分子生物学诊断(精)
(整理)分子生物学检测技术简介
分子生物学检测技术简介分子生物学诊断技术是现代分子生物学与分子遗传学取得巨大进步的结晶，是在人们对基因的结构以及基因的表达和调控等生命本质问题的认识日益加深的基础上产生的。
近年来，分子生物学诊断技术的方法学研究取得了很大进展，先后建立了限制性内切酶酶谱分析、核酸分子杂交、限制性片段长度多态性连锁分析等方法。
1985年由美国Cetus公司人类遗传学研究室Mullis等创立并随后迅速发展起来的DNA 体外扩增技术（Polymerase Chain Reaction, PCR），以及90年代发展起来的DNA芯片技术（DNA Chip），又将分子生物学诊断技术提高到一个崭新的阶段。
一、核酸分子杂交（一）概述：具有一定互补序列的核苷酸单链在液相或固相中按碱基互补配对原则缔合成异质双链的过程叫核酸分子杂交。
应用该技术可对特定DNA或RNA序列进行定性或定量检测。
到目前为止，分子杂交技术在基因诊断中仍占重要地位，它按反应支持物可分为固相杂交和液相杂交两种，前者应用较广，有Southern印迹杂交、点杂交、夹心杂交（三明治杂交）、原位杂交和寡核苷酸探针技术等。
核酸分子杂交主要涉及两个方面：待测的DNA 或RNA，以及用于检测的DNA或RNA探针。
探针标记的好坏决定检测的敏感性。
1、Southern印迹杂交是最经典和应用最广泛的杂交方法。
根据基因探针与待测DNA限制酶酶解片段杂交的带谱，可以直接确定宿主基因的缺陷所在或病原体的存在状态。
2、Northern 印迹杂交基本原理与Southern印迹杂交相同，不同的是它检测mRNA而不是DNA，因此可分析和了解基因的表达状态。
由于mRNA比DNA更易受到各种因素的降解，所以整个操作过程须特别小心。
3、斑点杂交将待测DNA或细胞裂解物变性后直接点在硝酸纤维素膜上（无需限制酶酶解），与探针进行杂交反应。
该技术对于基因拷贝数多的样品很适合，具有简捷快速的特点，一次可做大批量样品的筛查，适于流行病学调查和感染性疾病外源性致病基因的检测。
分子生物学诊断技术进展
3
4 5
8
16 32 64 1,048,576 1,073,741,824
22
5 cycle = 32 Amplicon
6 cycle = 64 Amplicon
6 20 30
7 cycle = 128 Amplicon
荧光PCR原理 – TaqManTM技术
λ
Q
R
探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收， 所以检测不到荧光，此种现象称为荧光共振能量转移。
18
PCR 循环 第二步–引物与靶序列退火
19 引物与解为单链的DNA上互补序列杂交在一起，称之为退火。55℃左右
PCR 循环 第三步 - 引物延伸
在DNA聚合酶催化作用下，以dNTPs为原料（底物），从引物的3’端A开始, 沿着5’→3’的方向，合成每条模板的互补链，此称引物延伸。72℃左右 20
14
分子生物学技术在其它领域的应用
在基础研究领域中的应用； 遗传病的基因诊断和产前基因诊断： 如血友病、地中海贫血等 肿瘤基因和肿瘤标志物表达(mRNA)的检测； 骨髓移植、器官移植供体配型选择； 法医学、动植物学、古人类学、古生物学； 与疾病相关的各种蛋白（细胞因子、酶、激 素、受体）的基因表达的检测； 药物基因组学、耐药基因的检测，等等
4、质谱
利用色、质谱结合PCR技术
6
分子诊断的功能及扩展
病原的诊断和鉴别诊断 病原分型 病毒载量监测---个体化治疗的依据 疗效及预后标志 其他：病原感染中发生、发展各阶段
7分子诊断的功能及扩展 Nhomakorabea疾病分型及意义
例如：HPV （30/100） 高危---16，18，31，45 低危--- 6，11
分子生物学诊断技术
不断发展和衍生出新的技术方法
1、普通PCR
（1）原理：是体外DNA的大量复制合成反应。
பைடு நூலகம்
（2）基本要素：
① DNA模板 ② DNA引物：与模板互补的小片段DNA， 通常为15~25个碱基。 ③耐热的DNA聚合酶 ④dNTPS：dATP、dGTP、dCTP、dTTP ⑤反应缓冲液
分子生物学诊断技术
一、概述：
它是近年来迅速发展起来的一门新的
诊断技术，在寄生虫病诊断和研究中应用
越来越广泛。人们预言， 21世纪将是分子
生物学的世纪，因此，本技术将是寄生虫
诊断技术的重要发展方向。
二、方法
（一）聚合酶链反应（polymerase chain
reaction, PCR）
二十世纪80年代中期问世
②亦可用于丝虫病、恙虫病和细粒
棘球绦虫病的诊断
2、免疫 PCR
用PCR方法检测免疫学反应 （1）原理：
待测抗原（包板） ＋ 特异性抗体 - Biotin（生物素）
avidin（亲和素）
已知DNA片段 - Biotin PCR反应
凝胶电泳分析
（2）特点：
①高度敏感：可在单细胞内检测到抗原
②非特异性反应较多
3、PCR-ELISA
用免疫学方法检测PCR反应产物 （1）原理：待测标本DNA-模板 荧光素-特异性引物-Biotin
