分子生物学诊断(精)

分子生物学诊断

分子生物学诊断又称基因诊断，主要是针对不同病原微生物所具有的特异性核酸序列和和结构进行测定。自1976年以来，基因诊断方法取得巨大进展。建立了DNA限制性内切酶图谱分析，核酸电泳图谱分析，限制性核酸片段长度多态性分析（Restriction Fragment Length Polymorphism， RFLP）寡核苷酸指纹图分析（Analysis of fingerprint map），核酸序列分析，聚合酶链反应（Polymerase Chain Reaction，PCR），核酸探针（原位杂交、斑点印迹杂交、Southern印迹杂交、Northern印迹杂交），免疫印迹又称Western印迹（Western blot，WB）、主要用于病原微生物分类的DNA中G+C mol%含量测定技术以及新近几年发展起来的DNA芯片（DNA Chip）技术等诊断技术。具有代表性的技术主要有PCR技术、核酸探针和DNA芯片（DNA Chip）技术。

一、PCR技术

PCR技术是在模板DNA、引物和4种脱氧单核苷酸底物（dATP，dCTP，dGTP，dTTP）存在的条件下依赖于耐高温的DNA聚合酶的酶促合成反应。PCR以欲扩增的DNA作为模板，以和模板正链和负链末端互补的两种寡聚核苷酸作为引物，经过模板DNA变性、模板引物复性结合、并在DNA聚合酶作用下发生引物链延伸反应来合成新的模板DNA。模板DNA变性、引物结合（退火）、引物延伸合成 DNA 这三步构成一个PCR循环。每一循环的DNA产物经变性又成为下一个循环的模板DNA。这样，目的DNA的数量将以2n -2n的形式累积，在2h内可扩增30（n）个循环， DNA量达原来的上百万倍。对扩增产物可通过凝胶电泳、Southern杂交或DNA序列分析进行检测。

PCR可扩增双链DNA和单链DNA，并能以RNA为模板，进行反转录PCR以扩增cDNA。经不断发展和完善，已有多种衍生PCR技术。除反转录PCR（reverse transcription PCR，RT－PCR）外，尚有不对称PCR（Asymmetric PCR）、反向PCR（Inverse PCR）、锚定PCR（Anchored PCR）、多重PCR（Multiplex PCR）、着色互补PCR Colour complementation assay）又称荧光PCR（Fluroscent PCR）、

免疫PCR（Immuno－PCR）和套式PCR（Nested PCR）等。

PCR技术可用于传染病的早期诊断和不完整病原检疫；能快速、准确、安全检测病原体； PCR可为核酸杂交提供探针和标记探针；可准确鉴别某些比较近似的病原体，在精确区分病毒不同型、不同株、不同分离物的相关性方面具有独特的优势，可从分子水平上区分不同的毒株并解释它们之间的差异。此外，PCR 技术还广泛应用于分子克隆、基因突变、核酸序列分析、癌基因和抗癌基因以及抗病毒药物等研究中。

自1990年始，用PCR成功进行检测的宠物传染病病毒有：蓝舌病病毒、口蹄传染病毒、牛病毒性腹泻病毒、牛白血病病毒、马鼻肺炎病毒、恶性卡他热病毒、伪狂犬病病毒、狂犬病病毒。非洲猪瘟病毒、禽传染性支气管炎病毒、禽传染性喉气管炎病毒、马传染性肺炎病毒、马立克氏病毒、牛冠状病毒、鱼传染性造血器官坏死病病毒、轮状病毒、水道猫鱼病病毒、水貂阿留申病病毒、山羊关节－脑炎病毒、梅迪－维斯纳病毒、猪细小病毒等。由其它病原体引起的传染性疾病的研究目前已报道的有致病性大肠杆菌毒素基因、牛胎儿弯曲杆菌、牛分枝杆菌、炭疽杆菌芽孢、钩端螺旋体、牛巴贝斯虫和弓形虫等的PCR检测研究。在食品微生物的检测中，PCR技术的应用也日趋广泛。

二、核酸探针技术

核酸探针是指带有标记物的已知序列的核酸片段，它能和与其互补的核酸序列杂交，形成双链，所以可用于待测核酸样品中特定基因序列的检测。每一种病原体都具有独特的核酸片段，通过分离和标记这些片段就可制备出探针，用于疾病的诊断等研究。

核酸探针按其来源及性质可分为基因组DNA探针、cDNA探针、RNA探针和人工合成的寡核苷酸探针等几类。按标记物可分为放射性标记探针和非放射性标记探针两大类。作为诊断试剂，较常使用的是基因组DNA探针和cDNA探针。放射性标记探针用放射性同位素作为标记物，以32P应用最普遍。非放射性标记物是生物素（Biotin）和地高辛（digoxigenin）。探针的制备和标记还可通过PCR 反应直接完成。

核酸杂交有固相杂交和液相杂交之分。固相杂交技术目前较为常用，先将待测核酸结合到一定的固相支持物上，再与液相中的标记探针进行杂交。固相杂交包括膜上印迹杂交和原位杂交。用探针对细胞或组织切片中的核酸杂交并进行检测的方法称之为核酸原位杂交。可用特异性的细菌、病毒的核酸作为探针对组织、细胞进行原位杂交，以确定有无该病原体的感染等。原位杂交不需从组织中提取核酸，对于组织中含量极低的靶序列有极高的敏感性。

各种杂交技术中，膜上印迹杂交技术应用最为广泛，核酸印迹技术有：斑点印迹（Dot-blot），将待测核酸样品变性后直接点样在膜上；Southern印迹（Southern blot），将DNA片段经琼脂糖凝胶电泳分离后转移到固相支持物上；Northern印迹（Northern blot），将RNA片段变性及电泳分离后，转移到固相支持物上。Northern印迹的方法与Southern印迹基本相同，但待检的是RNA。

核酸探针技术是目前分子生物学中应用最广泛的技术之一，是定性或定量检测特异RNA或DNA序列的有力工具。可用以检测任何特定病原微生物，并能鉴别密切相关的毒（菌）株和寄生虫。目前，各种常见病毒病的诊断和研究都已应用到核酸探针技术，这方面的研究报道数以万计且与日俱增。但该项技术的操作毕竟比常规方法复杂，费用较高，多在实验室内对病原作深入研究时使用。

三、DNA芯片技术

DNA芯片技术是在核酸杂交，测序的基础上发展起来的，与Southern杂交、Northern杂交原理相同，即DNA碱基配对和序列互补原理。DNA芯片又称为微排列（microarray），属于生物芯片的一种。根据微排列上探针的不同，DNA芯片分为寡核苷酸芯片和cDNA芯片。该项技术应用成熟的照相平板印刷术和固相合成，在固相支持物的精确部位合成成千上万个高分辨率的不同化合物制成的探针。片上单个探针密度为107～108分子/片。通过荧光标记杂交检测共聚焦荧光显微镜进行激光扫描、计算机处理软件进行数据荧光图象分析，做出快速诊断。

用DNA芯片进行的表达水平检测可自动、快速地检测出成千上万个基因的表达情况。DNA芯片诊断技术以其快速、高效、敏感、经济、平行化、自动化等特点，将成为一项现代化诊断新技术。DNA芯片技术能够大规模地筛选、通用性强，