菌种的使用和管理

法规要求
-Ch.P2015对菌种的要求
购置 应从认可的国内或国外菌种保藏机构获得标准菌株，也可使用与标准菌
株等效的可以溯源的商业派生菌株。
保藏 应采用适宜的方法保藏菌种，保证菌种的生物学特性稳定一致。
复苏、复壮或培养物的制备 应按供应商提供的说明书或按照验证的方法
进行。从国内或国外菌种保藏机构获得的标准菌株经过复活并在适宜的培养基中 生长后，即为标准储备菌株，标准储备菌株应进行纯度和特性确认。
菌种的保藏、传代
冷藏保藏法 2-8℃冰箱保藏，是一种短期、有效储藏方法。 工作菌悬液和稀释液均用此方法保藏，储藏时间需要进行相 关的验证，但必须符合法规要求。 保藏方式可以选择如下形式：肉汤、稀释液、斜面、平板、 冻干菌种。 肉汤---营养肉汤 、胨水等 ；穿刺--- 一般用于厌氧菌的保 藏； 斜面---营养琼脂 、改良马丁琼脂培养基； 分离平板--- 为了得到单颗菌落。
菌种使用和管理
马英英 陕西省食品药品检验所
2015年8月15日
1
主
菌种的相关术语与定义
要
法规要求
内
菌种的购买、接收、保藏、传代、
容
使用、废弃
生物实验室安全
菌种的相关术语与定义
标准菌株 从官方菌种保藏机构获得的并至少定义到属或种 水平的菌株，来源已知，性能稳定。定义为0代。 标准储备（存）菌株 标准菌株在实验室经过一次传代获得的 一套完全相同的独立菌株。 储备（存）菌株 从标准储备菌株 转接一代获得的培养物。
法规要求
● 标准储备菌株应定期传代，并做确认试验，包括活性、 纯度、典型生理生化反应等，并有记录。
● 每一支标准菌株都应以适当的标签,表示其名称、菌 种号、接种日期和所传代数。
● 记录中还应包括以下内容 -----从标准菌种到工作用菌种的代数； -----菌种生长的培养基及培养条件；
法规要求
-Ch.P2015对菌种的要求
CMCC
ATCC
菌种的相关术语与定义
工作菌株 由标准储备菌株、储备菌株或标准物质（经证明 或未经证明）转接一代获得的菌株。不超过5代。工作菌株 不应用来制作标准菌株、标准储存菌株或储存菌株。 商业派生菌株 对于从标准菌种保藏中心或其他有效的认证 的商业机构获得原包装的质控菌株，复苏和使用应按照制造 商提供的使用说明进行。
菌种的保藏、传代
低温冷冻保藏法 在低温下保藏，需要加入保护剂，例如甘油，可以减少
冷冻对菌种的伤害，一般在低于-30℃或-70℃冰箱内保藏，是 一种有效的长期储藏方法。储藏时间同样需要进行相关的验 证。如何验证？相应的分离板上是否具有典型形态，生化特 征是否典型，鉴别结果是否满足要求等。 冷冻干燥保藏法
菌种使用、废弃
•储备菌株制备-磁珠法
1.对需要保存的菌株进行必要的纯化，挑取生长旺盛时期 的菌落，在无菌条件下接入菌株保藏管中，通常需要接入 4～7环，对于苛养菌应多接一些。 2.拧上盖子，充分均匀摇晃。 3.用无菌吸管将溶液吸走，尽可能吸干。 4. 每个保存管大概能保存20～25株菌株。 5.马上放入冰箱中，温度越低越有利于保存，贮存接种的 冻存管在-70℃时保存时间最长。
菌种的使用、废弃
使用
程序建立 标准菌株复活 储备菌株制备 工作菌株制备 菌悬液制备 效期管理 销毁制度 台账和记录
菌种的使用、废弃
• 程序建立
依据法规要求和实验室实际情况建立一份标准化的流 程，覆盖菌种的整个生命周期的统一操作规程，至少包 括：
传代流程 保存方式 效期管理 代数控制 菌种特性、纯度的确认 菌种接收、使用、传代、销毁台账。
菌种验收：由专人接收、检查、填写相关台账。从菌种
保藏中心购买的原始菌种管是玻璃安瓿装的冻干菌，接收 同时应检查是否有随菌种附有的相关资料。接收菌种时应 检查安瓿的数量和名称，和每一支安瓿的完整性。在相应 的菌种接收记录上记上所有的关于菌种的信息。
菌种的购买、接收
接收标准菌种时，记录必须包括但不限于以下 信息：
菌种的使用、废弃
• 标准菌株的复活-真菌
打开后，吸取0.5-1ml的无菌水到菌种管，溶解后全 部加入含有5～6ml无菌水，适量的无菌水溶解后全部吸 出，20～25℃恢复2～12小时或更长时间，将溶解后的 菌液接种到合适的培养基上，在建议的温度进行培养。 霉菌一般接种几个SDA斜面上（一般用三角瓶，生长的 孢子较多）， 于20～25℃培养7～14天，用含有0.05％ Tween80氯化钠胨水冲洗到其他无菌试管中。