PCR
产物加入亲和素包被的酶标板 酶标抗荧光素抗体
底物
显色
（2）特点：
①可同时处理大量标本，便于自动化 ②避免了溴乙锭的污染与紫外线的损伤
生物芯片与基因芯片技术
（3）特点
①极度敏感：以指数方式扩增目的DNA序列 经30个左右循环，扩增倍数可达原来的106。
分子生物学诊断技术
ppt课件
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第二步为杂交反应。
杂交反应包括预杂交、 杂交和漂洗几步操作
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预杂交的目的是用非特 异性DNA分子(鲑精DNA 或小牛胸腺DNA)及其他高 分子化合物(Denhart’s溶液) 将待测核酸分子中的非特 异性位点封闭，以避免这 些位点与探针的非特异性 结合。
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杂交反应是使单链核酸 探针与固定在膜上的待 测核酸单链在一定温度 和条件下进行复性反应 的过程。
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4
通过捕捉探针标记物释放出 的信号，便可知被检DNA中
有无与探针序列相同的DNA 。
每一种病原体都具有独特的 DNA片段，通过分离和标记 这些片段，就可制备出A探针的种类
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6
➢按DNA探针的来源可分为 cDNA探针和基因组DNA 探针和动基体DNA(kDNA) 三大类
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➢用探针对细胞或组织 切片中的核酸杂交并 进行检测的方法称之 为核酸原位杂交。
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其特点是靶分子固定在细胞 中，细胞固定在载玻片上， 以固定的细胞代替纯化的核 酸，然后将载玻片浸入溶有 探针的溶液里，探针进入组 织细胞与靶分子杂交，而靶 分子仍固定在细胞内，以确 定有无该病原体的感染。
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常规处理如下，先用限制
性内切酶对DNA样品进行酶
切处理，经琼脂糖凝胶电泳 将所得DNA片段按分子量大
小分离，接着对凝胶进行变 性处理，使双链DNA解离成 单链，并将其转移到NC膜或
其它固相支持物上，转移后 各DNA片段的相对位置保持 不变。
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Southern印迹的方法有3 种，分别为毛细管转移 (或虹吸印迹)，电转移 和真空印迹，详细操作 可参阅有关书籍
分子生物学诊断方法
二、DNA聚合酶链式反应 （Polymerase chain reaction, PCR）
PCR技术是在模板DNA、引物和4种脱氧核糖核苷酸存在 的条件下依赖于DNA聚合酶的酶促合成反应。通过2030个重复的变性、退火和延伸步骤，DNA片段得到了大 量复制，数量可达2×106~107拷贝。
PCR技术的特异性取决于引物和模板DNA结合的特异性。
材料： 待扩增的样品（提取的含有寄生虫的基因组DNA） 引物：根据寄生虫特定DNA序列设计的寡核苷酸单链 脱氧核糖核苷三磷酸：分别是dATP, dTTP dCTP dGTP DNA聚合酶：将特定的脱氧核糖核苷三磷酸添加到引物3’ 端，完成DNA扩增 酶缓冲液：含有Mg2+等成分，用于保持聚合酶的活性。
样品
DNA聚合酶及缓冲液 引物脱氧核糖核苷三磷酸来自第三节 分子生物学诊断方法
从DNA双螺旋结构被发现以来，基于核酸的寄 生虫分子诊断技术就一直在飞速发展。从基于 DNA探针的DNA印迹技术，到现在广泛应用的 PCR技术，最新也发展了基于高通量测序、核 酸芯片技术的方法，分子生物学诊断技术在寄 生虫和寄生虫病的鉴定、诊断方面起到越来越 重要的作用。
一、DNA印迹（Southern blot）
转基因艾美耳球虫的DNA印迹分析。
转基因球虫基因组提取后用EcoR V,
酶切，电泳分离后将DNA转印到硝酸 纤维素膜膜上，然后用地高辛标记 的、特异性针对外源基因YFP的探针 去杂交。图中显示仅仅转基因球虫 具有YFP基因特异性的杂交条带。阳 性对照为含有YFP基因的质粒DNA。
分子生物学之基因诊断与基因治疗讲课文档
第二节
基因治疗
Gene Therapy
现在十二页，总共二十五页。
第十二页，共25页。
基因治疗的定义
是以改变人遗传物质为基础的生物医学治疗， 即通过一定方式将人正常基因或有治疗作用的DNA
片段导入人体靶细胞以矫正或置换致病基因的治疗方法。 它针对的是疾病的根源，即异常的基因本身。
现在十三页，总共二十五页。
现在十页，总共二十五页。
第十页，共25页。
