. 7。各 单糖测定的精密度 ( RSD, n = 3) 均低于 4. 5% , 测定结果重复性 良好。
图 1 当归 多糖水解样品经干燥过程 ( a) 和无干燥过程 ( b)对单糖组成测定结果的影响 F ig. 1 T he chrom a tog ram of A ngelica polysaccha ride hydrolysa tes w ith dry ing ( a ) and w ithout dry ing process ( b)
2004-08-14收稿; 2005-02-12 接受 本文系陕西省科技攻关项目 ( N o 2002K 10-G 2) 和西安市科技攻关项目 ( N o SF200224)
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分析化学
第 33卷
离心, 用细针头吸弃下层, 重复 3次。上层为水相, 加 100 LL 水稀释, 混匀, 20 LL 进样。 2. 4 HPLC 分析方法
图 2 单糖对照品 PM P 衍生物的干燥过程 ( a)和无 干燥过程 ( b)对分析结果的影响 F ig. 2 The chrom atogram of 1-pheny -l 3-m ethy -l 5-py ra zolon ( PM P ) de rivatives o f standard m ono sacchar ides w ith dry ing process ( a) and w itout dry ing pro cess ( b)
经传统的干燥过程和未经干燥过程的 PM P 柱前衍生化 H PLC 图, 图中未发现有明显吸收峰改变。 ( 3) 对多糖的含量、组成等定量分析更有意义, 因此过程几乎无糖损失, 多糖水解液可直接进行 PM P 衍生 化, 可在线大批量分析监测。
第 9期
杨兴斌等: 柱前衍生化高效液相色谱法分析当归多糖的单糖组成
第 33卷 2005年 9月
分析化学 ( FENX I HUAXUE ) 研究简报 Ch inese Journal o fA na ly tica l Chem istry
第 9期 1287~ 1290
柱前衍生化高效液相色谱法分析当归多糖的单糖组成
杨兴斌 1 赵 燕 2 周四元 1 刘 莉 1 王海芳1 梅其炳* 1
PM P在使用前用色谱纯甲醇重结晶两次。衍生化方法参考文献 [ 3~ 7] , 并作适当的改进: 取配制 好的 2 mm ol /L 单糖标准品 ( 9种 ) 各 50 LL 或当归多糖水解液样品各 100 LL, 并分别加入一定量的 Fuc 内标, 置于不同的试管中; 依次加入 50 LL 0. 5 m o l/L 的 PMP 甲醇溶液和 0. 3 m o l/L N aOH 溶液, 混匀; 70e 水浴反应 30 m in, 取出, 冷却 10 m in, 用 50 LL 0. 3 m o l/L H C l中和; 加入 1 mL 氯仿萃取, 充分震荡、
精确称取当归多糖样品 20. 0 m g于安瓿中, 分别加入 2 m ol /L TFA、2 m o l/L H 2SO4 以及其混酸溶液 2. 0 mL, 充氮气封管, 110e 油浴分别水解 2、4、6、8和 10 h。冷却至室温, 反应混合物 1000 r/m in离心 5 m in, 取上清液用 0. 3 m ol /L NaOH 溶液中和到约 pH 7. 0, 溶液用于 PMP 衍生化。 2. 3 单糖衍生物的制备
多糖水解样品的制备通常要经复杂的干燥过程, 方可进行下一步的衍生化。本样品制备方法省略 干燥过程, 而将多糖水解液直接用 NaOH 中和 (约中性 ), 中和溶液直接可进行 PM P衍生化, 这对于发展 多糖的定性定量在线分析技术有重要的实际意义。该制备方法的特点是: ( 1) 简化工艺、避免干燥损 失。 ( 2) 该多糖水解样品制备过程对多糖的组成测定无影响。图 1是当归多糖经 TFA 水解后, 水解液
采用 Ag ilent 1100 色谱系统。检测波长为 250 nm。柱温为室温; 流速 1. 0 mL /m in; 流动相: 溶剂 A, 15% ( V /V ) 乙腈 + 0. 05 m o l/L 磷酸缓冲液 ( KH 2PO4-NaOH, pH 6. 9) 。溶剂 B, 40% ( V /V ) 乙腈 + 0. 05 m o l/L 磷酸缓冲液 ( KH 2PO4-N aOH, pH 6. 9) ; 梯度模式: 时间梯度为: 0→ 10→ 30 m in, 相应浓度梯度为 0→ 8% → 20% 溶剂 B; 进样体积 20 LL。 2. 5 分析原理与方法 2. 5. 1 定量校正因子 以 Fuc为内标, 测定 8种单糖的定量较正因子 ( f i/ s ) 。精密称取各标准单糖并 配制成 2 mm o l/L 的母液, 用时稀释为 5个不同浓度的单糖溶液, 制备 PMP 衍生物, 并进行 H PLC 分析 ( 线性范围在 1~ 10 nm o l之间 ) 。 2. 5. 2 相关系数与回归方程 以单糖的浓度 X (W i /W s ) 与峰面积 Y (A i /A s )作图, 得回归方程与相关系 数。求出各单糖的斜率 b, 即定量较正因子 f。 f i/ s = ( W i /W s ) / ( A i /A s ) , A S, A i分别为 Fuc内标和标准单 糖的 H PLC 峰面积。 2. 5. 3 摩尔比的计算 以 Fuc为内标, 得到各单糖的峰面积与内标的峰面积比, 乘以 f /M (M 为单糖的 分子量 ) , 所得的值之比为摩尔比, 即: R i/s = f i/ s ( A i /A s ) /M。