Staphylococcus aureus [CMCC（B）26 003]；[ATCC6538]
生孢梭菌
Clostridium sporogenes [CMCC（B）64 941]；[ATCC19404]
铜绿假单胞菌
Pseudomonas aeruginosa [CMCC（B）10 104]；[ATCC9027]
菌种的使用、废弃
• 储备菌株制备
霉菌：复壮后的孢子悬液，加入10%的无菌甘油混匀， 1～2ml/管封存于冻存管。根据需要制备储备管，按顺序 进行编号，最后一支做为质控管进行质量控制，即进行 相应的确认。其余作为储备管。将上述制备好的冻存管 逐支粘贴标签。内容包括：菌种名称、菌种代号、编号、 代次、制备日期、制备人、贮存条件、有效期至等。
NCIMB-----英国食品工业与海洋菌种保藏中心 NBRC-----日本技术评价研究所生物资源中心 CIP------法国巴斯德研究所菌种保藏中心
菌种的相关术语与定义-常用标准菌株
枯草芽孢杆菌
Bacillus subtilis
[CMCC（B）63 501]； [ATCC6633]
金黄色葡萄球菌
法规要求
实验室必须保存有满足试验需要的标准菌种/菌株（ 标准培养物），除检测方法（如药物敏感试验、抗菌性能 测试）中规定的菌种外，还应包括应用于培养基验收/质 量控制、方法确认/证实、阳性对照、阴性对照、人员培 训考核和结果质量保证等所需的菌株。并且：
1.标准菌株必须从认可的菌种或标本收集途径获得。 2.应有文件化的程序管理标准菌株（原始标准菌株、 标准储备菌株和工作菌株），涵盖菌种申购、保管、领用 、使用、传代、存储等方面，确保溯源性和稳定性。主要 包括：
标准储备菌株 保藏和使用应注意避免交叉污染，减少菌株突 变或发生典型的性能变化；标准储备菌株应制备多份，并采 用超低温（-70℃）或冻干的形式保存，测试菌株在每种培养 基上的生长特性应全部文件化。
工作菌株 传代时避免交叉污染和菌株的退化。制备菌株应接 种到相应的非选择性的培养基中培养，以获得特性稳定的菌 株（对数生长期的菌，按照法规要求的培养基和菌种进行传 代和培养）。
菌种的使用、废弃
• 标准菌株复活
标准菌株处于一种深度休眠状态，生理特性受到抑 制，代谢处于较低状态，必须经过恢复后才能使用，即 将标准菌株溶解后将其接种于新鲜的营养培养基上，在 一定的温度下培养一段时间。
对于从标准菌种保藏中心或其他有效的认证的商业机 构获得原包装的质控菌株，复苏和使用应按照制造商提 供的使用说明进行。
菌种的相关术语与定义
环境分离菌 从产品、原辅料、制药用水、环境等分离的菌 株，可以做成储备菌株和工作菌株。
传代 任何形式的转种均被认为是传代。
菌种的相关术语与定义-保藏机构
CMCC —— 中国医学菌种保藏中心 CMCC（F）或 CMCC（B）
F代表真菌、B代表细菌
ATCC ——美国标准菌种收藏所 著名的微生物保藏中心，创立于1899年，设在美国马里兰州罗克维尔市。 收藏有细菌、真菌、动植物病毒、噬菌体、藻类和原生生物等共计16000 株以上的微生物种株。
大肠埃希菌
Escherichia coli
[CMCC（B）44 102]；[ATCC8739]
白色念珠菌
Candida albicans
[CMCC（F）98 001]；[ATCC10231]
黑曲霉
Aspergillus niger
[CMCC（F）98 003]；[ATCC16404]
环境监控分离菌
样品分离菌
工作菌株 标准储备菌株可用于制备工作菌株，工作菌株传代次数严格控制，
不得超过5代。
记录 实验室必须建立和保存其所有菌种的进出、收集、储藏、 销毁记录。
菌种的购买、接收
购买计划：购买的菌种一般为药典规定的标准菌种。应
从CMCC授权的代理商处或经过ISO9001认证机构购买。 国外购买菌种，需要到公安局机关备案。
1. 菌种名称； 2. 代码（CMCC,ATCC）； 3. 菌种代数； 4. 供应商名称； 5. 生产批号； 6. 有效期； 7. 接收数量； 8. 接收日期。