（五）DNA指纹鉴定是法医学个体识别的核 心技术
人与人之间的某些DNA序列特征具有高度的个体特异性和终生稳定 性，正如人的指纹一般，故称为DNA指纹（DNA fingerprinting）。
现在十一页，总共二十五页。
STR等位基因在家庭 中遗传示意图
第十一页，共25页。
现在五页，总共二十五页。
第五页，共25页。
（二）基因点突变的诊断
1．等位基因特异性寡核苷酸分子杂交
检测点突变的有效 技术是等位基因特 异性寡核源自酸 （ allele specific
oligonucleotide ，
ASO）分子杂交。
现在六页，总共二十五页。
第六页，共25页。
2．反向点杂交
反向点杂交（reverse dot blot，RDB）是改进的 ASO技术。 一次检测可以同时筛查多种突变，大大提高了基因诊断效率 。
现在二页，总共二十五页。
第二页，共25页。
一、基因诊断的主要对象和样品来源
对象：
主要是DNA分子，涉及到功能分析时，还可定量检
测RNA（主要是mRNA）和蛋白质等分子。
样品来源：
临床上可用于基因诊断的样品有血液、组织块、 羊水和绒毛、精液、毛发、唾液和尿液等。
分子生物学技术在医学检验中的应用进展(精)
分子生物学技术对未来医疗健康产业的推动作用
基因诊断：通过分子生物学技术， 可以实现疾病的早期诊断和精准治 疗
个性化医疗：分子生物学技术可以 实现个性化医疗，为患者提供更精 准的治疗方案
添加标题
添加标题
添加标题
添加标题
药物研发：分子生物学技术可以加 速新药研发，提高药物疗效和安全 性
公共卫生：分子生物学技术可以提 升公共卫生水平，预防和控制疾病 传播
单细胞测序技术：能够分析单个细胞的基因和蛋白质表达，提高疾病诊断 的准确性 生物芯片技术：能够快速检测多种生物标志物，提高疾病诊断的灵敏度和 准确性
分子生物学技术对个性化医疗和精准诊断的贡献
基因测序：通 过基因测序技 术，可以精确 地检测个体的 基因变异，为 个性化医疗提
供依据
生物标志物检 测：通过检测 生物标志物， 可以准确地诊 断疾病，为精 准诊断提供支
基因测序技术：通过分析DNA序列，了解个体的遗传信息 应用领域：疾病诊断、药物研发、遗传咨询等 技术特点：高通量、高精度、低成本 应用实例：肿瘤基因检测、遗传病筛查、药物靶点发现等
生物标志物检测在医学检验中的应用
生物标志物： 反映疾病状态 或治疗效果的
分子
检测方法：基 因测序、蛋白 质组学、代谢
组学等
持
药物靶点发现： 通过分子生物 学技术，可以 找到疾病的药 物靶点，为个 性化医疗提供 新的治疗方法
疾病风险预测： 通过分子生物 学技术，可以 预测个体的疾 病风险，为预 防医学提供支
持
分子生物学技术面临的挑战和解决策略
技术难度：分子生物学技术需要高精度的仪器和复杂的操作流程，对技术人员的要求较高
中的应用更加高效
A
B
分子生物学技术在临床诊断中的应用
分子生物学技术在临床诊断中的应用随着科学技术的不断进步，分子生物学技术在临床诊断中的应用逐渐受到重视。
分子生物学技术通过研究个体生命的基本单位——分子，为临床提供了精确、快速、准确的诊断方法。
本文将重点介绍分子生物学技术在临床诊断中的几个关键应用领域。
一、基因检测技术基因检测技术是分子生物学技术在临床诊断中最常见的应用之一。
通过对个体基因组进行检测，可以及早发现有关遗传疾病的突变，为疾病的预防和治疗提供重要信息。
例如，某些遗传性疾病如囊肿纤维化、遗传性癌症等，可以通过基因检测技术来确定患者是否携带致病基因，从而进行早期干预和治疗。
此外，在药物疗效个体化中，基因检测技术也被广泛应用，用于预测药物代谢能力和药物反应性，以实现更加精确的治疗方案。
二、PCR技术聚合酶链式反应（PCR）是目前分子生物学技术中最为常用的技术之一。
PCR技术通过复制和扩增特定DNA片段，能够在短时间内获得足够的DNA量，用于临床诊断中的操作。
例如，在感染性疾病的诊断中，PCR技术可以通过检测病原体的核酸，迅速准确地确定感染的种类和菌株，从而指导临床的治疗方案。
此外，在遗传性疾病的诊断中，PCR技术可以用于检测突变的基因片段，帮助医生准确诊断患者的遗传疾病。
三、DNA测序技术随着第二代测序技术的出现，DNA测序技术在临床诊断中得到了广泛的应用。
DNA测序技术通过对个体DNA进行全面测序，可以识别基因组中的突变和变异，为基因医学研究和个性化治疗提供基础。
例如，在肿瘤的诊断和治疗中，通过对肿瘤DNA的测序，医生可以获取肿瘤的突变信息，从而制定出更加精准的治疗方案。
此外，DNA测序技术也被广泛应用于新生儿筛查和遗传性疾病的诊断，为患者提供早期预防和干预。
四、蛋白质组学技术蛋白质组学技术是研究生物体蛋白质组成和功能的一种方法。
在临床诊断中，蛋白质组学技术可以通过对体液中的蛋白质进行分析，筛查和识别与疾病相关的生物标志物，从而辅助疾病的早期诊断和治疗。
分子生物学的疾病诊断与治疗
分子生物学的疾病诊断与治疗随着科技的不断发展，分子生物学逐渐成为医学领域中的热门专业。
分子生物学主要研究的是生物分子如核酸、蛋白质等的结构、功能、调控及其相互作用。