在菌种安瓿及菌种管上粘贴标签，内容包括：菌种名称、 菌种代号、代次、接收日期、接收人、贮存条件、有效期。
菌种保藏
菌种的保藏、传代
微生物菌种用各种适宜的方法妥善保藏，避免死亡、污染， 保持其原有性状基本稳定，以便于研究、交换和使用。
是一种长期保藏菌种的方法。一般情况下购买的冻干菌 种即为此种方法。使用时需要进行溶解、复壮、冷藏。
菌种的保藏、传代
传代
试验用菌株的传代次数不得超过5 代（从菌种保存中心 获得的冷冻干燥菌种为第0 代）。代的定义：每接种一次即 为一代（有在新鲜的培养基上生长过程)传代示意图：
原始菌种
第一代
QC
S1
S2
干燥菌种(安瓿)的开启
菌种的使用、废弃
• 标准菌株复活-细菌类
菌种管外表面消毒（75%酒精）后打开，吸取0.3 ～0.4ml规定的培养液，加至菌种管底部，将冻干菌搅 动促使溶解，随即吸出管内菌液，分别接种至斜面及普 通肉汤内（肉汤一般5～6ml），厌氧菌需要在厌氧条件 下溶解，并且注意动作迅速，因为好氧条件有可能降低 它的活性，依据说明书的培养条件进行培养。如果生长 的不好，可以延长培养时间。
微生物具有容易变异的特性，因此，在保藏过程中，必须使 微生物的代谢处于最不活跃或相对静止的状态，才能在一定的时 间内使其不发生变异而又保持生活能力。低温、干燥和隔绝空气 是使微生物代谢能力降低的重要因素，所以，菌种保藏方法虽 多，但都是根据这三个因素而设计的。一般的保藏方式有冷藏保 藏法、低温冷冻保藏法、 冷冻干燥保藏法。
菌种的使用、废弃
标准菌株的纯度检查 菌落形态 取复活后的培养物，在相应的鉴别平板或非选择 平板上划线分离，培养出单菌落，观察菌落形态是否符合该菌 株要求，同一平板上的单菌落大小，形状、颜色、质地、光泽 是否相似，对于出现两种以上形态的菌株，应再分别挑取单菌 落划线，检测是否出现相同特征。 细胞形态 取划线平板上的单菌落，革兰氏染色反应应符合 要求，且呈现一致性。 生化鉴定 必要时进行生化鉴定
S3
菌种的保藏、传代
菌种传代流程
冻干菌种
S1
S2
S3
S72
QC CV
Cycle 1储备管 第二代 冻存（零下50℃）
TSB
鉴别
WS1
WS2 WS3
WS72
Leabharlann BaiduS1
S2
工作菌悬液 第三代 冷藏（2~8℃）
S3
S72
WS1 WS2 WS3 WS72
Cycle 2储备管 第三代 冻存（零下50℃）
QC
鉴别
工作菌悬液 第四代 冷藏（2~8℃）
菌种的保藏、传代
菌种保藏的基本原则
1. 应针对菌种的生物学性状选择适宜方法进行保藏。 2. 应使保藏的菌种不染杂菌，使退化和死亡降低到最低 限度。 3. 应保证菌种保藏的安全性，不能对周围环境造成污染 和危害。
菌种保藏、传代
标准菌株和标准商业派生菌株 要以原始的包装形式进行保 藏，复苏和使用应按照厂商提供的使用说明进行。
标准菌种作为药品微生物检验标准，Ch.P2015 无菌检查法（通则1101）、微生物计数 法（通则1105） 、控制菌检查法（通 则1106） 、抑菌效力检查法（通则1121）、 药品微生物实验室质量管理指导原则 （通则9203）、药品洁净实验室微生物监测 和控制指导原则（通则9205）等对试验用菌 种都有明确要求。
菌种的使用、废弃
• 储备菌株制备
将标准菌株在实验室转接一代后得到的一套完全相 同的独立菌株。标准储存菌株不应用来制备标准菌株。
用于性能测试的标准储存菌株，在保存和使用时应 注意避免交叉污染，减少菌株突变或发生典型的特性变 化；标准储备菌株应制备多份，并采用超低温（-70 ℃） 或冻干的形式 保存。在较高温度下贮存时间应缩短。
菌种的使用、废弃
• 储备菌株制备
细菌和酵母： 将复活后经过性能确认的菌株的斜面培养物，用
0.85%的灭菌生理盐水洗斜面菌苔成均匀的菌悬液，加 入10%灭菌甘油，混匀，封装到储备管。
或将复活后的菌液中加入10%的无菌甘油混匀，12ml/管分装于冻存管。最后一支储备管进行生化等鉴定
根据需要制备储备管，按顺序进行编号，最后一支 做为质控管进行质量控制，即进行相应的确认。