同时，它也是疾病诊断和治疗的关键领域之一。
一、基因检测在疾病诊断中的应用基因检测作为分子生物学的重要一环，在疾病诊断和治疗中起着关键作用。
基因检测可以帮助医生发现人体内是否存在一些有害的基因突变，从而提前预防疾病的发生。
比如，BRCA1、BRCA2 基因突变对乳腺癌和卵巢癌的发生影响很大，通过基因检测可以有效发现这些突变。
此外，基因检测也可以用于确认一些罕见疾病的诊断。
例如，儿童常见的遗传性疾病，如囊性纤维化、先天性致盲、肌肉萎缩症等，基因检测可以帮助医生确认诊断并为患者制定治疗方案。
二、CRISPR-Cas9技术在疾病治疗中的应用前景CRISPR-Cas9技术是分子生物学中最受关注的技术之一，它不仅可以用于基因工程和基因编辑，还可以被用于治疗一些疾病。
最近的研究表明，CRISPR-Cas9技术可以帮助治疗遗传性疾病，如地中海贫血、镰状细胞贫血等。
这些遗传性疾病通常由于基因突变引起，但是CRISPR-Cas9技术可以通过“剪切”有害基因突变，从而恢复基因的正常功能。
三、基因治疗在癌症治疗中的应用基因治疗是一种新型的治疗方法，通过引入新的基因来修复有害的基因突变。
现在，许多研究人员正在将基因治疗应用于癌症治疗中。
例如，CAR-T细胞疗法是一种针对癌细胞的新型治疗方法，它可以通过改变T细胞的基因来帮助其识别和攻击癌细胞。
这种治疗方法不仅可以消除一些肿瘤细胞，还可以预防其扩散。
此外，基因治疗也可以帮助治疗一些罕见疾病，如先天性免疫缺陷病、肌肉萎缩症等。
通过经过修饰的病毒载体，基因治疗可以将正常基因导入人体中，从而解决一些基因缺陷引起的疾病。
总之，分子生物学在诊断和治疗疾病方面具有巨大的潜力。
随着技术的不断提高和创新，相信分子生物学将在未来的医学发展中逐渐发挥更加重要的作用。
分子生物学检验完整版
分子生物学检验完整版分子生物学检验是一门在生命科学领域中具有重要地位的学科，它通过对生物大分子，如核酸和蛋白质的研究和分析，为疾病诊断、遗传咨询、法医学鉴定、农业和畜牧业的改良等众多领域提供了关键的技术支持和科学依据。
首先，让我们来了解一下分子生物学检验的基本原理。
其核心在于利用分子生物学的技术手段，对生物样本中的核酸（DNA 和 RNA）和蛋白质进行检测和分析。
DNA 是遗传信息的携带者，它的序列和结构变化能够反映出个体的遗传特征、疾病易感性以及疾病的发生发展过程。
RNA 则在基因表达调控中起着重要作用，对 RNA 的分析可以帮助我们了解基因的活性和表达水平。
而蛋白质作为生命活动的执行者，其种类、数量和结构的变化也与各种生理和病理过程密切相关。
在实际应用中，分子生物学检验涵盖了众多技术方法。
其中，聚合酶链式反应（PCR）技术是最为常见和重要的之一。
PCR 能够在体外快速扩增特定的 DNA 片段，使其数量达到可检测的水平。
通过设计针对特定基因或序列的引物，PCR 可以用于检测病原体的存在、基因突变的鉴定以及基因分型等。
实时荧光定量 PCR 技术则在 PCR 的基础上，实现了对扩增产物的实时定量监测，大大提高了检测的准确性和灵敏度。
另一个重要的技术是核酸杂交。
它基于核酸分子碱基互补配对的原理，通过将待测核酸与已知序列的探针进行杂交，从而检测待测样本中是否存在特定的核酸序列。
这种技术在基因诊断、病毒检测以及遗传性疾病的筛查中发挥着重要作用。
除了核酸检测，蛋白质的分析也是分子生物学检验的重要组成部分。
蛋白质免疫印迹（Western blotting）技术可以检测特定蛋白质的表达水平和分子量。
酶联免疫吸附测定（ELISA）则能够对蛋白质进行定量分析，广泛应用于疾病标志物的检测和药物研发等领域。
在疾病诊断方面，分子生物学检验展现出了巨大的优势。
例如，对于传染病的诊断，它可以快速准确地检测出病原体的核酸，如新型冠状病毒的核酸检测，为疫情防控提供了有力的支持。
分子生物学检验技术-基因病的分子诊断
携带p53基因突变的人经常是李-佛美尼综合症的患者； APC基因是与大肠直肠癌发生有关的肿瘤抑制基因； BRCA1和BRCA2基因的突变则和乳癌相关；
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Rb
正常细胞中具有活性的RB蛋白（pRB）在细胞中保持着低磷酸化或无磷 酸化的状态，它与细胞周期调节因子E2F结合，抑制E2F的活性从而抑 制G1期到S期的进行，也就抑制了转录活性。 RB蛋白的失活途径有以下几种：
RAS家族是信号传递通路G-protein的成份，藉由跨膜蛋白与Gprotein的结合将信号传至核内;
蛋白质-酪胺酸激酶( protein tyrosine kinase) ABL是细胞内信号传 递蛋白与信号传递至核内有关;
核内转录因子;
MYC是DNA结合蛋白，而JUN是转录因子；
细胞周期有关的蛋白;
3. 血清胆红素轻～中度增高，溶血危象时显着增高。本病的溶血虽以血管外溶血为主， 但也存在着血管内溶血；
4. 血浆结合珠蛋白降低，血浆游离血红蛋白可能增高； 5. 红细胞半衰期测定显示红细胞生存时间明显缩短至5～15 天[正常为(28±5)天]； 6. 血红蛋白电泳显示HbS占80%以上，HbF增多至2%～15%，HbA2正常，而HbA缺如；
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癌症的特点
几乎癌组织都是克隆性增殖; 患者的所有癌细胞都起源于单一
的癌细胞; 大多数癌症不能用单基因遗传方
式解释; 某些类型的癌症，亲属发生同类
肿瘤的风险会增加，但不表现孟 德尔遗传; 许多癌症与环境的物理化学因子 或生物因子有关;
造成癌症的因素
遗传因素 一些特殊的基因突变会造成特定的癌症
斑点杂交结果
βΑ/βΑ
分子诊断的方法
分子诊断的方法分子诊断是一种基于分子生物学技术的诊断方法，通过分析患者体内的分子水平的变化来诊断疾病。
以下是常见的分子诊断方法：1. PCR（聚合酶链式反应）：PCR是一种体外扩增DNA的方法，可以在少量DNA样本中扩增目标序列，用于检测细菌、病毒、染色体异常等。
2. 实时荧光定量PCR：是PCR的一种改进方法，可以实时监测扩增反应过程中的荧光信号强度，精确定量目标序列。
3. 基因测序：通过测定DNA或RNA的序列，可以检测患者体内的基因突变或染色体异常，用于遗传性疾病、癌症等的诊断。
4. 基因芯片技术：将大量的DNA、RNA、蛋白质等生物分子固定在芯片上，通过与标记的待测样品反应，可以高通量地检测大量基因的表达水平或突变情况。
5. 蛋白质芯片技术：将大量的蛋白质固定在芯片上，通过与标记的待测样品反应，可以检测患者体内蛋白质的表达水平或特定蛋白质的变化。
6. 确定性诊断技术：利用特定的抗体或核酸探针，通过与待测样品中的抗原或核酸靶点相结合，确定疾病的存在或特定病原体的感染。
7. 肿瘤标志物检测：通过检测血液或组织中特定的分子标志物，如癌胚抗原（CEA）、前列腺特异抗原（PSA）等，来辅助癌症的早期诊断和疾病进展的监测。
需要注意的是，分子诊断方法的选择应根据具体的疾病类型、临床需求和实验条件进行综合考虑。
8. 荧光原位杂交（FISH）：通过使用荧光标记的DNA探针与目标序列特异性结合，可在组织或细胞水平上检测染色体异常、基因重排或缺失等。
9. 脱落细胞检测：通过采集体液样本（如尿液、唾液、血液等），分离出潜在的恶性细胞，并通过分子方法（如PCR、基因测序等）检测特定癌症相关的突变、融合基因或表达异常等，用于早期癌症筛查和监测。
10. 微阵列技术（Microarray）：通过将大量的DNA、RNA或蛋白质探针固定在芯片上，可以快速、高通量检测大量基因或蛋白质的表达水平，用于研究疾病的发生机制、诊断和治疗策略等。
分子生物学12基因诊断
4.原位杂交 可查明染色体中特定基因的位臵，用于染色体疾病的诊 断；原为杂交的结果是显示有关核酸序列的空间位臵情况，因此可 检出含核酸序列的具体细胞，细胞的具体定位，数目和类型，可检 出基因和基因产物的亚细胞定位。
(二）聚合酶链式反应（PCR） PCR技术在基因诊断中已得到广泛应用。在应用 中，PCR常与其它技术如分子杂交，限制酶酶谱分析， 单链构象多态性检测，限制性片段长度多态性分析， DNA序列测定等联合应用。 （三）单链构象多态性 单链构象多态性（single strand conformation
（四）敏感性
探针可用“放标”或“非放 诊断灵敏度高，标本只需 微量，DNApg水平即可。 因为表型改变往往出现较晚， 难以早期诊断 在表型改变之前，基因 结构或表达已发生改变， 故往往可以早期诊断。
（五）早期诊断
（六）基因诊断范围广 因为：①探针可为任何来源和种类，序列可为已知或未知， 目标可为特定基因或 特定基因组合，外源性或内源性基因，所 以适应性强，诊断范围广。 ②被检查基因是否处于活化状态并不重要，故可对分化阶 段表达特异性基因及其异常进行检测和诊断，这对肿瘤（如 CML）疗效及预后尤为重要。 ③在感染性疾病的诊断，能检查正在生长或潜伏病原体， 能明确既往感染或现行感染，对不易诊断（如产毒性E.coli）和 不能安全培养（如立克次体）进行基因诊断，扩大了实验室诊 断范围。
polymorphism,sscp）检测是一种基于单链DNA构象差 别来检测点突变的方法，常与PCR联合应用，称为 PCR—SSCP技术。
（四）限制酶酶谱分析 基因突变可能导致基因上某一限制酶位点的丢失
或其相对位臵发生改变，以此酶消化待测DNA和野生 型对照DNA，通过比较二者的酶切片段的长度、数量 上的差异就可判断待测DNA的突变情况。 （五）DNA序列测定
分子生物学诊断
利用分子杂交原理 具有很高的特异性 诊断灵敏度高，标本只需微 量，DNA pg水平即可 在表型改变之前，基因结构 或表达已发生改变，故往往 可以早期诊断。
整理课件
基因诊断遵循诊断学的基本原则
基因诊断的基础是医学基础，专业基础是医学分 子生物学和医学遗传学，不同的是我们在基因水平上 研究：基因结构（解剖）、基因转录翻译等（生理）、 基因结构异常（病理），基因表达异常（病生），然 后主要应用分子生物学技术手段进行基因诊断。
第十章 临床分子生物学诊断
（ Clinical Molecular Biology Diagnosis ）
整理课件
学习内容
❖ 了解流式细胞术及染色体检测在临床中的应用 ❖ 熟悉分子生物学常用技术及在临床诊断中的地位 ❖ 掌握基因诊断的定义及在临床诊断中的应用（重点）
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分子生物学概念
在分子水平上研究生命现象的科学。通过研 究生物大分子(核酸、蛋白质)的结构、功能和生 物合成等方面内容，阐明各种生命现象的本质。
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第一节 基因诊断
Gene Diagnosis
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一、基因诊断的定义：
以DNA或RNA为检查对象，应用分子生物学 技术，通过检查基因的结构或表达量的改变，对 人体状态和疾病作出诊断的方法和过程。遗传物 质可以是外源性基因，也可以是内源性基因。
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基因诊断的主要内容
基因突变分析 基因连锁分析 基因表达分析 病原体诊断
置上 ④ 插入：两处断裂产生的中间一段染色体转移到同一染色体或另
一条染色体的一个断裂处并重新连接 ⑤ 重复：染色体中增加的额外染色体成分，是染色体个别区带或
片段的重复
整理课件
分子生物学诊断方法
分子生物学诊断方法
嘿，朋友们！今天咱就来讲讲这超级厉害的分子生物学诊断方法！
你想想啊，咱平时要是身体不舒服，去医院，医生是不是经常要抽血啊什么的？那其实就是在运用分子生物学诊断方法呢！就好比警察抓坏人，得有各种线索和手段才能找到真凶，分子生物学诊断方法就是医生的秘密武器！比如说，要检测你体内有没有某种病毒，就像在一个大宝藏里找到那颗特定的宝石一样。
咱就说新冠疫情那阵子吧，大家都知道要做核酸检测，这就是典型的分子生物学诊断方法呀！通过检测样本里新冠病毒的基因片段，来确定你是不是被感染了。
这可太重要了！医生们借助这个方法就能很快地判断出谁是感染者，然后及时采取措施，保护大家的安全。
还有啊，像检测某些遗传性疾病，也是用这个方法呢！想象一下，你的身体就像一个大拼图，分子生物学诊断方法就是那个能帮我们找到缺失或错误拼图块的神奇工具。
医生能通过检测基因的变化，知道你有没有携带那些会导致疾病的基因。
你说这分子生物学诊断方法神不神？它能在我们还没察觉到身体有大问题的时候，就早早地发现隐患，这难道不是在守护我们的健康吗？它就像一个无声的卫士，默默地为我们站岗放哨啊！
所以说啊，分子生物学诊断方法真的是太重要了！它就像是医疗领域的一盏明灯，照亮了我们战胜疾病的道路！我们应该为有这样先进的技术而感到庆幸和自豪！。
诊断分子生物学基本技术(精)
诊断分子生物学基本技术现代医学是随着自然科学各基础学科的发展而发展。
在临床观察的基础上，其检验、诊断、治疗和病理生理学的进展是与实验研究方法的创新与改进分不开的。
分子生物学的迅速发展，全面地渗透到医学科学各个领域中，揭示了许多新现象，提出了不少新问题，是医学向第一节概述现代医学是随着自然科学各基础学科的发展而发展。
在临床观察的基础上，其检验、诊断、治疗和病理生理学的进展是与实验研究方法的创新与改进分不开的。
分子生物学的迅速发展，全面地渗透到医学科学各个领域中，揭示了许多新现象，提出了不少新问题，是医学向分子水平迈进的一个重要依据和手段。
使医学科学达到了一个新的阶段，医学分子生物学已逐渐形成了比较完整的理论体系。
医学检验与诊断学也不例外，分子生物学技术在医学检验诊断中的广泛应用，逐步形成诊断分子生物学（diagnostic molecular biology）这一学科分支。
诊断分子生物学的内容主要包括：⒈内源基因异常的检验与诊断在分子水平为疾病的发生机制，治疗和预后提供实验依据。
自身基因结构异常导致基因功能异常而致病，或使其表达产物蛋白质的结构与功能异常而致病，或使基因调控失常而致病，如遗传性疾病、肿瘤等。
⒉外源基因侵入体内的检验与诊断对多种病源微生物（如细菌、病毒、衣原体、支原体等）的检出，可望实现快速、灵敏、准确。
在分子水平可更准确地分类亚种和变种。
探明病源微生物致病的机制。
生物大分子指核酸和蛋白质分子，是生命物质的基本要素，如最简单的生命体病毒、噬菌体仅以核酸，蛋白质为主，却表现了生命的最基本的功能。
核酸的表达产物是蛋白质，为因果关系。
核酸是生命的存在形式，蛋白质是生命的表现形式。
许多疾病的临床表现与某些蛋白质的结构和功能异常有关，但究其原因可能是基因的结构和功能异常导致基因表达产物蛋白质异常所为。
蛋白质结构与功能的检验和临床诊断应用方法已日趋完善，而核酸结构与功能的研究历史短，研究前景广，是目前分子生物学研究的主要内容。
分子诊断
展望
• 近年来，迅速发展的分子生物学技术为分子诊 断在环境领域的应用起到了推动作用。尽管该方法 还存在着一些不足，比如对待测样品的制备要求较 高，前处理比较复杂；相关配套技术不够完善，如 基因芯片技术所需的快速数据分析和处理技术;对有 些技术的原理和实现方法尚存争议，如彗星实验中 “彗星”的形成机制尚需进一步研究；有些方法因 实验室不同而得出的结论不同，重现性较差；有些 方法的剂量-效应不明显等。但由于分子诊断在研究 污染物对环境的影响和对生物的毒害机理方面具有 直接、准确和快速等明显的优点，在环境领域的发 展前景非常乐观。
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随着其研究的逐渐深入，人们认识到 污染物对生态系统最早的作用一定开始于 对生物个体内的分子水平上的作用，且在 分子水平上生物个体之间共性最大，然后 才逐步在细胞、器官、个体、种群、群落、 生态系统各个水平上反映出来，于是开始 将分子诊断概念应用于环境领域。传统的 生态毒理学诊断方法虽然能对生态系统的 损害进行评估但缺乏早期预警功能，而分 子生物学技术的快速发展及更敏感的分子 生物标志物的不断发现赋予了生态毒理学 新的研究手段和方法，因此对污染环境的 分子诊断也受到了人们的重视，并积累了 一些研究成果。
目前人们的研究重点正逐步向长期低剂量的 污染类型转移。 污染类型转移 。 而常规监测环境中污染物及其毒 性影响的方法， 如化学方法、 色谱法、 性影响的方法 ， 如化学方法 、 色谱法 、 培养法和 实验室毒理试验等均具有滞后性、 被动性、 实验室毒理试验等均具有滞后性 、 被动性 、 间接 性等缺点， 性等缺点 ， 已经无法适应新形势下人们对环境污 染 研 究 精 确 性 的 要 求 。 1993 年 ， 美 国 科 学 家 在 Science发表了专题文章 发表了专题文章Toxicology goes molecular, 发表了专题文章 标志着分子毒理学时代的到来。 标志着分子毒理学时代的到来 。 利用分子生物学 原理和技术诊断环境被污染的情况， 原理和技术诊断环境被污染的情况 ， 可以再分子 水平上研究生物体吸收、 水平上研究生物体吸收 、 迁移和积累有毒有害物 最终被毒害及适应、 质 ， 最终被毒害及适应 、 耐性和抗性等过程的分 子机制， 灵敏且准确地预测污染物对环境的影响， 子机制 ， 灵敏且准确地预测污染物对环境的影响 ， 在环境领域有着广阔的应用前景。 在环境领域有着广阔的应用前景。
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分子生物学诊断
分子生物学诊断又称基因诊断，主要是针对不同病原微生物所具有的特异性核酸序列和和结构进行测定。
自1976年以来，基因诊断方法取得巨大进展。
建立了DNA限制性内切酶图谱分析，核酸电泳图谱分析，限制性核酸片段长度多态性分析（Restriction Fragment Length Polymorphism， RFLP）寡核苷酸指纹图分析（Analysis of fingerprint map），核酸序列分析，聚合酶链反应（Polymerase Chain Reaction，PCR），核酸探针（原位杂交、斑点印迹杂交、Southern印迹杂交、Northern印迹杂交），免疫印迹又称Western印迹（Western blot，WB）、主要用于病原微生物分类的DNA中G+C mol%含量测定技术以及新近几年发展起来的DNA芯片（DNA Chip）技术等诊断技术。
具有代表性的技术主要有PCR技术、核酸探针和DNA芯片（DNA Chip）技术。
一、PCR技术
PCR技术是在模板DNA、引物和4种脱氧单核苷酸底物（dATP，dCTP，dGTP，dTTP）存在的条件下依赖于耐高温的DNA聚合酶的酶促合成反应。
PCR以欲扩增的DNA作为模板，以和模板正链和负链末端互补的两种寡聚核苷酸作为引物，经过模板DNA变性、模板引物复性结合、并在DNA聚合酶作用下发生引物链延伸反应来合成新的模板DNA。
模板DNA变性、引物结合（退火）、引物延伸合成 DNA 这三步构成一个PCR循环。
每一循环的DNA产物经变性又成为下一个循环的模板DNA。
这样，目的DNA的数量将以2n -2n的形式累积，在2h内可扩增30（n）个循环， DNA量达原来的上百万倍。
对扩增产物可通过凝胶电泳、Southern杂交或DNA序列分析进行检测。
PCR可扩增双链DNA和单链DNA，并能以RNA为模板，进行反转录PCR以扩增cDNA。
经不断发展和完善，已有多种衍生PCR技术。
除反转录PCR（reverse transcription PCR，RT－PCR）外，尚有不对称PCR（Asymmetric PCR）、反向PCR（Inverse PCR）、锚定PCR（Anchored PCR）、多重PCR（Multiplex PCR）、着色互补PCR Colour complementation assay）又称荧光PCR（Fluroscent PCR）、
免疫PCR（Immuno－PCR）和套式PCR（Nested PCR）等。
PCR技术可用于传染病的早期诊断和不完整病原检疫；能快速、准确、安全检测病原体； PCR可为核酸杂交提供探针和标记探针；可准确鉴别某些比较近似的病原体，在精确区分病毒不同型、不同株、不同分离物的相关性方面具有独特的优势，可从分子水平上区分不同的毒株并解释它们之间的差异。
此外，PCR 技术还广泛应用于分子克隆、基因突变、核酸序列分析、癌基因和抗癌基因以及抗病毒药物等研究中。
自1990年始，用PCR成功进行检测的宠物传染病病毒有：蓝舌病病毒、口蹄传染病毒、牛病毒性腹泻病毒、牛白血病病毒、马鼻肺炎病毒、恶性卡他热病毒、伪狂犬病病毒、狂犬病病毒。
非洲猪瘟病毒、禽传染性支气管炎病毒、禽传染性喉气管炎病毒、马传染性肺炎病毒、马立克氏病毒、牛冠状病毒、鱼传染性造血器官坏死病病毒、轮状病毒、水道猫鱼病病毒、水貂阿留申病病毒、山羊关节－脑炎病毒、梅迪－维斯纳病毒、猪细小病毒等。
由其它病原体引起的传染性疾病的研究目前已报道的有致病性大肠杆菌毒素基因、牛胎儿弯曲杆菌、牛分枝杆菌、炭疽杆菌芽孢、钩端螺旋体、牛巴贝斯虫和弓形虫等的PCR检测研究。
在食品微生物的检测中，PCR技术的应用也日趋广泛。
二、核酸探针技术
核酸探针是指带有标记物的已知序列的核酸片段，它能和与其互补的核酸序列杂交，形成双链，所以可用于待测核酸样品中特定基因序列的检测。
每一种病原体都具有独特的核酸片段，通过分离和标记这些片段就可制备出探针，用于疾病的诊断等研究。
核酸探针按其来源及性质可分为基因组DNA探针、cDNA探针、RNA探针和人工合成的寡核苷酸探针等几类。
按标记物可分为放射性标记探针和非放射性标记探针两大类。
作为诊断试剂，较常使用的是基因组DNA探针和cDNA探针。
放射性标记探针用放射性同位素作为标记物，以32P应用最普遍。
非放射性标记物是生物素（Biotin）和地高辛（digoxigenin）。
探针的制备和标记还可通过PCR 反应直接完成。
核酸杂交有固相杂交和液相杂交之分。
固相杂交技术目前较为常用，先将待测核酸结合到一定的固相支持物上，再与液相中的标记探针进行杂交。
固相杂交包括膜上印迹杂交和原位杂交。
用探针对细胞或组织切片中的核酸杂交并进行检测的方法称之为核酸原位杂交。
可用特异性的细菌、病毒的核酸作为探针对组织、细胞进行原位杂交，以确定有无该病原体的感染等。
原位杂交不需从组织中提取核酸，对于组织中含量极低的靶序列有极高的敏感性。
各种杂交技术中，膜上印迹杂交技术应用最为广泛，核酸印迹技术有：斑点印迹（Dot-blot），将待测核酸样品变性后直接点样在膜上；Southern印迹（Southern blot），将DNA片段经琼脂糖凝胶电泳分离后转移到固相支持物上；Northern印迹（Northern blot），将RNA片段变性及电泳分离后，转移到固相支持物上。
Northern印迹的方法与Southern印迹基本相同，但待检的是RNA。
核酸探针技术是目前分子生物学中应用最广泛的技术之一，是定性或定量检测特异RNA或DNA序列的有力工具。
可用以检测任何特定病原微生物，并能鉴别密切相关的毒（菌）株和寄生虫。
目前，各种常见病毒病的诊断和研究都已应用到核酸探针技术，这方面的研究报道数以万计且与日俱增。
但该项技术的操作毕竟比常规方法复杂，费用较高，多在实验室内对病原作深入研究时使用。
三、DNA芯片技术
DNA芯片技术是在核酸杂交，测序的基础上发展起来的，与Southern杂交、Northern杂交原理相同，即DNA碱基配对和序列互补原理。
DNA芯片又称为微排列（microarray），属于生物芯片的一种。
根据微排列上探针的不同，DNA芯片分为寡核苷酸芯片和cDNA芯片。
该项技术应用成熟的照相平板印刷术和固相合成，在固相支持物的精确部位合成成千上万个高分辨率的不同化合物制成的探针。
片上单个探针密度为107～108分子/片。
通过荧光标记杂交检测共聚焦荧光显微镜进行激光扫描、计算机处理软件进行数据荧光图象分析，做出快速诊断。
用DNA芯片进行的表达水平检测可自动、快速地检测出成千上万个基因的表达情况。
DNA芯片诊断技术以其快速、高效、敏感、经济、平行化、自动化等特点，将成为一项现代化诊断新技术。
DNA芯片技术能够大规模地筛选、通用性强，
能够从基因水平解释药物的作用机理，即可以利用DNA芯片分析用药前后机体的不同组织、器官基因表达的差异。
DNA芯片药物筛选技术工作目前刚刚起步，美国很多制药公司已开始前期工作，即正在建立表达谱数据库，从而为药物筛选提供各种靶基因及分析手段。
这一技术具有很大的潜在应用价值。
DNA芯片对实现个体化医疗，对症下药，指导治疗和预后有很大的意义。
DNA芯片利用固定探针与样品进行分子杂交产生的杂交图谱而排列出待测样品的序列，这种测定方法快速而具有十分诱人的前景。
DNA芯片技术可以允许研究人员同时测定成千上万个基因的作用方式，几周内获得的信息用其它方法需要几年才能得到。
目前已有筛选检测HIV病毒蛋白酶基因DNA芯片、反转录酶基因突变的DNA芯片、金黄色葡萄球菌DNA芯片、白色念珠菌DNA芯片、结核杆菌耐药性检测芯片、多种恶性肿瘤相关病毒DNA芯片问世。
DNA芯片技术在人医传染病诊断上已有报道，在宠物传染病的诊断上尚未见报道。